Спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в курячих яйцях

Реферат: Спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в курячих яйцях, при якому критерієм визначення є виявлена здатність жовтка яєць стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту жовтка яєць курей, яким у складі раціону упродовж 2-х місяців згодовують трансгенну сою. UA 120781 U (12) UA 120781 U UA 120781 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до оцінки курячих яєць, як важливих продуктів у дитячому харчуванні, при використанні генетично модифікованої сої в годівлі курей. На душу населення за рік в Україні використовується в продуктах харчування більше 360 штук курячих яєць. Відомі способи кількісного і якісного визначення сільськогосподарських ГМО культур на основі аналізу нуклеїнових кислот білків, які базуються на виділенні ДНК із використанням сорбенту Silica, детергенту СТАВ, полімеразної ланцюгової реакції ("цепочной реакции - ПЦР") в "реальному часі", ідентифікації ГМО із застосуванням біологічного мікрочипа (ГОСТ 521742003) [4, 6, 7, 10]. Розроблено державні стандарти України і Російської Федерації на визначення ГМ компонентів у продуктах харчування: ГОСТ Р 52173:2003, ГОСТ Р 52174:2003, ДСТУ ISO 21569:2008, ДСТУ ISO 21570:2008, ДСТУ ISO 21571:2008, ДСТУ ISO 224276:2008, ДСТУ CEN/TS 15568:2008, ДСТУ ISO/TS 21586:2008, ДСТУ ISO 24276:2008, ДСТУ 5021.1:2008, ДСТУ ISO 5021.2:2008. Переважна більшість закордонних публікацій висвітлюють вплив генетично модифікованих кормів на фізіологічний стан організму тварин в цілому, а також їх продуктивність за умов згодовування трансгенних кормів, зокрема кукурудзи [16], сої [13, 15], пшениці [14]. Незалежні дослідники повідомляли про нефротоксичний та гепатотоксичений ефекти, які викликає використання ГМ кукурудзи [17]. Ушкодження гістоструктури печінки також було виявлено іншими авторами, які використовували ГМ сою у годівлі щурів [5]. За іншими даними, фрагменти трансгенних генів фуражної кукурудзи (Zein, Sh-2) були виявлені у крові, печінці, селезінці та нирках поросят, яких 35 діб годували кормом з генетично модифікованими інгредієнтами (ГМІ). Крім того, було знайдено фрагмент гену CrylA (b), який є елементом трансгенної конструкції ГМ кукурудзи MON810 [12]. Методи аналітичного контролю харчової продукції, одержаної з генномодифікованих рослин викладені О.М. Чернишовою і О.Ю. Сорокіною [8] та ідентифікація рекомбінантної ДНК в продуктах харчування з гібридних генномодифікованих рослин подані О.Ю. Сорокіною і О.М. Чернишовою [9]. Вибір методів базується на специфічності, чутливості та практичності проведення аналізу. Методи виявлення нового білка, які базуються на імуноферментному аналізі, можуть використовуватись тільки для рослинної сировини. Аналіз ДНК є більш стабільним показником при визначенні ГМО. Для визначення рекомбінантної ДНК у рослинних продуктах харчування використовується метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР), який є більш чутливим порівняно з імуноферментним аналізом [9]. Використання цих методів потребує придбання високовартісного лабораторного обладнання, реактивів і підготовки висококваліфікованих фахівців. Щодо питання впливу ГМО на організм людини, то існують абсолютно протилежні твердження. Так прихильники ГМО вважають, що чужорідні вставки-плазміди повністю розщеплюються в шлунково-кишковому тракті тварин і людини, тому не можуть бути шкідливими. Навіть досліджувати їх дію не варто, тому що це ті ж самі мутації, які відбуваються і в природі, людство такі продукти давно вживає і ніякої негативної дії немає [11]. Протилежне твердження, якого притримуються європейці, це те, що дія ГМО на організм людини ще глибоко не вивчена, тому необхідно заборонити їх використання [18]. Якщо бути прихильником першого твердження то виникає питання, які будуть відхилення від норми в організмі людей через 2-3 покоління? Проводити такі дослідження на людях неприпустимо. На сьогодні недостатньо розкрито механізм негативної дії трансгенної сої на організм тварин і людей. Так, за нашими дослідженнями, трансгенна соя має високу енергію росту і її необхідно відносити умовно до гібридних культур із високою біологічною активністю генетичної основи ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, яка синтезує білкові та низькомолекулярні структури типу плазмід ДНК, не властиві сої. Саме плазміди цих бактерій мають здатність генетично трансформуватися не тільки в рослини, але, як виявилося, і в клітини вищих організмів, зокрема, людини [2]. Водночас, якщо саме кільцеві плазміди Agrobacterium tumefaciens у складі трансгенної сої всмоктуються в шлунково-кишковому тракті курей і можуть міститись у жовтку чи білку яйця, то необхідно відмітити, що їх дія на організм дітей через продукти харчування поки що не визначена. Відомий метод визначення токсичності кормів біопробою на інфузоріях Tetrahymena pyriformis, на який розроблено ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) [1]. Метод базується на екстракції ацетоном із досліджуваної проби токсичних речовин, в основному мікогенного походження, і подальшій дії водних розчинів на інфузорії Tetrahymena pyriformis. Інфузорія - це одноклітинний організм, близький до клітин організму тварин і людини. Живуть у прісних водоймах і живляться бактеріями, в т. ч. Agrobacterium tumefaciens. 1 UA 120781 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в яйцях курей на основі стимулювання життєздатності інфузорій Tetrahymena pyriformis в умовах in vitro при використанні поживного середовища - водного екстракту жовтка і білка яєць курей, яким у складі раціону згодовували трансгенну сою. Попередніми дослідженнями, проведеними нами, встановлено, що трансгенна соя стимулює життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis [3]. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в курячих яйцях критерієм визначення є виявлена здатність жовтка яєць стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту жовтка яєць курей, яким у складі раціону упродовж 2-х місяців згодовують трансгенну сою. Даний спосіб дає можливість досить переконливо та з мінімальними матеріальнотехнічними затратами визначати наявність неідентифікованого фактору трансгенної сої в курячих яйцях і попередити їх використання в першу чергу в продуктах дитячого харчування. Суть корисної моделі пояснюється наступним прикладом. Двом групам кур-несучок по 10 голів у кожній згодовували стандартний раціон. Дослідна група одержувала корми стандартного раціону з домішкою екструдованої трансгенної сої, а контрольна - з додаванням соняшникового шроту. Дослід продовжувався два місяці. Для одержання водного екстракту жовтка і білка яєць курей дослідної і контрольної груп проводили 3 рази відбір яєць по троє з групи. Яйця розбивали і відділяли жовток і білок із перенесенням в термостійкі скляні стакани, а потім додавали по 50 мл дистильованої води на один жовток і білок, після їх ретельно гомогенізували до одержання однорідного водного розчину і нагрівали до кипіння, кип'ятили 30 хвилин. У процесі кип'ятіння відбувалася інактивація біологічно активних речовин із переходом у водний розчин фракції термостійких водорозчинних білків, ліпопротеїдів, фосфоліпідів, низькомолекулярних речовин та кільцевих структур ДНК Agrobacterium tumefaciens із яєць курей дослідної групи. По закінченню кип'ятіння в кожен стакан додавали по 2 мл 9 % оцтової кислоти і перемішували зварені білок і жовток. Після фільтрації способом віджимання крізь нейлонову тканину одержували водний екстракт жовтка і білка, який повторно фільтрували крізь паперовий фільтр. В одержаному екстракті краплями доводили величину рН до 7,2-7,5 10 %-им розчином NaOH. Зберігання маточної культури інфузорії Tetrahymena pyriformis у пептоновому середовищі проводиться відповідно ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Випробування кожного водного екстракту жовтка і білка проводили, беручи по 3 яйця від 3 кожної групи курей. У три флакони від антибіотиків вносили по 1 см водного екстракту жовтка і в три флакони - білок яєць курей дослідної та аналогічно в шість флаконів - контрольної групи, а 3 потім додавали в кожний флакон по 0,1 см 3-х добової культури інфузорії Tetrahymena pyriformis. Після цього контрольні та дослідні флакони залишали за умов кімнатної температури на 5 днів. Оцінку росту і розмноження інфузорій проводили у краплі водного середовища всіх флаконів. Краплю брали пастерівською піпеткою і наносили на предметне скло мікроскопа. Проглядали під мікроскопом (збільшення 7×10) місткість краплі та всіх її шарів. У досліджуваних пробах обчислювали кількість живих і загиблих інфузорій та їх розміри. Дослідження проводили протягом першого-другого, третього-четвертого і п'ятого днів перебування інфузорій у флаконах. У перший-другий день у пробах водного екстракту жовтка 3-х яєць курей дослідної групи спостерігався активний рух інфузорій і дуже активне їх розмноження, а в екстрактах жовтка 3-х яєць контрольної групи був пригнічений рух інфузорій і розмноження не спостерігалося. На 3-4-й день в екстрактах жовтка 3-х яєць курей дослідної і контрольної груп спостерігався активний рух інфузорій і активне їх розмноження. На 4-5-й день у дослідній групі спостерігався активний рух інфузорій і активне розмноження, а в контрольній групі розмноження було припинене, рух інфузорій повільний, одноманітний і було 10 % загиблих інфузорій (табл.). Проведені аналогічні дослідження з екстрактом білка яєць обох груп курей, які показали різницю в розмноженні інфузорій тільки на 4-5-й день їх життєздатності при знаходженні в поживному середовищі екстракту білка. Так, на 4-5-й день інфузорії в живильному середовищі екстракту білка яєць курей дослідної групи мали активний рух і повільне розмноження, тоді як на цьому екстракті у контрольної групи також спостерігався активний рух, але розмноження було відсутнє (табл.). 2 UA 120781 U Таблиця Дослідження життєздатності інфузорій Tetrahymena pyriformis у живильному середовищі водного екстракту жовтка і білка яєць курей, яким згодовували трансгенну сою (дослід) і не генетично модифіковану сою (контроль), три повторення Контрольна група Тривалість екстракт жовтка екстракт білка яєць спостереження яєць курей курей Спостерігається Спостерігається пригнічений рух і активний рух і 1-2-й день розмноження активне відсутнє розмноження Спостерігається Спостерігається активний рух і дуже активний рух і 3-4-й день активне активне розмноження розмноження Спостерігається повільний рух і Спостерігається розмноження активний рух, 4-5-й день відсутнє. 10 % розмноження загиблих відсутнє інфузорій 5 10 15 20 25 30 35 Дослідна група екстракт жовтка екстракт білка яєць яєць курей курей Спостерігається Спостерігається активний рух і дуже дуже активний рух і активне активне розмноження розмноження Спостерігається Спостерігається активний рух і дуже дуже активний рух і активне активне розмноження розмноження Спостерігається активний рух активне розмноження Спостерігається і активний рух, розмноження повільне Враховуючи те, що у водному екстракті жовтка і білка яєць курей контрольної групи були присутні тільки термостійкі водорозчинні білки, ліпопротеїди, фосфоліпіди, мінеральні речовини і деякі низькомолекулярні сполуки, тоді як в екстракті жовтка і білка яєць курей дослідної групи були і низькомолекулярні кільцеві плазміди ДНК ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, є підстава зробити висновок про активний вплив на підвищену життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis кільцевих плазмід ДНК Agrobacterium tumefaciens, які були присутні в жовтку яєць курей дослідної групи. Виходить, що ці сполуки витримують довготривале кип'ятіння і переходять у водний екстракт при кип'ятінні, тому плазміди ДНК Agrobacterium tumefaciens трансгенної сої всмоктуються в шлунково-кишковому тракті курей і трансформуються у фолікули, які продукують жовткову масу. З воронки яйцеводу жовток надходить у найдовший білковий відділ, в якому стінками яйцеводу секретуються альбуміни, з яких формується білок яйця. Джерела інформації: 1. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) Зерно фуражне, продукти його переробки. Комбікорми. Методи визначення токсичності. 2. Ермакова И.В. Что мы едим? Воздействие на человека ГМО и способы защиты / 2-е изд. М.: Амрита, 2011. - 64 с. 3. Заявка на винахід № а201406007 / Спосіб визначення генетично модифікованої сої / Інститут кормів та сільського господарства Поділля НААН / Кулик Я.М., Обертюх Ю.В., Хіміч О.В., Власенко В.В., Семенов С.О. від 02.06.2014 р. 4. Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов / Маддалена Кверчи, Марко Джермини, Ги Ван ден Эде // Практическое руководство. - 2006. 5. Колоусова Н.Г. Патоморфологические изменения в печени крыс при употреблении генномодифицированной сои // Н.Г. Колоусова, Г.И. Губина-Вакулик, Т.А. Иваненко и др. / Актуальні проблеми онкоморфології: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю та 3 конференції Українського дивізіону інтернаціональної академії патології, 12-13 травня 2011 p., Харків, Україна / Харківський нац. мед. університет. - Харків, 2011. - С. 100. 6. Панюшкин А.И. Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК-и иммунодиагностики: автореф. дис. канд. ветеринарных наук. - 2010. - С. 1-8. 7. Ребриков Д.В. ПЦР "В реальном времени" / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с. 3 UA 120781 U 5 10 15 20 25 8. Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н. Идентификация рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах, произведенных из гибридных генно-инженерно-модифицированных растений // Вопросы питания. - 2012. - № 1. - С. 44-48. 9. Чернышева О.К., Сорокина Е.Ю. Методы аналитического контроля пищевой продукции, произведенной из генно-инженерно-модифицированных растений // Вопросы питания. - 2013. № 3. - С. 53-60. 10. Чмиленко Ф.А. Определение ГМО в продуктах питания. Сравнение методик выделения ДНК / Ф.А. Чмиленко, Н.Л. Минаева, Л.Л. Сидорова // Методы и объекты химического анализа. 2011. - т. 6, № 1. 11. healthbase.ru/index.php?newssid=2751. 12. Jeffrey M. S. Genetic Roulette. The documented health risks of genetically engineered foods / Jeffrey M. Smith // Fairfield: Yes Books. - 2007. - 319 p. 13. Magaca-Gymez J.A. Pancreatic response of rats fed genetically modified soybean / MagacaGymez J.A., Lypez Cervantes G., Yepiz-Plascencia G., Calderyn de la Barca A.M. // J Appl Toxicol. 2008. - v. 28. - P. 217-226. 14. Magaca-Gymez J.A. Risk assessment of genetically modified crops for nutrition and health / Magaca-Gymez J.A., Calderyn de la Barca A.M. // Nutrition Reviews. - 2008. - v. 67. - № 1. - P. 1-16. 15. Malatesta M. Reversibility of hepatocyte nuclear modifications in mice fed on genetically modified soybean / Malatesta M., Tiberi C, Baldelli B. et al. // Eur. J. Histochem. - 2005. - v. 49. - P. 237-242. 16. Seralini Gilles-Eric New analysis of a rat feeding study with a genetically modified maize reveals signs of hepatorenal toxicity / Gilles-Eric Seralini, Dominigue Cellier, Joel Spiroux de Vendomois // Aech. Environ. Contam. Toxicol. - 2007. - v. 52. - P. 596-602. 17. Vendomois de G.S. A comparison of the effects of three GM Corn varieties on mammalian health / G.S. de Vendomois, F. Roullier, D. Cellier et al. // Int. J. Biol. Sci. - 2009. - № 5 (7). - P. 706726. 18. wozmoznosti.narod.ru/gmo. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в курячих яйцях, який відрізняється тим, що критерієм визначення є виявлена здатність жовтка яєць стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту жовтка яєць курей, яким у складі раціону упродовж 2-х місяців згодовують трансгенну сою. 35 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4