Консорціум штамів бактерій аzотовактеr vіnеlаndіі mg та arthrobakter sр p для очистки стічних вод від етиленгліколю та діетаноламіну

Консорциум штаммов бактерий Azotobacter vinelandil Mg ВКПМ B-4213 и Arthrobacter sp, P. ВКПМ -959. используемый для очистки сточных вод от этиленгликоля и диэтаноламина. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области биологической очистки промышленных сточных вод, и может быть использовано на предприятиях газовой промышленности, преимущественно на заводах по переработке сероводородсодержащего природного газа. Согласно известному способу биологической очистки с помощью микроорганизмов p.Arthrobacter, очищают сточные воды, содержащие 2000 мг/дм этиленгликоля [1], Степень очистки при этом составляет 92,5%, продолжительность времени очистки 48 ч. Смесь микроорганизмов p.Pseudomonas и p.Bacillus в оптимальном соотношении со сточной водой(1:8000-30000) в непрерывном режиме культивирования утилизирует диэтаноламин (1000 мг/дм3) на 89-92,5% [2]. Известны способы биологической очистки сточных вод от диэтаноламина с помощью микроорганизмов родов Pseudomonas и Bacillus и от згиленгликоля с использованием бактерии p. Arthrobacicr пригодны для очистки вод, содержащих монозагрязнитель, соответственно, диэтанс ламин или этиленгликоль. При наличии в воде обоих загрязнителей степень очистки предложенными микроогранизмами существенно снижается, время очистки увеличивается. Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ очистки сточных вод от этиленгликоля микроорганизмами p.Arthrobacter, предусматривающий дополнительное внесение микроорганизмов p.Pseudomonas и соокислителя диэтаноламина. При этом необходимо придерживаться следующего соотношения загрязнителей в воде-ДЭА и ЭГ=1:(4-5)[3]. Микроорганизмы вносят в среду, обеспечивая плотность посева 108-Ш9 кл/мл, при соотношении культур, соответствующем соотношению загрязнителей, т.е. если ДЭА:ЭГ=1:(4-5), то Pseudomonas:ArthrobacTer= 1:5. Применение сообщества микроорганизмов из p. Ps-eudomonas и p.Arthrobacter эфФективно в строго ограниченном диапазоне содержания загрязнителей, а именно при соотношении ДЭА:ЭГ=1:(4-5). те. при конценп рации ЭГ-2000 и ДЭА-350-550 мг/л. За С> со со СО О 13373 пределами указанного соотношения стеКонцентрацию ЭГ в среде определяют пень очистки воды используемыми микроорфотоколориметрическим способо?^ {с реакганизмами снижается; следовательно тивом Шиффа), ДЭА - методом газожидкостприменение этого сообщества микроорганой хроматографии. низмов при очистке сточной воды с содержа- 5 Выделенные штаммы бактерий депонинием загрязнителей, выходящим е рованы во Всесоюзной коллекции промышуказанные пределы, невозможно. ленных микроорганизмов, где им присвоены Задачей изобретения является полученомера ВКПМ В-4213 для Azotobacter ние консорциума штаммов бактерий, облаvinelandil Мди ВКПМ S-959 для Arthrobacter дающего более высокой деструктивної"! 10 sp. P. активностью по отношению к этиленгликоКонсорциум штаммов бактерий, взятых лю и диэтаноламину, и использование его п в количестве, % микробной очистке промышленных сточных Azotobacter vinelandil Mg 3-97 вод, соотношение загрязнителей о которых Artbrobacter sp. P. 3-97 не регламентировано. 15 использует смесь этиленгликоля и диэтаноДля решения поставленной задачи ламина в качестве единственного источника предложен консорциум штаммов бактерий углерода при их концентрации о сточной йоAzotobacter vinelandil Mg и Arthrobacter sp. де 2-5 г/дм3 каждого. P., обеспечивающий глубокую (на 99,0%) Характеристика штамма Azotobacter очистку сточных вод от ЭГ и ДЭА в концент- 20 vinelandil Mg/ВКПМ В-4213. рации 500-2000 мг/л каждого загрязнителя; Морфолого-культуральные признаки. При этом соотношение загрязнителей в воде Клетки, окрашенные фуксином, метиленоможет быть в достаточно широком диапазовой синью или по Граму, имеют палочковидне (0,1-4,9-4.9-0,1), а степень очистки соную форму с обрубленными тупыми ставляет 99,3-99.6%. 25 концами, размером 0,6-0,8x1,7 мкм, иногда Штаммы бактерий-деструкторов выдепочти кубики (кокки) с плохо окрашиваемым лены из накопительной культуры, полученцентром. Грамотрицательные. 16-часовая ной методом проточного культивирования культура неподвижна. Подвижна в очень моактивного ила очистных сооружений газопелодом возрасте {4 ч) - перитрих. Эндоспор рерабатывающего завода и болтушки из по- 30 нет. Образует толстостенные цисты. Кап-( чвы, длительное время контактировавшей с сульная форма. В препарате с тушью - клетэтими ксенобиотиками в среде, содержащей ки крупные, овальные, размещаются чаще постепенно возрастающие концентрации парами. субстратов. Рост на МПА: круглые с ровным краем, Выделение консорциума штаммов - де- 35 выпуклые, гладкие колонии, по консистенструкторов ЭГ и ДЭА осуществляют на плотции однородные, непрозрачные, белые, ценой синтетической среде, содержащей в ликом колония легко снимается с г/дм3 дистиллированной воды: К2НРО4 x поверхности агара, иногда образует слизихЗН2О - 0,4; КН2РО4 - 0,3; NH4CI - 0,15; NaCI стые тяжи при отделении части колонии. 0.05; MgSO4 '7Н2О - 0,1; СаСОз - 0,02; 40 В МПБ образует гомогенную муть. При FeSOi - следы, ЭГ или ДЭА - 1,-, рН 8,0. Для взбалтывании жидкой среды видны более этого из проточного культиватора, в котором плотные, опалесцирующие тяжи. при подаче среды, содержащей 2.G г/дм ЭГ Физиолого-биохимические признаки. и ДЭА в соотношении 1:1, со скоростью разШтамм оксидазо- и каталазоположительбавления 0,09 ч"1 идет очистка до следовых 45 ный. На обычных средах и на среде с сахаконцентраций загрязнителей, отбирают нарозой образует внеклеточную слизь. копительную культуру и после предвари- Способен фиксировать молекулярный азот (6 тельного разведения высевают на пассажей на 2% глюкозной агаре Dlfco). Штамм синтетические среды приведенного состава. синтезирует водорастворимый Температура культивирования 30°С. Вырос- 50 пигмент, дающий в УФ-лучах зеленую флуошие отдельные колонии деструкторов мноресценцию. Оптимум температуры выращигократно (6-7 раз) пересевают на плотной вания - 30-32°С. Растет при 25 и 41°С. синтетической среде, изучают деструктивОбразует NNs и уреазу. Протеолитическими ную активность, проверяют чистоту выдесвойствами не обладает, Глюкозу в среде ленных штаммов и идентифицируют, 55 Хью-Лейфсона не ферментирует. Активный Штаммы хранят на плотной синтетичеденитрификатор. ской среде или на МПА под слоем вазелиноНе растет в МПБ в присутствии NaCI, вого масла; пересевают 1-2 раза в год, даже 2% NaCI ингибирует рост штамма. можно хранить также а пиофильно высушенИспользует широкий набор углеводов ном состоянии. (12) и спиртов (7). Среди них манмит и рам 13373 нозу. Крахмал не гидролизует. Реакция на желток положительна, В периодических условиях выращивания разрушает 2 г/дм ЭГ в синтетической среде следующего состава, г/дм3: К2НРО4 x 5 ХЗН2О-ОАКН2РО4-0.3; NH4CI-0,15; NaCI 0,05; MgSO4 * 7Н2О - 0,1; СаСОз - 0,02; FeSO4 - следы, рН 7,0-8,0. В условиях проточного культивирования утилизирует ЭГ в концентрации 2-4% или 10 2-4% смесь ЭГ и ДЭА в соотношении 4:1 соответственно, со скоростью разбавления 0,04 ч"1. Непатогенен. Характеристика штамма Arthrobacter sp. P. BKnMS-959. 15 Морфолого-культуральные признаки. Плеоморфные палочковидные клетки, превращающиеся в старой культуре в кокковидные. Молодые, активно растущие клетки образуют характерные сочетания в виде ики- 20 тайских букв". Часть палочек располагается под углом друг к другу, образуя У-образные фигуры. В 5-7-суточной культуре встречаются крупные кокковидные клетки, превышающ ие размер остал ьн ых в 2-3 раза. 25 Неподвижны. Во всех циклах развития окрашиваются по Граму положительно. В МПА 1-суточные культуры имеют колонии круглые, непрозрачные, матовые, гладкие, слегка отдающие желтизной. По мере 30 старения культуры край у колонии становится фестончатым, колония приобретает ярко желтую окраску, становится складчатой с выпуклым гладким центром. На МПА с 7% глицерина штамм образует нитевидные клет- 35 (си, которые по мере старения культуры меняют форму клеток, превращаясь в кокки. В МПБ штамм образует гомогенную взвесь клеток. Физиолого-биохимические признаки. 40 Штамм каталазо- и оксидазоположителен. Неподвижен. Оптимальная температура выращивания 28-30°С. Обладает слабой уреаз ной акт ив нос ть ю. П ри окисл е нии глюкозы, инозита, манноэы, раффинозы, 45 ксилозы образует кислоту. Строгий аэроб. Конечным акцептором электронов служит кислород. Нитраты не восстанавливает, лакмусовую синь не обес цвечивает. 50 Не вызывает гидролиз крахмала, не разлагает казеин, не разжижает желатин. При усвоении глицина, ацетата, Z-орнитина, цитрата, а-кетоглутаровой кислоты образует щелочь. Валин не использует. Растет 55 на тиамине без подщелачивания. Разрушает в условиях периодического 3 культивирования 1 г/дм ДЭА в синтетической среде следующего состава, г/дм 3 : 6 К2НРО4 * ЗН2О - 0,4; КН2РО4 - 0,3; Nad 0,05; NH4CI - 0,15;: MgSO4 • 7Н2О - 0,1: СаСОз - 0.02; FeSO* - следы, рН 7,0-8,0. В условиях непрерывного культивирования утилизирует ДЭА в концентрациях 2-4% или усваивает его из 2-4% смеси ЭГ и ДЭА в соотношении 4:1, соответственно, со скоростью разбавления 0.05 ч' . Штамм непэтогенен. П р и м е р 1. Изучали деструктивные свойства культур при периодическом выращивании в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 100 мл синтетической среды. Минеральный фон сред состоял, г/дм 3: К2НРО4 - 0,4; КН2РО4 - 0,3; NH^CI 0,15; NaCI-0,05; MgSO4 • 7Н2О-0.1: СаСОз0,02; FeSO4 - следы. рН 8.0. Органической составной являлся этиленгликоль в концентрации 2 г/дм3 или диэтаноламин - 1 г/дм 3, рН сред устанавливали после внесения органических веществ. В опытах использовали 16-20 часовые кул ьту ры Az ot ob act e r v l nel an dl i Mg и Arthrobacter sp. P., предварительно выращенные на агаризованных средах приведенного состава. Жидкие среды засевали соответствующими деструкторами из расчета 10?кл/см . Культивирование осуществляли при температуре 28°С на качалке (130 об/мин). Периодически через 6-12 ч проводили анализ на содержание в среде ксенобиотика. Через 20 ч выращивания Arthrobacter sp. P. усваивал на 98% ДЭА из среды, содержащей 1 г/дм ксенобиотика. Az.vlnelandll Mg утилизирует на 99% ЭГ из среды, содержащей 2 г/дм загрязнителя. Внесение в среду выращивания ксенобиотика, по отношению к которому микроорганизм загрязнителя в 1,5-2 раза и несколько снижает (на 3-8%) степень очистки. Однако уровень очистки от основного ксенобиотика остается достаточно высоким: 90,5% от ДЭА и 96.0% от ЭГ. По истечении периода выращивания микроорганизмов установлено, что параллельно с усвоением основного ксенобиотика идет утилизация дополнительно внесенного соединения. Однако степень усвоения, например ЭГ деструктором ДЭА - Arthrobacter sp. Р. низкая - 21,5%. Всего на 15,5% утилизируется ДЭА деструктором ЭГ Azotobacter vlnelandll Mg. Деструктивные свойства консорциума, содержащего разное количество Azotobacter vlnelancitl Mg и Arthrobacter sp. P. изучали в периодических условиях выращивания на среде, содержащей одновременно ЭГ и ДЭА в концентрации 1 г/дм3 каждого. Самая глубокая степень усвоения обоих ксенобиоти 13373 гов (тзбл 1) отмечается при использовании консорциума, состоящего на 50% из A7otobacter vlnelandit Mg и на 50% из Arthrobacter sp. P. Предложенный консорциум отличается от известного прежде всего тем, что в качестве деструктора ЭГ используется Azotobacter vlnelandit Mg, который по активности разрушения ксенобиотика превосходит микроорганизмы р Arthrobacter, используемые в прототипе. В качестве второго микроорганизма заявляемого консорциума используется Arthrobacter sp. P. Этот микроорганизм работает по другому назначению, чем в известном способе: в заявляемом консорциуме он выступает в качестве деструктора ДЭА, а в известном способе микроорганизмы p.Arthrobacter являются деструкторами ЭГ. Степень утилизации ДЭА заявляемым Arthrobacter sp. P. также превышает таковую микроорганизмами p.Pseudomonas рассматриваемую в прототипе. П р и м е р 2. Исследования по использованию консорциума для очистки модельных сточных вод от ЭГ и ДЭА в условиях непрерывного культивирования проводили в установке емкостью 1 дм, содержащей 300 мл синтетической среды. Установка снабжена эрлифтной системой аэрации для перемешивания и обеспечения среды кислородом. В среду выращивания вносили смесь микроорганизмов - деструкторов ЭГ и ДЭА в разных соотношениях с исходной плотностью бактериального засева 10 ил/см . Затем с помощью перистальтического насоса НГММ подавали в систему среду, содержащую ЭГ и ДЭА в разных концентрациях, со скоростью разбавления 0,04 ч"1. После стабильной работы установки в течение 2-х суток (при постоянном Д. d и рИ) на определенном составе модельной сточной воды определяли остаточную концентрацию ксенобиотиков на выходе из установки. 8 Установлено, что соотношение культур к консорциуме, который обеспечивает высокую степень очистки сточной воды, зависит от состава поступающей на очистку воды 5 (табл.2). Если очистке подвергается вода, в которой есть дополнительный источник азота в аммонийной форме, то соотношение деструкторов в консорциуме пропорционально процентному содержанию загрязни10 телей. Например, при содержании в очищаемой воде 80% ЭГ и 20% ДЭА 9798%-ную очистку обеспечивает консорциум, состоящий на 80% из Azotobacter vlnelandll Mg и на 20% из Arthrobacter sp. P. (табл.2, 15 пример 4). Если же в качестве источника азота выступает сам загрязнитель - диэтиламин, то для обеспечения высокой степени очистки необходимо использовать консорциум, в кото20 ром 70-80% клеток составляют деструкторы ДЭА - Arthrobacter sp. P. и 30-70% - деструктор ЭГ - Azotobacter vtnelandlt Mg (табл. 2, примеры 6-8). Для разрушения ДЭА (даже если он составляет всего 1/5 часть 25 общих загрязнений в воде) требуется в 2-2.5 раза большая исходная биомасса деструктора - Arthrobacter sp. P., чем биомасса второго микроорганизма - Azotobacter vinelandll Mg. Еще более четко эта зависимость прояв30 ляется, если в воде преобладает ДЭА. Следует особо подчеркнуть, что правильно выбранное соотношение культур в консорциуме существенно сокращает период вывода очистного сооружения в опти35 мальный режим работы Таким образом, предложенный консорциум позволяет очистить сточную воду газоперерабатывающих предприятий, содержащую в качестве загрязнителей ЭГ и ДЭА. Консор40 циум обладает стабильностью сосуществования бактериальных штаммов-деструкторов, устойчивым ростом и более высокой скоростью разрушения ксенобиотиков. 45 ~ Таблица 1 Штамм микроорганизмов Соотношение штаммов, % Степень утилизации ксенобиотика, разрушения % ЭГ Az. vlnelandlt Mg Arthrobacter «p.p. Az. vlnetandll Mg Arthrobacter sp.P. 20 60 50 50 ДЭА 88,5 99,0 24 98,6 97,5 20 13373 10 Продолжение табл. 1 Штамм микроорга Соотношение низмов штаммов, % Степень утилизации ксенобиотика, Время разрушения % ДЭА эг . Az. vlnelandll Mg Arthrobactersp.P. 99.2 80 24 56,5 20 Таблица 2 Концентрация субстра Дополни Соотношение культур Степень очистки сточ та. мг/дм3 тельный консорциума,% ной воды, % п/п ЭГ ДЭА источник Az.vln.Mg. Arthr.sp. эг ДЭА 10 90 36.9 100 30 70 73.5 100 50 50 88,2 97,2 80 20 99,2 97.2 10 30 90 70 78,5 98.9 100 99,1 азота 1 2 2000 2000 500 NH4 500 _ _ _____ н 3 2000 500 4 2000 500 5 6 2000 2000 500 500 7 2000 500 50 50 98.9 97,0 8 2000 500 70 30 " 98,7 89,0 9 2000 500 90 10 99.1 71,0 10 500 10 90 11 500 2000 2000 20 80 99,0 99,2 99,0 97.8 12 500 2000 30 70 99.6 90,0 13 500 2000 50 50 99,7 59,7 Упорядник Замовлення 4112 Техред М.Моргентал Коректор Л. Лукач Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655. ГСП. КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101