Спосіб одержання кристалічного ліз в28 про в29 інсуліну людини (варіанти)

1. Способ получения кристаллического ЛизВ2вПровгя-инсулина человека, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что включает: кристаллизацию Лизв?8Провг9-инсулина человека из раствора, содержащего Лиз вг8 Про вгэ -инсулин человека, цинк, по меньшей мере 0,3 N органическую кислоту, выбранную из группы: уксусная кислота» лимонная кислота или глицин, и фенольное соединение при рН от 5,5 до 6,5, 2. Способ по п. ^ о т л и ч а ю щ и й с я тем, что концентрация Лиз в г в Про в г э -инсулина человека состав Изобретение относится к мономерному аналогу инсулина человека, а именно к способу получения кристаллического аналога инсулина. Этот способ используется вгв В2Я в очистке и производстве Лиз Про -инв?8 в29 супина человека. Лиз Про -инсулина человека применяется для лечения диабета. Со времен открытия инсулина в 1920 гг. не прекращаются попытки усовершенствоаания лечения диабета. Большой прогресс ляет от 1,8 до 2,5 г/л; фенольным соединением является фенол и концентрация цинка составляет от 40 мг/л, Лиз в г 8 Про в 2 9 инсулина человека до 400 мг/г ЛизВ28Провг9-инсулина человека. 3. Способ по п. 2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что концентрация фенола составляет от 0,15 до 0,25% от основно го объема. 4. Способ по п. 3, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что рН составляет от 5,9 до 6,2. 5. Способ получения кристаллического Лиз а28 Лро В29 -инсулина человека, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что включает* добавление фенола в количестве от 0,15 до 0,25% от общего объема к раствору ЛизВ2ВПроВ29-инсулина человека концентрации от 1,8 до 2,5 г/л в 1N уксусной кислоте, доведение рН до значений от 5,9 до 6,2 гидроксидом аммония и добавление раствора соли цинка до конечной концентрации от 40 до 400 мг цинка на грамм В2В В29 Лиз Про -инсулина. ' был достигнут в способах очистки и доступности инсулина. Были разработаны также различные препараты разного срока действия. Несмотря на эти улучшения, терапия с помощью подкожных инъекций все еще не обеспечивает пациенту должной регуляции и контроля уровня сахара в крови. В течение жизни пациента частые отклонения от нормальных уровней сахара в ы О 26638 крови приводят к гипер- или гипогликемическим состояниям и осложнениям, включающим ретинопатию, нефропатию, нее- * ропатию и микро-,макроангиопатию. Чтобы избежать крайних уровней гли- 5 кемии, диабетики зачастую практикуют множественные инъекции, когда инсулин вводится во время каждого приема пищи. Эга терапия, однако, далеко еще не оптимизирована. 10 Самый быстродействующий коммерческий инсулин слишком поздно достигает пика после инъекции, а действие его продолжается чересчур долго, что не позволяет эффективно контролировать уров- 15 ни глюкозы. В недавнем времени были предприняты серьезные попытки создания препаратов инсулина и его аналогов, которые ускоряют процесс всасывания препарата при подкожном введении. 20 Поскольку все коммерческие фармацевтические препараты инсулина содержат инсулин в самосвязанном состоянии и, в основном, в форме цинк-гексамера, считают, что фактором, ограничивающим 25 скорость всасывания инсулина с места подкожной инъекции, является диссоциация самосвязанного инсулинового гексамерч. Чтобы ускорить процесс всасывания, были разработаны мономерные ана- 30 логи инсулина. Эти мономерные аналоги обладают более быстрым по сравнению с инсулином проявлением активности, в то же время сохраняя биологическую активность на- 35 тивного инсулина человека. Они обеспечивают быстрое всасывание с места инъекции и достигают пика своего действия близко по времени к повышению уровня глюкозы в крови, связанному с приемом 40 пищи. В настоящем изобретении предложен новый способ приготовления кристаллов одного из таких мономерных аналогов, ЛизЕ?аПро529-инсулина человека (ЛизВ20Проэ2?- 45 чИ). ЛизВ2вПроВ29-чИ раскрывается в публикации ЕРО № 383472. Однако эта публикация не раскрывает коммерчески доступного способа приготовления кристаллического Лиз В28 Про 329 -чИ. 50 Кристаллизация инсулина хорошо известна специалистам. Первые открытия датируются 1926 годом, когда Абель получил кристаллический инсулин а изозлектрической точке из раствора с буфером в 55 виде бруцина, пиридина и ацетата аммония (Abel J.J. Proc. Nat!. Acad. Sci. U.S. 12; 132, (1926). Peterson и др. в патенте США 2920104 описывает кристаллы инсулина, препараты и способы их приготовления. В наши дни производственный процесс кристаллизации инсулина человека включает доведение основности раствора инсулина, содержащего 0,25 Н уксусную кислоту, около 2 г/л инсулина и 2% цинка, до рН 5,9-6,0 с помощью основания, предпочтительно, гидроксида аммония (Jehr Brange, Galenics of Insulin, SpringerVerlag (1987). Важно, что, когда Лиз 828 Про вг9 -чИ помещают в условия, которые позволяют инсулину человека образовать цинк-кристаллы, такой кристаллизации не наблюдается. Настоящим изобретением предложен способ кристаллизации Лиз вг8 Про В29 -чИ, при котором инсулин человека не кристаллизуется. Этот способ обеспечивает получение высококачественных цинк-кристаллов при высоком выходе. Эти кристаллы представляют стабильную твердую форму вещества. Кристаллические твердые вещества особенно удобны в практике, поскольку их легко характеризовать, очищать, они более элегантны с фармацевтической точки зрения, чем аморфные твердые вещества. Помимо этого, этот процесс удобен для производства. Настоящее изобретение обеспечивает способ получения крисіаллического /і изВ2ВПроЕгз-инсулин а человека, включающий: кристаллизацию Лиз вг8 Про вгэ -инсулина человека из раствора, содержащего ЛизВ2аПроВ29-инсулин человека, цинк, по меньшей мере 0,3 Н органическую кислоту, выбранную из группы: уксусная кислота, лимонная кислота и глицин, и фенол при рН около 5,5-6,5. Как указывалось выше, настоящее изобретение обеспечивает способ получения кристаллического инсулина человека Лиз в г е Про в г 9 . Термин "Лиз вгв Про В2Э -инсулина человека" или "Лиз в г 9 Про в г э -чИ я представляет быстродействующий аналог инсулина, который меньше склонен к димеризации или самоассоциации. ЯизВ28ПроВ29-чИ является инсулином челоэека, в котором пролин в положении В28 В-цепи замещен на лизин, а лизин в положении 829 В-цепи замещен на пролин, как описано а публикации ЕРО Нз 383472, включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Все аббревиатуры аминокислот, используемые в настоящем описании, представляют собой сокращения, принятые патентным ведомством США и приведенные в 37 C.F.R. §1. 822 (в) [2]. Термин "фенол" или "производные фенола" означает собирательное обозначь 26638 ниє фенола, м-крезола, резорцинола, метил-п-гедроксибензоата или их смесей. Термин "кристаллизация" относится к образованию кристаллов Лиз В28 Про В29 -инсулина человека. Термин "физиологически приемлемое основание" хорошо известен специалистам. Физиологически приемлемые основания включают гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония. Предпочтительно применять гидроксид аммония. Кристаллообразование инсулина интенсивно изучалось. В промышленном производстве инсулин человека кристаллизуется в присутствии 0,25Н уксусной кислоты, 1,6-2,1 г/л инсулина и 2% цинка при рН 5,95-6,05. Кристаллизация происходит при приближении к точке кристаллизации с кислой стороны путем прибавления основания, обычно, гидроксида натрия. Неожиданно оказалось, что растворимый Лиз В28 Про В29 -чИ не кристаллизуется при обычных условиях кристаллизации инсулина. Самоассоциация и аггрегация у Лиз В23 Лро В29 -чИ сведена к минимуму. Тот факт, что Лиз в г в Про в г 9 -чИ не аггрегирует, был впервые отмечен Brems и др., Protein Engineering, £ 6 , 527-533 (1992). Считают, что минимальная самоассоциация и аггрегация, которая вызывает мономерность аналога, является причиной отсутствия кристаллизации Лиз вм Про В29 -чИ при условиях, разработанных для инсулина. Настоящее изобретение описывает условия, при которых ЛизВ28ПроВ2Э-чИ кристаллизуется с цинком и фенольным соединением и образует стабильное твердое кристаллическое вещество. Предпочтительные фенолы выбирают из группы, состоящей из фенола, резорцинола и их смесей. Как цинк, так и фенол являются существенными факторами для достижения кристаллизации. Раствор Лизв2вПроВ29-чИ приготавливают путем растворения аналога инсулина в водном растворителе. Концентрация Лиз вг8 Про е29 -чИ составляет приблизительно от 1,8 до 2,5 г/л. Предпочтительная концентрация аналога около 2 г/л. Растворению может способствовать так называемое кислотное растворение, т.е. рН снижают приблизительно до 3,0-3,5 с помощью физиологически переносимой кислоты, предпочтительно, хлористоводородной. Другие физиологически приемлемые кислоты включают уксусную кислоту, лимонную кислоту и фосфорную кислоту. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Концентрация органической кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной, лимонной кислот или глицерина, составляет по крайней мере 0,ЗН; при более низкой концентрации получается з большой степени аморфный продукт. Предпочтительно, Лиз 028 Про В29 -чИ растворяют в 0.8-1.2Н растворе уксусной кислоты; более предпочтительно - в 1Н растворе уксусной кислоты. Концентрация добавляемого цинка такова, что конечная концентрация составляет приблизительно от 40 до 400 мг на грамм аналога. Предпочтительно добавлять цинк в виде соли. Примерами солей цинка могут служить ацетат цинка, бромид цинка; хлорид цинка, фторид цинка, йодид цинка и сульфат цинка. Опытному специалисту известно, что существует множество других солей цинка, которые также можно использовать в способе настоящего изобретения. Предпочтительно использовать ацетат цинка или хлорид цинка, поскольку эти соли не добавляют новых химических ионов к промышленно разработанным способам. Оптимальная концентрация цинка для кристаллизации составляет приблизительно от 100 до 300 мг на грамм Лиз в28 Про В29 -чИ. Условия кристаллизации чувствительны к присутствию фенола, основания и концентрации цинка; поэтому специалист, выполняющий процесс кристаллизации, подберет оптимальные параметры, упомянутые выше, для получения хорошо оформленных кристаллов. Оптимальные условия для каждой комбинации фенолоснование варьируют в изложенных пределах. Предпочтительно в качестве фенольного соединения использовать фенол в концентрации приблизительно от 0,15 до 0,25% (об./об., конечная концентрация). Более предпочтительно использовать фенол в концентрации 0,2%. Способ, которым производится растворение Лиз В28 Про В29 -чИ, или порядок, в котором фенол, цинк и ЛизВ28ПроВ23-чИ добавляют в раствор, не являются принципиальными для настоящего способа. Однако принципиальным является тот факт, что фенол взаимодействует с Лиз^Про 8 2 9 чИ ниже изоэлектрической точки Лиз^Про^-чИ. Соответственно, кристаллизация может быть инициирована как добавлением цинка, так и переводом кислотности раствора от кислого рН до приблизительно 5,5-6,5 с помощью физиологически переносимого основания. Физиологически приемлемые основания включают гидрок 26638 сид натрия, гидроксид калия и гидроксид аммония Предпочтительно использовать гидроксид аммония. Кристаллизацию можно выполнять посредством перевода кислотности раствора, содержащего Л и з ^ П р о ^ - ч И , цинк, по крайней мере, О,ЗН органической кислоты, выбранной из группы уксусной кислоты, лимонной кислоты или глицина, и фенол до приблизительно рН 5,5-6,5 с помощью физиологически приемлемого основания. Предпочтительно рН доводят до значений приблизительно 5,9-6,2, после чего формируются кристаллы. Более предпочтительно, Лиз В28 Про В29 чИ растворяют приблизительно в 1Н растворе уксусной кислоты (если необходимо способствовать растворению, рН можно довести до 3,0-3,5). Затем к раствору добавляют фенол, и раствор уравновешивается, рН раствора доводят до приблизительно 5,5-6,5 с помощью физиологически приемлемого основания. Предпочтительно использовать гидроксид аммония, а рН доводят до приблизительно 5,9-6,2, Затем инициируется кристаллизация посредством прибавления цинка. При различных способах кристаллизации кристаллы образуются при перемешивании или без перемешивания и могут быть собраны и отмыты. Предпочтительно выполнять кристаллизацию с перемешиванием. Для облегчения фильтрования, если требуется, можно рекристаллизовать Лиз в г в Про В 2 9 -чИ. Кристаллы могут быть собраны и высушены с помощью стандартных методик. Если кристаллы собирают фильтрованием, к фильтрату можно добавить дополнительное количество цинка, или к маточному раствору, для дальнейшего восстановления ЛизВ28ПроВ29-чИ. Кристаллы, приготовленные согласно настоящему изобретению, являются высококачественными и дают большой выход в промышленном масштабе. Кристаллы обеспечивают стабильную твердую форму массы лекарственного вещества, удобную для хранения, а также для выполнения последующих технологических операций. Процедура кристаллизации не изменяет чистоту и аггрегационные характеристики материала. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Температура кристаллизации не яв- 55 ляется принципиальной. Приемлемый температурный режим составляет приблизительно от 4 до 26°С. Предпочтительно поддерживать температуру приблизительно от 22 до 24°С. 8 ЛизВ2вПро829-чИ можно получить с помощью любого из способов пептидного синтеза, включая классический способ (раствор), способ твердой фазы, полусинтетические способы и наиболее современные способы с рекомбинантной ДНК. Например, Chance и др., публикации ЕРО № 383472, раскрывают приготовление Л и зВ28Провгэ-инсулина человека. Следующие примеры приводятся для целей иллюстрации приготовления аналогов инсулина и настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие рамки настоящего изобретения. П р и м е р 1. 846,5 г Лиз В28 Про вг9 чИ в 116 л уксуснокислого буфера разводили до поглощения 2,25 на 276 нм очищенной водой (260,6 л) и ледяной уксусной кислотой (19,44 л) в барабане из нержавеющей ^тали до конечной концентрации уксусной кислоты 1Н. К раствору добавляли жидкий фенол до концентрации 2 мл/л (общее количестоо 792 мл) и рН полученного раствора был ниже 3. Далее рН раствора доводили до 6,01 путем добавления 24 л гидроксида аммония и подогревали до 229С. После этого добавляли 5,35 л раствора хлорида цинка (2% вес/об, в воде). Затем убеждались, что рН раствора находится в желаемых пределах (5,9-6,1), и раствор перемешивали в течение 12 ч. Затем раствор охлаждали до 8°С, прекращали перемешивание и кристаллам позволяли осесть в течение 18 ч при 2-8°С. После оседания кристаллов 370 л надосадочного раствора декантировали, а оставшийся надосадок и кристаллы перемешали в барабан меньшего размера для добавочного оседания с использованием декантированного надосадка для промывания первого барабана. После 14 ч оседания 61 л надосадка декантировали, оставляя приблизительно 9 л сырых кристаллов и надосадка. Кристаллы суспендировали в этом объеме и центрифугировали в шести литровых центрифужных колбах при 4000 об./ /мин (приблизительно 4000 х G) на центрифуге DPR6000 в течение 45 мин. Для центрифугирования всего кристаллического шлама потребовались две загрузки центрифуги. Центрифугат декантировали. Кристаллы (приблизительно 250 мл на колбу) суспендировали в 500 мл очищенной воды на центрифужную колбу и вновь центрифугировали на 4000 об./мин в течение 45 мин. Кристаллы затем вновь суспендировали в центрифужных колбах в приблизительно 500 мл охлажденного (2-8°С) 9 26Є38 10 два образца) воды Milli-Q, содержащей абсолютного спирта SD № ЗА на колбу и 1,2 мл ледяной уксусной кислоты. В перрецентрифугировали на 4000 об./мин в вый образец добавляли сорок четыре миктечение 15 мин. ролитра жидкого фенола, а во второй Спиртовой центрифугат сливали, и такое спиртовое отмывание повторяли еще 5- 34 микролитра жидкого фенола. В обоих случаях рН доводили до 6,0 путем придва раза. Кристаллы, отмытые спиртом бавления концентрированного гидроксида (1,9 кг сырого веса), высушивали в вакууаммония, а затем добавляли по сорок ме. пять микролитров раствора хлорида цинка П р и м е р 2. Раствор Лиз вг8 Про В2Э чИ приблизительно 2 r/л приготавливали 10 (20% вес./об. в воде). Растворы перемешивали приблизидо конечной концентрации 1М уксусной тельно 5 мин, после чего их оставляли кислоты (определяли по поглощению на стоять под крышкой при комнатной тем280 нм). После добавления жидкого фепературе. Спустя приблизительно 24 ч, нола (3,3 мл/л) рН раствора доводили до оформленные 5,9-6,2 концентрированным гидроксидом 15 наблюдали хорошо ромбоэдрические кристаллы. аммония и добавляли хлорид цинка в воП р и м е р 5. Лиз В2й Про вг9 -инсулин де 2% (вес/об.) или 20% (вес/об.) до человека (222 мг) растворяли в 100 мл конечной концентрации 40-160 мг хлориводы Milli-Q. В растворе определяли сода цинка на грамм Лиз вгв Про В29 -чИ. ПолуВ28 В29 ченные кристаллы оседали, а маточный • 20 держание 2,0 мг Лиз Про -чИ в миллилитре раствора посредством жидкостной раствор удаляли декантированием после хроматографии высокого разрешения. центрифугирования. Кристаллы отмывали Раствор осветляли доведением рН прибпоследовательным суспендированием и лизительно до 3,0 прибавлением 10% HCI. центрифугированием в воде и в абсолютном этаноле, после чего высушивали в 25 Отбирали четыре 5 мл аликвоты, прибавляли ледяную уксусную кислоту до конвакууме. центрации 1Н, и рН был определен ниже Второй сбор кристаллов можно полу3,5. В аликвоты добавляли или м-крезол чить путем добавления цинка к маточному (12 мкл), или фенол (10 мкл), или резорраствору до предела в 160 м г / г Лиз е28 Про В29 -чИ. 30 цинол (2,1 мкл 100 мг/мл раствора в воде) или метилпарабен (1,6 мл 10 мг/мл П р и м е р 3. Лиз В28 Про вг9 -инсулин раствора в воде), что вызывало в аликвочеловека (222 мг) растворяли в 100 мл тах одинаковые молярные соотношения воды Milli-Q. В растворе определили сопептида и фенольного соединения. держание 2,0 мг на мл раствора В28 В29 Лиз Про -чИ с помощью жидкостной 35 К каждому образцу добавляли по хроматографии высокого разрешения. шесть микролитров раствора хлорида цинРаствор осветляли путем доведения рН ка (20% вес/об, в воде), и рН доводили приблизительно до 3,0 с помощью 10% до 6,0 с помощью концентрированного HCS, Отбирали четыре 5 мл аликвоты, пригидроксида аммония. Растворы перемебавляли ледяную уксусную кислоту до кон- 40 шивали приблизительно 15 мин, а затем центрации 1Н, и рН был ниже 3,5. оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре. К каждому образцу добавляли по десять микрольтров жидкого фенола и заСпустя приблизительно 24 ч в раствотем по шесть микролитров раствора хлорах, содержавших фенолы, наблюдали хорида цинка (20% вес/об, в воде). рН до- 45 рошо оформленные ромбоэдрические водили до 6,0 путем прибавления конкристаллы. 8 растворе, содержавшем мецентрированного гидроксида аммония, гидтилпарабен, образовалось небольшое короксида натрия (10% вес/об.) или гидличество плохо определяемых плоских роксида калия (10% вес/об.). кристаллов. Растворы, содержавшие мРастворы перемешивали приблизи- 50 крезол и резорцинол, при этих условиях тельно 15 мин, а затем оставляли стоять кристаллы не образовывали. \ под крышкой при комнатной температуре. Спустя приблизительно 2 ч, во всех трех Сходную процедуру предприняли с одрастворах хорошо определялись ной десятой количества резорцинола и ромбоэдрические кристаллы, причем наи- 55 доведением рН с помощью гидроксида более быстро кристаллы образовывались натрия (10% вес/об, раствора); при этом в растворе, в который добавляли гидрокполучались хорошо оформленные сид калия. ромбоэдрические кристаллы. Этот пример показывает, что с фенольными соединеП р и м е р 4. Приблизительно 42 мг ниями могут образовываться хорошо Лмз в28 Про е25 -чИ растворяли в 20 мл (по 12 26638 11 оформленные кристаллы при рутинной оптимизации условий. П р и м е р 6. Лиз В2в Про вг9 -чИ (222 МГ) растворяли в 100 мл воды Mil1i~Q. В растворе определяли содержание 2,0 мг ЛизВ2ВПроВ29-чИ в миллилитре раствора посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения. Раствор осветляли доведением рН приблизительно до 3,0 с помощью 10% HCI. Отбирали одну аликвоту 5 мл и добавляли ледяную уксусную кислоту до концентрации 0,25Н и подтверждали рН ниже 3,5. К образцу добавляли двадцать микролитров раствора хлорида цинка (2% вес/об, в воде). рН раствора доводили до 6,0 добавлением концентрированного гидроксида аммония. Раствор перемешивали приблизительно 15 мин, после чего его оставляли стоять под крышкой при комнатной температуре. Сгтустя приблизительно 24 ч, в растворе не наблюдалось образования кристаллов, но на дно сосуда выпал аморфный осадок. роксидом аммония, согласно процедуре, описанной в примере 1. Образовывались хорошо оформленные ромбоэдрические кристаллы Лиз В28 Про вм ^чИ. Когда инсу5 лин человека (2,3 мг/мл в 1Н уксусной кислоте) подвергали процедуре, описанной в примере 1, с использованием гидроксида аммония, в течение 7 дн. кристаллы не образовывались. 10 Этот эксперимент показал, что условия, обычно применяемые при кристаллизации биосинтетического инсулина человека, не подходят для кристаллизации 15 Л и зВ28ПроВ29-инсулина человека, а условия кристаллизации, описанные для кристаллизации Лиз В28 Про вы -чИ, не производят кристаллов инсулина человека. 20 В качестве контроля брали другую аликвоту в 5 мл и обрабатывали ее гид- 25 П р и м е р 7. Способом, описанным в примере 1, выполняли кристаллизацию, заменяя 1Н уксусную кислоту 1Н лимонной кислотой. Эта кристаллизация дала хорошо оформленные кристаллы Техред М. Келемеш Замовлення 520 Коректор М.Самборська Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, КиІв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вуя. Гагаріна, t01