Сорбент для добування антитіл до інсуліну з біологічних рідин та спосіб його одержання

Изобретение относится к области медицины, в частности, к материалам для экстракорпоральной очистки крови у больных сахарным диабетом и способу их получения. У подавляющего большинства больных сахарным диабетом на введение инсулина вы-рабатываются антитела к нему. Это приводит к увеличению дозы вводимого инсулина, развитию аллергической реакции на вводимый инсулин, что, в свою очередь, приводит к снижению эффективности или невозможности проведения инсулинтерапии. Удаление из кровотока больного антител к инсулину дало бы возможность вывести пациента из кризисного состояния (острой аллергической реакции), ликвидировать инсулинрезистентность и проводить далее инсулинтерапию. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является гемосорбент СКН для лечения сахарного диабета путем проведения экстракорпоральной сорбционной детоксикации крови [1]. При помощи этого материала удается извлекать до 22% антител к инсулину. Указанный гемосорбент представляет собой гранулы активированного угля сферической формы. Недостатком указанного гемосорбента в лечении сахарного диабета является его низкая сорбционная способность по отношению к антителам к инсулину и, следовательно ~ низкий терапевтический эффект от его применения. Известен способ получения биоспецифического гемосорбента, позволяющий повысить избирательность сорбента за счет ковалентной иммобилизации специфического белка, в качестве которого используется аллерген домашней пыли [1]. Указанный способ включает последовательную обработку окисленного гранулированного активированного угля растворами водорастворимого карбодиимида и белковой добавки. Однако описываемый способ, взятый в качестве прототипа, не позволяет добиться требуемого результата, поскольку аллерген домашней пыли не обладает селективностью по отношению к антителам к инсулину. Задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание сорбента для извлечения антител к инсулину из биологической жидкости. Созданный для решения поставленной задачи углеродный сорбент, содержащий инсулин, ковалентно связанный с функциональными группами углеродной матрицы, позволяет получить технический результат, заключающийся в увеличении сорбционной способности сорбента по отношению к антителам к инсулину. Для увеличения количества извлекаемых сорбентом из биологических жидкостей антител к инсулину, известный гемосорбент для лечения сахарного диабета, представляющий собой гранулированный активированный уголь, дополнительно содержит инсулин, ковалентно связанный (иммобилизированный) на поверхности гранул с функциональными группами углеродной матрицы в количестве 0,7-2,2 мас.% и имеет следующую структурную формулу где R - углеродная матрица. При иммобилизации инсулина менее 0.7 мс.% адсорбционная способность целевого гемосорбента по отношению к антителам к инсулину существенно снижается. При увеличении содержания инсулина более 2,2 мас.% не достигается увеличения эффективности извлечения антител к инсулину целевым гемосорбентом при больших затратах ресурсов и реактивов. Получить сорбент, обеспечивающий увеличение количества извлекаемых из биологических жидкостей антител к инсулину можно заявляемым способом. Сущность его состоит в том, что в известном способе, включающем обработку окисленного гранулированного углеродного материала растворами водорастворимого карбодиимида и белковой добавки с последующей ее иммобилизацией, в качестве белковой добавки используют инсулин, а иммобилизацию инсулина проводят на окисленном гранулированном углеродном материале со статической обменной емкостью (СОЕ) 0,8-1,6 мэкв/г, объемом сорбционных пор (по бензолу) 0,5-2,0 см3/г и площадью удельной поверхности (по тепловой десорбции аргона) 400-1800 м /г. При иммобилизации инсулина на углях с СОЕ, объемом сорбционных пор и площадью удельной поверхности меньше, чем заявляемый интервал, требуемый технический результат не достигается вследствие невозможности иммобилизовать нужное количество инсулина, При иммобилизации инсулина на углях с СОЕ, объемом сорбционных пор -и площадью удельной поверхности больше заявляемого интервала нет преимуществ перед уже достигнутым результатом при больших затратах ресурсов и реактивов. Применение инсулина и активированного угля, каждого в отдельности, дает незначительный терапевтический эффект. Использование инсулина с целью извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей не дает возможности выводить из биологической жидкости растворимые в ней конъюгаты инсулина и антител к нему. Активированный уголь не обладает высокой адсорбционной способностью по отношению к антителам к инсулину, а следовательно и высоким терапевтическим эффектом. Иммобилизация инсулина на поверхности активированного угля позволяет создать сорбент, обладающий способностью к избирательному извлечению антител к инсулину и, следовательно, высоким терапевтическим эффектом. Целевой гемосорбент представляет собой гранулы активированного угля с ковалентно иммобилизованными на их поверхности молекулами инсулина. Заявляемое изобретение осуществляется следующим образом. Все операции проводятся в стерильном помещении с использованием стерильных растворов. Буферные растворы и исходный углеродный гемосорбент стерилизуют автоклавированием при 125°С и 1,5 атм в течение 60 мин в стерилизаторе ВК-75. Раствор инсулина с концентрацией 5 мг/мл (исходный раствор) готовят на буферном растворе с рН 7,2 и стерилизуют пропусканием через фильтр "Mllllpor" (фирмы Миллипор, США) с диаметром пор 0,45мин. Пример 1. 5 г углеродного гемосор-бента СКНо с СОЕ 1,6 мэкв/г, площадью удельной поверхности 1800 м2/г и объемом сорбционных пор 2,0 см3/г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, прибавляют 50 мл буферного раствора с рН 4,0 (состоящего из равных частей 0,15 Μ водных растворов дигидрофосфата калия и хлорида натрия) и оставляют на 10-12 часов при температуре 20-25°С. После сливания жидкости, находящейся над гемосорбентом, в реакционную колбу приливают 0,1 г водорастворимого карбодиимида (мето-п-толуол-сульфонат 1-циклогексил-З-морфолиноэтил карбодиимид, Серва, ФРГ) и 50 мл буферного раствора с рН 4. Содержимое реакционной колбы слабо перемешивают в течение 15 мин, сливают жидкость и прибавляют 50 мл рабочего раствора инсулина, приготовленного из 5 мл исходного раствора инсулина и 45 мл буферного раствора с рН 7,2, приготовленного из 0,15 Μ водных растворов гидрофосфата натрия (28,6 частей), дигидрофосфата калия (9,0 частей) и хлорида натрия (37,6 частей), Гемосорбент выдерживают в контакте с раствором инсулина при слабом перемешивании в течение 18-20 часов. Жидкость сливают, к углеродному материалу прибавляют 100 мл буферного раствора с рН 7,2, слабо перемешивают в течение 15 минут, жидкость сливают. Операцию промывки повторяют 4-5 раз. Несвязавшийся инсулин определяют в надосадочной жидкости согласно модифицированному методу Лоури спектрофотометрированием при 700 нм. Приготовленный целевой гемосорбент (0,2 г), содержащий 0.5 мас.% инсулина и 99,5 мас.% гемосорбента СКНо, помещают в колбу на 50 мл и прибавляют 2 мл сыворотки крови больного диабетом (биологическая жидкость). Содержимое колбы перемешивают в течение 2 часов и проводят определение антител к инсулину, мочевины, креатинина и мочевой кислоты. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1, были получены и исследованы образцы целевого сорбента с содержанием ковалентно иммобилизованного инсулина 0,5; 0,7; 1,5; 2,2; 2,5 мас.%. Результаты определения приведены в табл.1. Антитела к инсулину определяют радиоиммунным методом; мочевину - фотометрическим методом с тиосемикарбазидом; креатинин - по цветной реакции методом Яффе; мочевую кислоту - методом Фолина и Денисова на приборе Seralyzer (фирма Ames, США-Австрия). Пример 2. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1 были приготовлены и испытаны целевые инсулин-содержание и исходный гемосрбенты, приготовленные на основе угля КАУо с различными структурно-сорбционными характеристиками. Результаты испытаний и структурно-сорбционные характеристики углей приведены в табл.2. Из приведенных выше данных видно, что иммобилизация инсулина на углеродном носителе в заявляемых интервалах 0,7-2,2 мас.% приводит к увеличению способности сорбента извлекать антитела к инсулину из биологической жидкости (образцы N. 1, 2, 4), в отличие от образца, не имеющего в своем составе ковалентно иммобилизованного инсулина (прототип, образец № 7). Иммобилизация инсулина в количестве более заявляемого интервала не приводит к улучшению уже достигнутых результатов при большей затрате реактивов и ресурсов (образец № 3). Кроме того, при этом сорбционные характеристики носителя должны удовлетворять заявляемым интервалам (СОЕ 0,8-1,6 мэкв/г)объем сорбционных пор 0,5-2,0 см /г, площадь удельной поверхности 400-1800 м2/г). Сорбент, структурные характеристики которого не удовлетворяют заявляемым интервалам, не обеспечивает достижение цели изобретение (образец № 5), даже если количество иммобилизованного инсулина находится в заявляемом интервале (образец №6). Пример 3. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1, были приготовлены и испытаны целевые инсулин-содержащие гемосорбенты на основе углей СКНо с различными структурно-сорбционными характеристиками. Результаты определений и структурно-сорбционные характеристики углей приведены в табл.3. Из приведенных выше данных видно, что иммобилизация инсулина на исходном угле в заявляемом интервале 0,7-2,2 мас.% приводит к увеличению адсорбционной способности сорбента извлекать антитела к инсулину из биологических жидкостей (образцы № 1,2,3), в отличие от образца, не имеющего в своем составе ковалентно иммобилизованного инсулина (прототип, образец № 7). Иммобилизация инсулина в количестве более заявляемого интервала не приводит к улучшению уже достигнутого результата при большей затрате реактивов и ресурсов (образец № 4). Кроме того, при этом сорбцианные характеристики носителя должны удовлетворять заявляемым интервалам. Сорбенты, характеристики которых не удовлетворяют им, не обеспечивают достижения цели изобретения (образец № 5). Образцы окисленного угля с сорбционными характеристиками, превышающими заявляемый интервал (образец № 6), не имеют дополнительных преимуществ по сравнению с достигнутыми результатами. Выводы. Иммобилизация инсулина на гемосорбенты СКНо, КАУо в количествах и на сорбентах со структурно-сорбционными характеристиками, удовлетворяющими заявляемым интервалам, приводит к увеличению сорбционной способности целевого гемосорбента по отношению к антителам к инсулину у СКНинс. сорбента в 2,1 раза, у КАУ-инс. сорбента в 3,9 раз по отношению к исходным углеродным гемосорбентам. При этом у инсулинсодержащих целевых сорбентов сохраняется неспецифическая сорбционная способность. Все эти качества заявляемого сорбента позволяют ему найти широкое применение в медицине для экстракорпоральной детоксикации организма больных сахарным диабетом.