Спосіб відвернення стресорної реакції організму

Предлагаемое изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине и животноводстве для предотвращения реакций в организме, вызванных воздействием стресс-факторов различного рода, а также при проведении экспериментальных исследований. Известен способ профилактики стрессорной реакции при операционной травме [Авт.св. №1666113, А 61 К 31/195], включающий 3-разовое введение витаминного препарата до операции, в качестве которого используют пантотенат кальция. Способ позволяет повысить эффективность профилактики стрессорной реакции, снизить летательность. Недостатком известного способа является необходимость 3-кратного введения препарата, а также возможность только его планового использования до известного воздействия. Известен способ профилактики транспортного стресса у крупного рогатого скота [авт.св. №1634280, А 61 К33/00]- прототип, включающий введение животным с кормом электролитной композиции, содержащей хлористый натрий, хлористый калий и карбонат магния. Дополнительно в композицию вводят сернокислый натрий, углекислый натрий, карбонат кальция при следующем соотношении компонентов, мас.%: хлористый натрий - 54-56, хлористый калий - 16-23, серно-кислый натрий - 9-13,4, углекислый натрий - 0,5-0,9, карбонат кальция -10-14,4, карбонат магния - 1,2-1,6. Электролитную композицию вводят в рацион питания в течение 67 дней перед транспортировкой животных в дозе 50-110 г/гол в сутки. Способ позволяет снизить потери живой массы за транспортировку на 1,6-2,4%. Недостатком известного способа является использование многокомпонентной системы. необходимость многократного введения препарата, а также возможность только планового использования до известного воздействия. Задачей авторов является уменьшение реакций организма, вызванных воздействием стресс-факторов различного рода и упрощение способа Поставленная задача достигается тем, что в качестве антистрессорного препарата используют альфа-1ингибитор протеиназа-1-ИП)или его аналоги, который вводят непосредственно после прекращения влияния стрессорного фактора и судят об эффективности воздействия этого препарата по уровняю протеиназ и a-1ИП в крови. Выбор a-1-ИП в качестве антистрессорного препарата обусловлен во-первых тем. что на начальной стадии развития стресс-синдрома характерной чертой являются мобилизация и неравномерное распределение энергетических и структурных ресурсов организма (1). При этом в разрушении белковых структур тканей важную роль играют протеолитические ферменты. Регуляторная функция протеиназ включает два типа реакций катаболизма: полное расщепление белков до аминокислот и органиченчый протеолиз (2. 3, 4, 5). Последний имеет важное значение в образовании активных форм ферментов и гормонов из неактивных предшественников и позволяет достичь быстрого генерализованного ответа на внешние воздействия. Особая роль принадлежит трипсину, который способен расщеплять пептидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот (6,7). Около 90% трипсин-ингибиторной активности сыворотки крови приходится на долю альфа-1-ингибитора протеиназ. Во-вторых, использование ингибиторов протеолиза. таких как ингитрил, трасилол, контрикал, препаратов естественного происхождения, способствует сохранению клеточных популяций, предупреждает разрушение митохондрий, сохраняет гранулы гликогена, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум при шоке (8, 9). При этом может наблюдаться большой прилив нейтрофилов. в органы-мишени (9), большая внутриклеточная аккумуляция мутантного a-1-ИП, что. в свою очередь, является фактором стимуляции синтеза белков теплового шока, активации стрессового ответа (10). Введение указанных ингибиторов. протеолиза в качестве антистрессорных препаратов непосредственно после воздействия стрессорного фактора может предотвращать изменения системы протеиназа a-1-ИП. Кроме того, имеются данные повышения активности протеолитических ферментов при остром эмоциональном стрессе у кроликов (1). Достоверное увеличение активности трипсина и содержания альфа-2макроглобулина было обнаружено через 3 часа после тяжелой механической травмы, уровень a-1-ИП при этом был существенно ниже исходного (11). В экспериментах на крысах Vistar в ходе иммобилизационного стресса показано повышение активности трипсина и снижение a-1-ΤΠ в сыворотке крови пропорционально длительности стресса (12). Эти данные свидетельствуют об усилении реакций ограниченного протеолиза вследствие нарушения динамического равновесия между активностью трипсина и его ингибиторов. Аналогичные данные получены в результате криовоздействия (6 С) (2). Предполагают, что при этом происходит разрушение ингибиторов протеолиза. Основываясь на концепциях Frankenhaeiser (13), заключающихся в следующем: 1 - эмоциональное воздействие, или приятное, или неприятное, является причиной адреномедуллярного ответа; 2 -адреналин несет большую ответственность за психологическое воздействие, чем норадреналин, уровень которого увеличивается только при сильном психическом стрессе; норадреналин более ответственен за физический стресс такого вида как упражнения и холодовое воздействие; 3-дистресс связан с гипофизарноадренокортикальной активацией, тогда как усилейие - с секрецией катехоламинов, - можно прийти к заключению обязательного участия системы протеиназа-a-1-ИП в развитии реакций организма после воздействия стресс-факторов различного рода. Эффективность воздействия выбранного препарата подтверждается исследованием крови. Активность протеиназ и a-1-ИП должны при этом соответствовать норме. По заявляемому способу проведены исследования активности протеиназ и a-1-ИП при холодовом стрессе у крыс на базе института молекулярной биологии и генетики АН Украины, г.Киев. Отличительные признаки предложенного решения соответствуют критерию "новизна" и требованиями изобретательского уровня. Использование предлагаемого способа позволит уменьшить реакцию организма, вызванную воздействием стресс-факторов различного рода, упростить режим введения антистрессорного.препарата. На фиг. 1-5 представлены результаты экспериментальных исследований активности протеиназ и a-1-ИП в сыворотке крови, цитозоле тканей легких, сердца, печени и почек, соответственно. Левая шкала отражает активность протеиназ в мкг/мл, правая шкала –активность a-1-ИП в мкг/мл остаточного трипсина. Позиции 1,3,5, 7,9 фиг. 1-5 показывают активность протеиназ в контроле, через 2 часа после начала воздействия холода, с последующим введением физиологического раствора, трасилола и при возвращении нормальные температурные условия. Позиции 2, 4, 6, 8, 10 фиг.1-5 -активность α-1-ΤΠ, соответственно. Позиции 11,13,15 фиг.1-5 отражают результаты изменения активности протеиназ, а поз.12, 14, 16 уровень a-1-ИП через 1 неделю после начала воздействия холода, последующего влияния введения трасилола, возвращения в нормальные температурные условия, соответственно. Заявляемый способ осуществляют следующим образом. 1. Непосредственно после воздействия стрессорного фактора (холод), вводят ингибитор протеолиза, аналог a-1-ИП, например трасилол в количестве 0,15 мл/100 г веса для крыс Вистар внутримышечно. 2. Определяют в крови содержание протеиназ и a-1-ИП по известной методике, например, разработанной автором ранее (А.с. 1655991, G 01 N 33/48, С 12 О 1/38). 3. Судят об эффективности предотвращения стрессорной реакции по содержанию протеиназ и a-1-ИП, которые должны соответствовать норме, через 30 мин после инъекции ингибитора. Πример 1. Предотвращение стрессорной реакции после 2-часового воздействия холода у крыс. Крыс Vlstar 2-3-месячного возраста подвергали воздействию холода (4-6°С) в течение 2-х часов. Контрольную группу животных содержали при комнатной температуре. С целью восстановления системы протеиназа-a-1-ИП непосредственно после холодового воздействия животным вводили трасилол внутримышечно в левую заднюю лапку в дозе 0,15 мл/100 г веса тела. Контролем инъекции служило внутримышечное введение физиологического раствора в той же дозе. Другую группу животных после холодового стресса возвращали в нормальные температурные условия на 1 час. Затем крыс декапитировали. Кровь собирали в центрифужные пробирки. Печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором 5-10 мин 100 мг ткани гомогенизировали в 1 мл 0,2 Μ Na-фосфатного буфера рН 7,2 при 4°С. Промытые охлажденным физиологическим раствором ткани легкого, сердца, почек, 50-100 мг, измельчали ножницами и затем гомогенизировали в 1 мл физиологического раствора. Образцы крови и полученные гомогенаты центрифугировали в течение 10 мин, 10000 об/мин на центрифуге типа К-24 при 4°С. В надосадочной жидкости определяли активность протеиназ и a-1-ИП. Полученные результаты были обработаны математически согласно методу Стьюдента. После применения корректирующего воздействия было обнаружено подавление протеолиза на фоне увеличения активности a-1-ИП во всех исследуемых субстанциях. Достоверные изменения уровня a-1-ИП после введения трасилола отмечали при исследовании сыворотки крови (фиг.1, поз.8) и цитозоля миокарда (фиг.3, поз.8). Заключение: Введение трасилолапосле непродолжительного мягкого холодового воздействия (+4-6°С в течение 2-х часов) является эффективным средством защиты ткани миокарда от влияния протеиназ. Πример 2. Предотвращение стрессорной реакции после 1-недельного воздействия холода у крыс. Крыс Vlstar 2-3-месячного возраста подвергали воздействию холода (4-6°С) в течение 1-й недели. После холодового воздействия животным вводили трасилол внутримышечно в левую заднюю лапку в дозе 0,15 мл/100 г веса тела. Другую группу животных после холодового стресса возвращали в нормальные температурные условия на 1 сутки. Затем крыс декапитировали и производили операции аналогично описанным выше. Активация протеолиза, наблюдаемая нами в тканях через 1 неделю после начала воздействия холода, происходит в ответ на повышение a-1-ИП в исследуемых жидкостях. При этом уровень протеиназ не превышает контрольный, а в цитозоле миокарда находится даже на более низком уровне, что отвечает данным снижения скорости синтеза белка при адаптации к холодовому фактору (14,15). Введение трасилолаа в данном случае не приводит к дальнейшему повышению уровня a-1-ИП, а наоборот снижает его, приближая к норме. Активность протеиназ повышается во всех исследуемых жидкостях, превышая контрольный уровень в цитозоле ткани легкого. Последнее указывает на необходимость большой дозы трасилола для нормализации про-теиназного уровня легочной ткани. Возвращение в нормальные температурные условия на 1 сутки после 1-недельного непрерывного воздействия холода не приводит к существенным изменениям уровня протеиназ. Активность протеиназ миокарда здесь находится на уровне ниже контрольного значения, а активность ингибитора в цитозоле тканей легкого, почек, сыворотки крови - выше контрольного. Повышенное содержание a-1-ИП при возвращении в нормальные температурные условия и через 1 сутки может свидетельствовать, что данного времени недостаточно для полной нормализации состояния, вызванного продолжительным влиянием холода. Активация протеолиза, приближаясь к норме течения процесса в исследуемых жидкостях, несколько отлично происходит в печени, где на фоне достоверно более высокого содержания a-1-ИП активность протеиназ остается на уровне ниже контрольного значения. Возможно, введение трасилола в данной дозе способствует как активации протеолиза, так и синтезу и высвобождению собственного ингибитора. Заключение: Введение трасилола в качестве антистрессорного препарата, предложенное по заявляемому способу, является эффективным способом коррекции протеиназно-антипротеиназной системы в случае длительного холодового воздействия (1 неделя). В таблице показаны преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом, Литература: 1. Тарасенко Л.М. и др. Активность протеиназ и a-1-антитрипсина в тканях при эмоциональном стрессе у кроликов.//Физиолог, журнал.- 1992, т.38. №1. С.115-117. 2. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - Киев: Здоровья, 1988. С.198, 3. Нагорная В.Ф. Овуляция и протеоли-тические ферменты.//Акушерство и гинекология.-1990, №4. С.1317. 4. Bolmer S. and Kleinerman J. Calactosamine-lndused a-1-antitrypsln deficiency in rats. // Am. J.Pathol. - 1987.126, N2.-P.209-219. 5. Patston P.A. et al. Reactivity of a-\-antitrypsln mutants against proteolytic enzymes of ihe kallikrein-kinin, complement and fibrinolytic systems. // J. Biol. Chem. -1990.-265, N 18. - P. 10786-10791. 6. Веремеенко К.Н. Ингибиторы протеолиза - защитные белки крови.// Врачебное дело., 1987, №5. - С.4548. 7. Barrett J.D. and Eggena P. Effects of trypsin on the measurement of inactive renln in rat plasma by radioimmunoassay; decrease in Inactive renin following nephtectomy. // Jornal of hypertension.- 1988,- 6, N 1,- P.4955. 8. Проценко В.Α., Шпак СИ. Протекторное свойство ингибиторов ферментов протеолиза в клеточных системах при шоке. // Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. - М., 1989, Т.2.-С.781. 9. Частная пульмонология. - М.: Медицина. -1990. С.196. 10. Perlmutter D.H. and Pierce J.A. The α-1-antitrypsin gene and emphysema.//Amer. J. Physiol. - 1989.- 257, N 4.- P.147-162. 11. Марченко В.П., Гудумак B.C., Нигуляну В,И, Коррекция нарушений трипсин-антитрипсиновой системы и содержания среднемолекулярных пептидов (СМП) в крови при тяжелой механической травме. // Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. - М., 1989, т.2. - С.755. 12. Меерсон Ф.З., Сауля А И., Шудумак B.C. Роль потери сиаловой кислоты миокардом в депрессии сократительной функции сердечной мышцы при стрессе. //Вопр. мед. химии. - 1985, т.31, вып.2. -С.118-120. 13. Kagetal В. and Goldstein D.S. Catecholamines and their metabolites. //J. of chromotography. - 1988. - v.429. - P.177-233. 14. Котляров А.О. Индукция белков і теплового шока в бактериях E.coli после низкотемпературного воздействия. //Хо-лодовый анабиоз. - Киев: Наукова думка, 1991.-С.З-8. 15. Кузнецова Г.А., Морозов И.С. Влия-І ние актопротекторов на процессы синтеза белка при остром охлаждении и адаптации к холодовому фактору. //Нарушение механизмов регуляции и их коррекция., - М., 1989, т.2.-С.673.