Спосіб визначення трансгенної сої

Реферат: Визначення трансгенної сої базується на вперше виявленій її здатності стимулювати переважно безстатеве розмноження інфузорій тетрахімена піріформіс при відсутності такого фактора в нетрансгенній сої. Виходить, що використання трансгенної сої як корму в продуктах харчування може стимулювати певні клітини в організмі тварин і людей по типу неконтрольованого розмноження. UA 120778 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ТРАНСГЕННОЇ СОЇ UA 120778 U UA 120778 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до виробництва продуктів харчування з використанням продуктів переробки сої. Адже використання різних сільськогосподарських культур у харчуванні людей є проблемним питанням для багатьох країн світу. Існують стандарти Російської Федерації, ДСТУ України на визначення ГМ компонентів у продуктах харчування: ГОСТ Р 52173:2003, ГОСТ Р 52174:2003, ДСТУ ISO 21569:2008, ДСТУ ISO 21570:2008, ДСТУ ISO 21571:2008, ДСТУ ISO 224276:2008, ДСТУ CEN/TS 15568:2008, ДСТУ ISO/TS 21586:2008, ДСТУ ISO 24276:2008, ДСТУ 5021.1:2008, ДСТУ ISO 5021.2:2008. Відомі способи кількісного і якісного визначення сільськогосподарських ГМО культур на основі аналізу нуклеїнових кислот білків, які базуються на виділенні ДНК із використанням сорбенту Silica, детергенту СТАВ, полімеразно ланцюгової реакції ("цепочной реакции - ПЦР") в "реальному часі", ідентифікації ГМО із застосуванням біологічного мікрочипа (ГОСТ52174-2003) [3, 6-8]. Використання цих методів потребує придбання високовартісного лабораторного обладнання, реактивів і підготовки висококваліфікованих фахівців. Крім того, ГМ компоненти визначають у готових продуктах харчування або напівфабрикатах, а не у рослинній сировині, до якої, в першу чергу, належить соя. Переважна більшість зарубіжних публікацій висвітлюють вплив генетично модифікованих кормів на фізіологічний стан організму тварин в цілому, а також їх продуктивність за умов згодовування трансгенних кормів, зокрема кукурудзи [16], сої [13, 15] пшениці [14]. Незалежні дослідники повідомляли про нефротоксичний та гепатотоксичений ефекти, які викликає використання ГМ кукурудзи [18]. Ушкодження гистоструктури печінки також було виявлено іншими авторами, які використовували ГМ сою у годівлі щурів [4]. За іншими даними, фрагменти трансгенних генів фуражної кукурудзи (Zein, Sh-2) були виявлені у крові, печінці, селезінці та нирках поросят, яких 35 діб годували кормом з генетично модифікованими інгредієнтами (ГМІ). Крім того, було знайдено фрагмент гену Cry1A (b), який є елементом трансгенної конструкції ГМ кукурудзи MON810 [12]. Щодо питання впливу ГМО на організм людини, то існують абсолютно протилежні твердження. Прихильники ГМО вважають, що чужорідні вставки-плазміди повністю розщеплюються в шлунково-кишковому тракті тварин і людини, тому не можуть бути шкідливими. Навіть досліджувати їх дію не варто, тому що це ті ж самі мутації, які відбуваються і в природі, людство такі продукти давно вживає і ніякої негативної дії немає [9]. Протилежне твердження, якого притримуються європейці, це те, що дія ГМО на організм людини ще глибоко не вивчена, тому необхідно заборонити їх використання [19]. Якщо бути прихильником першого твердження то виникає питання, які будуть відхилення від норми в організмі людей через 2-3 покоління? Проводити такі дослідження на людях неприпустимо. Дослідження проведені Хорхе Чеварро з Гарварда показали, що чоловіки, які регулярно споживають соєві продукти, ризикують залишитися безплідними. Вченим було обстежено більше 100 сімейних пар, які звернулися в клініку з приводу лікування безплідності. Аналіз результатів обстежень показав, що сперма чоловіків, які кожного дня споживали соєві продукти в кількості для співставлення з половиною соєвого бургера, містила в середньому всього 65 млн. сперматозоїдів на мілілітр. Це приблизно на 40 % менше, ніж у чоловіків, які не споживають соєвих продуктів. У дослідах на гризунах також було встановлено, що споживання значної кількості соєвих продуктів викликає в самців стерильність. На основі проведених досліджень було зроблено висновок, що соя впливає на чоловічу репродуктивну функцію, яка сильно залежить від гормонального фону організму [10]. Дослідженнями інших авторів також встановлено, що гіпогонадизм і еректильна дисфункція пов'язані зі споживанням соєвих продуктів [17], а соєві добавки змінюють сексуальну поведінку щурів [11]. На сьогодні недостатньо розкрито механізм негативної дії трансгенної сої на організм тварин і людей. Так, за нашими дослідженнями трансгенна соя має високу енергію росту і її необхідно відносити умовно до гібридних культур із високою біологічною активністю генетичної основи ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, яка синтезує білкові та низькомолекулярні структури типу плазмід ДНК не властиві сої. Нашими дослідженнями встановлено, що водна витяжка ГМ сої різко пригнічує в 1,9-2,5 разу лінійний ріст проростків зерна пшениці, тритикале, і жита порівняно з такою ж самою витяжкою не ГМ сої [5]. Саме плазміди цих бактерій мають здатність генетично трансформуватися не тільки в рослини, але, як виявилося, і в клітини вищих організмів, зокрема, людини [2], водночас трансгенна соя може входити до складу хліба, печива, дитячого харчування, маргарину, супів, піци, їжі швидкого приготування, вареної ковбаси, цукерок, морозива, чіпсів, шоколаду, соєвого молока і т. д. 1 UA 120778 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомий метод визначення токсичності кормів біопробою на інфузоріях тетрахімена піріформіс, на який розроблено ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) [1]. Метод основано на екстракції ацетоном із досліджуваної проби токсичних речовин в основному мікогенного походження і подальшій дії водних розчинів на інфузорії тетрахімена піріформіс. Інфузорії - це одноклітинний організм близький до клітин організму тварин і людини. Живуть у прісних водоймах і живляться бактеріями, в т. ч. Agrobacterium tumefaciens. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб визначення трансгенної сої, який за рахунок оцінки і порівняння інтенсивності розмноження і росту інфузорій тетрахімена піріформіс в умовах in vitro, a також реакції на вміст плазмід ДНК у водній витяжці сої, забезпечить визначення саме генетично модифікованої сої. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення трансгенної сої вперше виявлення трансгенної сої відбувається за рахунок фактора стимулювання переважно безстатевого розмноження інфузорій тетрахімена піріформіс у середовищі водної витяжки генетично модифікованої сої. Даний спосіб дає можливість досить переконливо та з мінімальними матеріальнотехнічними затратами визначати наявність генномодифікованої сої і попередити її використання в першу чергу в продуктах дитячого харчування. Суть корисної моделі пояснюється таким прикладом. Для одержання водної витяжки ГМ і не ГМ сої відважували по 50 г бобів обох варіантів і засипали в термостійкі скляні стакани, а потім додавали по 300 мл дистильованої води, нагрівали до кипіння і кип'ятили 30 хвилин. У процесі кип'ятіння відбувалася інактивація уреази, антитрипсину і антихімотрипсину та інших антипоживних біологічно активних речовин із переходом у водний розчин фракції водорозчинних білків, низькомолекулярних речовин із бобів сої не ГМ та плазмід ДНК Agrobacterium tumefaciens із бобів ГМ сої. Після кип'ятіння відвар фільтрували крізь нейлонову тканину і таким чином одержували водну витяжку ГМ і не ГМ сої. Зберігання маточної культури інфузорії тетрахімена піріформіс у пептоновому середовищі проводиться відповідно ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Випробування кожної водної витяжки сої ГМ і не ГМ проводили в 3-разових повтореннях. У 3 три флакони від антибіотиків вносили по 1 см водної витяжки сої ГМ та аналогічно в 3 флакони 3 - не ГМ сої, а потім додавали в кожний флакон по 0,1 см 3-добової культури інфузорії тетрахімена піріформіс. Після цього контрольні та дослідні флакони залишали за умов кімнатної температури на 3 дні. Оцінку росту і розмноження інфузорій проводили у краплі водного середовища всіх флаконів. Краплю брали пастерівською піпеткою і наносили на предметне скло мікроскопа. Проглядали під мікроскопом (збільшення 7×10) місткість краплі та всіх її шарів. У досліджуваних пробах обчислювали кількість живих і загиблих інфузорій та їх розміри. Дослідження проводили протягом першого, другого, і третього дня перебування інфузорій у флаконах. У перший день у пробах водної витяжки сої не ГМ загальний стан інфузорій був стабільний і спостерігалось їх розмноження. У пробах водної витяжки ГМ сої була активна фаза розмноження, яка на 50-60 % була активніша за кількістю інфузорій відносно не ГМ сої. На другий день у контрольних пробах (водна витяжка сої не ГМ) розмноження не відбувалось, спостерігалися повільні рухи інфузорій, загиблих було в межах 40 %, а в дослідних пробах (водна витяжка сої ГМ) продовжувалося їх розмноження, але не в такій активній формі. Загиблих інфузорій було до 20 %. На третій день у контрольних пробах було 70 % загиблих інфузорій, а в дослідних до 30 %. Паралельно проводили визначення розмірів інфузорій при їх розмноженні в обох варіантах витяжок. Встановлено, що інфузорії у водній витяжці не ГМ сої мали розміри до 0,3 мм, а у витяжці ГМ сої були значно меншими за розмірами. Відомо, що інфузорії розмножуються безстатевим шляхом - поперечним поділом клітини або пупкуванням, і періодично в їх життєвому циклі відбувається статевий процес - кон'югація, а також автогамія. На основі інтенсивності розмноження інфузорій у середовищі водної витяжки ГМ сої та їх меншого розміру тіла порівняно із водною витяжкою не ГМ сої можна зробити висновок про наявність безстатевого циклу розмноження інфузорій у середовищі водної витяжки ГМ сої. Проте необхідно зазначити, що інфузорії при безстатевому розмноженні втрачають здатність до статевого розмноження. Враховуючи те, що у водних витяжках бобів сої обох варіантів були присутні тільки водорозчинні білки і низькомолекулярні сполуки за виключенням у витяжці ГМ сої і низькомолекулярні плазміди ДНК ґрунтової бактерії є підстава зробити висновок про активний вплив на процес розмноження інфузорій тетрахімена піріформіс плазмідів ДНК Agrobacterium tumefaciens. Виходить, що ці сполуки витримують довготривале кип'ятіння і переходять у 2 UA 120778 U водний розчин, тому вони, тобто плазміди, можуть всмоктуватися в шлунково-кишковому тракті тварин і людей і стимулювати певні клітини по типу неконтрольованого розмноження. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Джерела інформації, взяті до уваги при описі винаходу: 1. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) Зерно фуражне, продукти його переробки. Комбікорми. Методи визначення токсичності. 2. Ермакова И. В. Что мы едим? Воздействие на человека ГМО и способы защиты / 2-е изд. - М.: Амрита, 2011. - 64 с. 3. Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов / Маддалена Кверчи, Марко Джермини, Ги Ван ден Эде // Практическое руководство. - 2006. 4. Колоусова Н. Г. Патоморфологические изменения в печени крыс при употреблении генномодифицированной сои // Н. Г. Колоусова, Г. И. Губина-Вакулик, Т. А. Иваненко и др. / Актуальні проблеми онкоморфології: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю та з конференції Українського дивізіону інтернаціональної академії патології, 12-13 травня 2011 p., Харків, Україна / Харківський нац. мед. університет. - Харків, 2011. - С. 100. 5. Кулик М. Ф. та ін. Пригнічення росту проростків зерна пшениці, тритикале і жита під впливом водної витяжки раундапостійкої ГМ сої порівняно з не ГМ соєю / Кулик М. Ф., Корнійчук О. В., Бугайов В. Д., Обертюх Ю. В., Хіміч О. В., Лілик Т. В., Кулик Я. М. // Вісник аграрної науки.2013. - № 6. - С. 21-24. 6. Панюшкин А. И. Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК-и иммунодиагностики: автореф. дис. канд. ветеринарных наук. - 2010. - С. 1-8. 7. Ребриков Д. В. ПЦР "В реальном времени" / Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов и др. под ред. д.б.н. Д. В. Ребрикова - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с. 8. Чмиленко Ф. А. Определение ГМО в продуктах питания. Сравнение методик выделения ДНК / Ф. А. Чмиленко, Н. Л. Минаева, Л. Л. Сидорова // Методы и объекты химического анализа. - 2011. - т. 6, № 1. 9. healthbase.ru/index.php?newssid=2751. 10. http://persona.rin.ru/news/142936/f/soja-vyzyvaet-muzhskuju-impotenciju. 11. http://www.newscientist.com/article/dn4385-soy-supplements-cut-sexual-behavior-inrats.html#.U6w2JZR_veA. 12. Jeffrey M. S. Genetic Roulette. The documented health risks of genetically engineered foods / Jeffrey M. Smith // Fairfield: Yes Books. - 2007. - 319 p. 13. Magaca-Gymez J. A. Pancreatic response of rats fed genetically modified soybean / MagacaGymez J. A., Lypez Cervantes G., Yepiz-Plascencia G., Calderyn de la Barca A. M. // J Appl Toxicol. 2008. - v. 28. - P. 217-226. 14. Magaca-Gymez J. A. Risk assessment of genetically modified crops for nutrition and health / Magaca-Gymez J. A., Calderyn de la Barca A. M. // Nutrition Reviews. - 2008. - v. 67. - № 1. - P. 1-16. 15. Malatesta M. Reversibility of hepatocyte nuclear modifications in mice fed on genetically modified soybean / Malatesta M., Tiberi C., Baldelli B. et al. // Eur. J. Histochem. - 2005. - v. 49. - P. 237-242. 16. Seralini Gilles-Eric New analysis of a rat feeding study with a genetically modified maize reveals signs of hepatorenal toxicity / Gilles-Eric Seralini, Dominigue Cellier, Joel Spiroux de Vendomois // Aech. Environ. Contam. Toxicol. - 2007. - v. 52. - P. 596-602. 17. Siepmann T., Roofeh J., Kiefer F. W., Edelson D. G. Hypogonadism and erectile dysfunction associated with soy product consumption // Nutrition., 2011, 27, 859-862. 18. Vendomois de G. S. A comparison of the effects of three GM Corn varieties on mammalian health / G. S. de Vendomois, F. Roullier, D. Cellier et al. // Int. J. Biol. Sci. - 2009. - № 5 (7). - P. 706726. 19. wozmoznosti.narod.ru/gmo. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб визначення трансгенної сої, в якому вперше виявлення трансгенної сої відбувається за рахунок фактора стимулювання переважно безстатевого розмноження інфузорій тетрахімена піріформіс у поживному середовищі водної витяжки генетично модифікованої сої, порівняно з водною витяжкою не генетично модифікованої сої. 3 UA 120778 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4