Спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в організмі лабораторних тварин

Реферат: Визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої базується на вперше виявленій здатності м'язової і кісткової тканини стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів, які в складі раціону споживали трансгенну сою протягом 2-х місяців порівняно з водними екстрактами м'язової і кісткової тканини таких же тварин, яким не згодовували трансгенну сою. UA 120780 U про видачу патенту: UA 120780 U UA 120780 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до оцінки соєвих продуктів харчування з використанням при їх виробництві генетично модифікованої сої. Існують стандарти Російської Федерації, ДСТУ України на визначення ГМ компонентів у продуктах харчування: ГОСТ Р 52173:2003, ГОСТ Р 52174:2003, ДСТУ ISO 21569:2008, ДСТУ ISO 21570:2008, ДСТУ ISO 21571:2008, ДСТУ ISO 224276:2008, ДСТУ CEN/TS 15568:2008, ДСТУ ISO/TS 21586:2008, ДСТУ ISO 24276:2008, ДСТУ 5021.1:2008, ДСТУ ISO 5021.2:2008. Відомі способи кількісного і якісного визначення сільськогосподарських ГМО культур на основі аналізу нуклеїнових кислот білків, які базуються на виділенні ДНК із використанням сорбенту Silica, детергенту СТАВ, полімеразно ланцюгової реакції ("цепочной реакции - ПНР") в "реальному часі", ідентифікації ГМО із застосуванням біологічного мікрочипа (ГОСТ 52174-2003) [3, 5-7]. Використання цих методів потребує придбання високовартісного лабораторного обладнання, реактивів і підготовки висококваліфікованих фахівців. Переважна більшість зарубіжних публікацій, висвітлюють вплив генетично модифікованих кормів на фізіологічний стан організму тварин в цілому, а також їх продуктивність за умов згодовування трансгенних кормів, зокрема кукурудзи [13], сої [10, 12] пшениці [11]. Незалежні дослідники повідомляли про нефротоксичний та гепатотоксичний ефекти, які викликає використання ГМ кукурудзи [14]. Ушкодження гістоструктури печінки також було виявлено іншими авторами, які використовували ГМ сою у годівлі щурів [4]. За іншими даними, фрагменти трансгенних генів фуражної кукурудзи (Zein, Sh-2) були виявлені у крові, печінці, селезінці та нирках поросят, яких 35 діб годували кормом з генетично модифікованими інгредієнтами (ГМІ). Крім того, було знайдено фрагмент гену Cry1A (b), який є елементом трансгенної конструкції ГМ кукурудзи MON810 [9]. Щодо питання впливу ГМО на організм людини, то існують абсолютно протилежні твердження. Так прихильники ГМО вважають, що чужорідні вставки-плазміди повністю розщеплюються в шлунково-кишковому тракті тварин і людини, тому не можуть бути шкідливими. Навіть досліджувати їх дію не варто, тому що це ті ж самі мутації, які відбуваються і в природі, людство такі продукти давно вживає і ніякої негативної дії немає [8]. Протилежне твердження, якого притримуються європейці, це те, що дія ГМО на організм людини ще глибоко не вивчена, тому необхідно заборонити їх використання [15]. Якщо бути прихильником першого твердження то виникає питання, які будуть відхилення від норми в організмі людей через 2-3 покоління? Проводити такі дослідження на людях неприпустимо. На сьогодні недостатньо розкрито механізм негативної дії трансгенної сої на організм тварин і людей. Так, за нашими дослідженнями трансгенна соя має високу енергію росту і її необхідно відносити умовно до гібридних культур із високою біологічною активністю генетичної основи ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, яка синтезує білкові та низькомолекулярні структури типу плазмід ДНК не властиві сої. Саме плазміди цих бактерій мають здатність генетично трансформуватися не тільки в рослини, але, як виявилося, і в клітини вищих організмів, зокрема, людини [2], водночас трансгенна соя може входити до складу хліба, печива, дитячого харчування, маргарину, супів, піци, їжі швидкого приготування, вареної ковбаси, цукерок, морозива, чіпсів, шоколаду, соєвого молока і т. д. Відомий метод визначення токсичності кормів біопробою на інфузоріях Tetrahymena pyriformis, на який розроблено ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) [1]. Метод засновано на екстракції ацетоном із досліджуваної проби токсичних речовин в основному мікогенного походження і подальшій дії водних розчинів на інфузорії Tetrahymena pyriformis. Інфузорії - це одноклітинний організм близький до клітин організму тварин і людини. Живуть у прісних водоймах і живляться бактеріями, в т. ч. Agrobacterium tumefaciens. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в організмі лабораторних тварин на основі стимулювання життєздатності інфузорій Tetrahymena pyriformis в умовах in vitro при використанні поживного середовища - водного екстракту м'язової і кісткової тканини лабораторних тварин, яким у складі раціону згодовували трансгенну сою. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в організмі лабораторних тварин критерієм визначення є вперше виявлена здатність м'язової і кісткової тканини стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів, які у складі раціону протягом 2-х місяців споживали трансгенну сою. Даний спосіб дає можливість досить переконливо та з мінімальними матеріальнотехнічними затратами визначати наявність неідентифікованого фактора трансгенної сої в 1 UA 120780 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 організмі лабораторних тварин і попередити її використання в першу чергу в продуктах дитячого харчування. Суть корисної моделі пояснюється наступним прикладом. Двом групам білих щурів по 10 голів у кожній згодовували стандартний раціон віварію. Дослідна група одержувала перлову кашу з домішкою прожареної трансгенної сої, а контрольна з додаванням соняшникової макухи. Дослід продовжувався два місяці. Для одержання водного екстракту м'язової і кісткової тканини дослідних і контрольних щурів проводили їх забій по 3 голови з кожної групи і тушки, тобто, м'язову і кісткову тканину мілко подрібнювали і поміщали в термостійкі скляні стакани, а потім додавали по 200 мл дистильованої води, нагрівали до кипіння і кип'ятили 30 хвилин. У процесі кип'ятіння відбувалася інактивація біологічно активних речовин із переходом у водний розчин фракції водорозчинних білків, низькомолекулярних речовин із м'язової і кісткової тканини щурів контрольної групи і можливо плазмід ДНК Agrobacterium tumefaciens із тканини тварин дослідної групи. Після кип'ятіння відвар фільтрували крізь нейлонову тканину і таким чином одержували водний екстракт м'язової і кісткової тканини щурів дослідної і контрольної групи. Зберігання маточної культури інфузорії Tetrahymena pyriformis у пептоновому середовищі проводиться відповідно ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Випробування кожного водного екстракту м'язової і кісткової тканини проводили від 3-х 3 щурів. У три флакони від антибіотиків вносили по 1 см водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів дослідної та аналогічно в 3 флакони - контрольної групи, а потім додавали в 3 кожний флакон по 0,1 см 3-х добової культури інфузорії Tetrahymena pyriformis. Після цього контрольні та дослідні флакони залишали за умов кімнатної температури на 3 дні. Оцінку росту і розмноження інфузорій проводили у краплі водного середовища всіх флаконів. Краплю брали пастерівською піпеткою і наносили на предметне скло мікроскопу. Проглядали під мікроскопом (збільшення 7×10) місткість краплі та всіх її шарів. У досліджуваних пробах обчислювали кількість живих і загиблих інфузорій та їх розміри. Дослідження проводили протягом першого, другого, і третього дня перебування інфузорій у флаконах. У перший день у пробах водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів контрольної групи стан інфузорій був стабільний і спостерігалось їх активне розмноження і активний рух. У пробах водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів дослідної групи також було активне розмноження і активний рух. На другий день у контрольних пробах спостерігалось повільне розмноження і повільна рухливість інфузорій, а в дослідних пробах спостерігалось розмноження і активна рухливість інфузорій. На третій день у контрольних пробах було 20-30 % загиблих інфузорій, а в дослідних загиблих інфузорій не було. Враховуючи те, що у водному екстракті м'язової і кісткової тканини щурів контрольної групи були присутні тільки водорозчинні білки, жири, мінеральні речовини і деякі низькомолекулярні сполуки, тоді як в екстракті м'язової і кісткової тканини тварин дослідної групи можливо були і низькомолекулярні плазміди ДНК ґрунтової бактерії, є підстава зробити заключення про активний вплив на підвищену життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis плазмідів ДНК Agrobacterium tumefaciens, які є присутні в організмі щурів дослідної групи. Виходить, що ці сполуки витримують довготривале кип'ятіння і переходять у водний екстракт при кип'ятінні, тому вони, тобто, плазміди можуть всмоктуватися в шлунково-кишковому тракті тварин і людей і стимулювати життєздатність певних клітин в організмі при споживанні ними трансгенної сої. Джерела інформації: 1. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97) Зерно фуражне, продукти його переробки. Комбікорми. Методи визначення токсичності. 2. Ермакова И.В. Что мы едим? Воздействие на человека ГМО и способы защиты / 2-е изд. М.: Амрита, 2011. - 64 с. 3. Кверчи М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов / Маддалена Кверчи, Марко Джермини, Ги Ван ден Эде // Практическое руководство. - 2006. 4. Колоусова Н.Г. Патоморфологические изменения в печени крыс при употреблении генномодифицированной сои // Н.Г. Колоусова, Г.И. Губина-Вакулик, Т.А. Иваненко и др. / Актуальні проблеми онкоморфології: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю та з конференції Українського дивізіону інтернаціональної академії патології, 12-13 травня 2011 p., Харків, Україна / Харківський нац. мед. університет. - Харків, 2011. - С. 100. 5. Панюшкин А.И. Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК-и иммунодиагностики: автореф. дис. канд. ветеринарных наук. - 2010. - С. 1-8. 2 UA 120780 U 5 10 15 20 25 30 6. Ребрыков Д.В. ПЦР "В реальном времени" / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с. 7. Чмиленко Ф.А. Определение ГМО в продуктах питания. Сравнение методик выделения ДНК / Ф.А. Чмиленко, Н.Л. Минаева, Л.Л. Сидорова // Методы и объекты химического анализа. 2011. - т. 6, № 1. 8. healthbase.ru/index.php?newssid=2751. 9. Jeffrey M. S. Genetic Roulette. The documented health risks of genetically engineered foods / Jeffrey M. Smith // Fairfield: Yes Books. - 2007. - 319 p. 10. Magaca-Gymez J. A. Pancreatic response of rats fed genetically modified soybean / MagacaGymez J. A., Lypez Cervantes G., Yepiz-Plascencia G., Calderyn de la Barca A. M. // J Appl Toxicol. 2008. - v. 28. - P. 217-226. 11. Magaca-Gymez J. A. Risk assessment of genetically modified crops for nutrition and health / Magaca-Gymez J. A., Calderyn de la Barca A. M. // Nutrition Reviews. - 2008. - v. 67. - № 1, - P. 1-16. 12. Malatesta M. Reversibility of hepatocyte nuclear modifications in mice fed on genetically modified soybean / Malatesta M., Tiberi C, Baldelli B. et al. // Eur. J. Histochem. - 2005. - v. 49. - P. 237-242. 13. Seralini Gilles-Eric New analysis of a rat feeding study with a genetically modified maize reveals signs of hepatorenal toxicity / Gilles-Eric Seralini, Dominigue Cellier, Joel Spiroux de Vendomois // Aech. Environ. Contam. Toxicol. - 2007. - v. 52. - P. 596-602. 14. Vendomois de G. S. A comparison of the effects of three GM Corn varieties on mammalian health / G. S. de Vendomois, F. Roullier, D. Cellier et al. // Int. J. Biol. Sci. - 2009. - № 5 (7). - P. 706726. 15. wozmoznosti.narod.ru/gmo. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення наявності неідентифікованого фактора трансгенної сої в організмі лабораторних тварин, в якому критерієм визначення є вперше виявлена здатність м'язової і кісткової тканини стимулювати життєздатність інфузорій Tetrahymena pyriformis у поживному середовищі водного екстракту м'язової і кісткової тканини щурів, які в складі раціону протягом 2-х місяців споживали трансгенну сою. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3