Спосіб визначення розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми в злоякісних епітеліальних пухлинах

Реферат: Спосіб визначення розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми в злоякісних епітеліальних пухлинах шляхом проведення фотоцифрової морфометрії мікропрепаратів з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J, підрахунку і аналізу кількості точокпікселів цифрового зображення, визначення середньої величини і довірчого інтервалу оптичної щільності цих точок, сегментації зображення на чорні та білі пікселі і визначення відсоткової частки тканини, яка вивчається в процесі дослідження, що отримується в результаті ділення числа пікселів, які містяться на вибраному фрагменті зображення, на загальне число пікселів в цьому зображенні, причому мікропрепарати гістохімічно забарвлюють за методом Масона, аналізують у медичній програмі обробки цифрових зображень Image J з використанням вбудованого плагіну Colour Deconvolution цієї програми і за допомогою схеми аналізу забарвлення "Masson Trichrome" в автоматичному режимі сегментують цифрові зображення і визначають відсоткову частку розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми. UA 121531 U (12) UA 121531 U UA 121531 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медицини, а саме патоморфології, гістохімії та онкоморфології, і може бути використаною у гістопатологічній діагностиці для кількісної інтерпретації результатів гістохімічного дослідження і більш детального вивчення інтенсивності десмоплазії і фіброзу строми у біопсійному і операційному матеріалі пацієнтів, хворих на злоякісні епітеліальні пухлини різних локалізацій. Існує багато способів оцінки результатів гістохімічного дослідження десмопластичних та фіброзних змін у стромі пухлин епітеліального ґенезу, але часто вони базуються на суб'єктивному оцінювані результатів при мікроскопії і не дають можливості точного порівняння цих даних з подальшою градацією ступеня десмопластичної реакції в різних локусах пухлини, які можуть бути отримані лише при кількісному аналізі. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб фотоцифрової морфометрії імуногістохімічних препаратів, який полягає у використанні медичної програми обробки цифрових зображень Image J для аналізу імуногістохімічно забарвлених гістологічних препаратів, запропонований В.О. Туманським та інш. [Патент України на корисну модель № 99314 Україна, МПК (2015) GO IN 21/00, G06K 9/00. Спосіб фотоцифрової морфометрії імуногістохімічних препаратів / В.О.Туманський, А.В.Євсєєв, І.С.Коваленко, М.Д.Зубко; заявник та патентовласник Запорізький держ. мед. ун-т. - №и 2014 14 103; заявл. 29.12.2014; опубл. 25.05.15 // Бюлетень. - №10.]. Спосіб полягає у такому: 1. Імуногістохімічно забарвлені гістологічні зрізи фотографують в мікроскопі цифровою фотокамерою. 2. З використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J у плагіну Colour Deconvolution за допомогою вбудованої схеми аналізу забарвлення "гематоксилін+DAB" у цифрових зображеннях визначають середню величину і довірчий інтервал оптичної щільності DAB забарвлення. 3. За стандартною шкалою яскравості рівень експресії маркерів кількісно градуюють за Katayama A. et al. (2004) в умовних балах (від 0 - білий до 255 - чорний) і розбивають на 4 категорії: негативна реакція - 0-20 балів; слабкий рівень експресії - 21-50 балів; помірний рівень - 51-100 балів; високий рівень експресії - більше 100 балів. 4. Для морфометричного вимірювання відносної площі, яку займають імунопозитивні структури, у відфільтрованій DAB частині встановлюється "поріг чутливості" для подальшої сегментації зображення, яка передбачає розділення всіх точок зображення на два типи - чорні і білі. 5. Обчислюють співвідношення числа пікселів цифрового зображення імунопозитивної реакції (чорних) до загального числа пікселів в зображенні, визначеному в %. Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: - проведення фотоцифрової морфометрії мікропрепаратів з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J, - підрахунок і аналіз кількості точок-пікселів цифрового зображення, - визначення середньої величини і довірчого інтервалу оптичної щільності цих точок, - сегментація зображення на чорні та білі пікселі, - визначення відсоткової частки тканини, яка вивчається в процесі дослідження, що отримується в результаті ділення числа пікселів, які містяться на вибраному фрагменті зображення, на загальне число пікселів в цьому зображенні. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що у запропонованому авторами способі використовується імуногістохімічне маркування гістологічних препаратів з використанням високоафінних первинних антитіл до окремих антигенів тканини, але це не дозволяє комплексно оцінити наявність десмоплазіїі фіброзу строми, а лише візуалізувати окремі її компоненти, потребує значної кількості часу, наявності спеціального лабораторного обладнання і реактивів та вимагає значних фінансових витрат. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу визначення розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми в злоякісних епітеліальних пухлинах шляхом використання гістохімічної методики забарвлення зразків біопсійного матеріалу за Масоном, використанням іншого автоматичного програмного виділення необхідних гістохімічнозабарвлених структур, що забезпечить підвищення ефективності оцінювання гістохімічного дослідження десмопластичних та фіброзних змін у стромі пухлин епітеліального ґенезу, зменшить загальний час, необхідний на проведення фотоцифрової морфометрії цих препаратів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає проведення фотоцифрової морфометрії мікропрепаратів з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J, підрахунок і аналіз кількості точок-пікселів цифрового зображення, 1 UA 121531 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначення середньої величини і довірчого інтервалу оптичної щільності цих точок, сегментацію зображення на чорні та білі пікселі і визначення відсоткової частки тканини, яка вивчається в процесі дослідження, що отримується в результаті ділення числа пікселів, які містяться на вибраному фрагменті зображення, на загальне число пікселів в цьому зображенні, новим є те, що мікропрепарати гістохімічно забарвлюють за методом Масона, аналізують у медичній програмі обробки цифрових зображень Image J з використанням вбудованого плагіну Colour Deconvolution цієї програми і за допомогою схеми аналізу забарвлення "Masson Trichrome" в автоматичному режимі сегментують цифрові зображення і визначають відсоткову частку розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Спосіб визначення відносної площі ділянок десмоплазії і фіброзу строми у цифрових зображеннях гістологічних зрізів, забарвлених за Масоном, за допомогою схеми аналізу забарвлення "Masson Trichrome" є більш об'єктивним морфометричним методом дослідження за рахунок комплексного оцінювання всіх фібрилярних структур і компонентів строми з десмопластичними і фіброзними змінами, ніж метод визначення об'ємної частки однорідних окремих антиген-позитивних структур, забарвлених імуногістохімічним методом у цифрових зображеннях гістологічних зрізів, завдяки використанню гістохімічного методу, що дає можливість комплексно оцінити наявність і склад всіх фібрилярних компонентів з десмопластичною реакцією та фіброзом строми в епітеліальних пухлинах, з наступним точним визначенням площі їх експресії. Порівняно зі способом оцінки рівнів експресії при імуногістохімічному дослідженні, при якому проводиться оцінювання окремих імунопозитивних структур та клітин, що експресують певний антиген, даний спосіб дозволяє комплексно оцінити площу, розповсюдженість та інтенсивність десмопластичних та фібротичних змін строми у стандартизованому полі зору мікроскопа. Використання автоматичного режиму сегментації цифрового зображення дозволяє уникнути суб'єктивного фактора при проведенні морфометричного дослідження, і водночас прискорює процес отримання результату. Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних характеристик дозволить підвищити точність сумарного визначення фіброзних ділянок і зон десмопластичної реакції строми та достовірність результатів морфометричного дослідження, прискорити процес обчислення морфометричних параметрів і отримання кінцевого результату, знизити кількість помилок, пов'язаних із суб'єктивністю сприйняття дослідника, розробити чіткі морфометричні критерії оцінювання результатів гістохімічного дослідження та знизити вартість досліджень. Спосіб здійснюють таким чином. Гістохімічно забарвлені за Масоном гістологічні зрізи фотографують в мікроскопі цифровою фотокамерою і аналізують з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J. У плагіну Colour Deconvolution цієї програми використовують вбудовану схему аналізу забарвлення "Masson Trichrome" і визначають середню величину і довірчий інтервал оптичної щільності ділянок десмоплазіїі фіброзу строми, забарвлених за методом Масона. Для морфометричного вимірювання відносної площі, яку займають гістохімічно забарвлені структури, у відфільтрованій частині встановлюється "поріг чутливості" для подальшої сегментації зображення, яка передбачає розділення всіх точок зображення на два типи - чорні і білі, з наступним обчисленням співвідношення числа пікселів цифрового зображення гістохімічно забарвлених (чорних) до загального числа пікселів в зображенні, визначеному в %, що дорівнює значенню відсоткової частки розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми в окремому локусі пухлини. Пропонована корисна модель ілюструється фотографіями, де на Фіг. 1 зображено початковий знімок гістохімічного препарату, на Фіг. 2 - результат застосування схеми аналізу "MassonTrichrome" (відфільтрована частина), на Фіг. 3 - кінцевий результат обчислення гістограми. Приклад. Хворому П. 1968 р.н., 27.01.2017 була виконана лобектомія правої легені, при гістологічному дослідженні якої встановлено діагноз "плоскоклітинний рак легенів". Для кількісної оцінки десмопластичних змін у стромі пухлини гістохімічно забарвлені зрізи тканини легені фотографували цифровою фотокамерою "Olympus" (Японія) в Мікроскопі Ахіоріап 2 ("CarlZeiss", Німеччина) при збільшенні х200 і аналізували з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J. У плагіні Соlour Deconvolution програми використовували вбудовану схему аналізу забарвлення "MassonTrichrome" (Фіг. 1) з подальшим встановленням "порогу чутливості" і сегментацією зображення (Фіг. 2). Визначали відносну площу, яку займають відфільтровані ділянки. 2 UA 121531 U 5 У запропонованому зображенні чорних, відповідних імунопозитивним ділянкам, пікселів було 1 056 327, білих було 9 021 369. Всього зображення було складено з 10 077 696 пікселів (Фіг. 3). Розрахунок відносної площі імунопозитивних ділянок проводили обчисленням частки від ділення числа "чорних" пікселів на загальне число пікселів в зображенні -1 056 327/10 077 696*100 % = 10,48 %. В даному випадку відносна площа, яку займали ділянки з десмопластичною реакцією строми пухлини, склала 10,48 %, а 82,52 % припадає на пухлинну тканину. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб визначення розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми в злоякісних епітеліальних пухлинах шляхом проведення фотоцифрової морфометрії мікропрепаратів з використанням медичної програми обробки цифрових зображень Image J, підрахунку і аналізу кількості точокпікселів цифрового зображення, визначення середньої величини і довірчого інтервалу оптичної щільності цих точок, сегментації зображення на чорні та білі пікселі і визначення відсоткової частки тканини, яка вивчається в процесі дослідження, що отримується в результаті ділення числа пікселів, які містяться на вибраному фрагменті зображення, на загальне число пікселів в цьому зображенні, який відрізняється тим, що мікропрепарати гістохімічно забарвлюють за методом Масона, аналізують у медичній програмі обробки цифрових зображень Image J з використанням вбудованого плагіну Colour Deconvolution цієї програми і за допомогою схеми аналізу забарвлення "Masson Trichrome" в автоматичному режимі сегментують цифрові зображення і визначають відсоткову частку розповсюдженості десмоплазії і фіброзу строми. 3 UA 121531 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4