Спосіб визначення рівня пошкодження лейкоцитів

МКИ6: A61B10/00 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ РІВНЯ ПОШКОДЖЕННЯ ЛЕЙКОЦИТІВ Винахід відноситься до медицини, зокрема, до імунології, й може бути використаним в імунодіагностиці вірусних і бактеріальних захворювань. Відомий спосіб визначення рівня пошкодження лейкоцитів, який включає інкубацію ізольованих клітин з токсичним чинником та наступним дослідженням спектрального розподілу поліхромно осцилюючих клітин у полі зору люмінесцентного мікроскопу [І]. Недолік відомого способу пов'язаний з його недостатньою діагностичною інформативністю внаслідок інкубації ізольованих клітин з неідентифікованим токсичним чинником в аутологічній плазмі (сироватці) крові. В основу винаходу поставлене завдання удосконалити спосіб» в якому шляхом інкубації ізольованих лейкоцитів крові з екзогенним токсичним чинником - ймовірним фактором імунного ураження клітин досягають підвищення інформативності діагностичного дослідження. Поставлене завдання вирішують тим, що у способі визначення рівня пошкодження лейкоцитів крові, який включає інкубацію ізольованих клітин з пошкоджуючим фактором та наступне визначення спектрального розподілу поліхромно осцилюючих клітин у полі зору люмінесцентного мікроскопу, у відповідності до винаходу інкубацію лейкоцитів здійснюють з чинником, молекулярний склад якого несе імунну інформацію про антигенний склад ймовірного збудника інфекційного процесу, а результат порівнюють з контролем. При вирішенні технічного завдання було взята до уваги біофізична сутність способу, яка полягає в тому, що в результаті пошкоджуючого впливу на клітину продуктів імунологічного конфлікту, а саме впливу на клітину продуктів імунологічного конфлікту, а саме комплексу антиген-антитіло, відбуваються кількісні та якісні зміни внутрішньоклітинних біоенергетичних процесів, про які судять за характером спектрального перерозподілу картини люмінесцентного світіння ядер досліджуваних клітин. Молекули флюорохрому акридинового оранжевого (АО) в процесі взаємодії з лейкоцитами вмонтовуються між спіралями ядрових ДНК клітин. При цьому в полі зору люмінесцентного мікроскопу спостерігають поліхромне світіння ядрових субстанцій лейкоцитів — зеленим, оранжевим й червоним кольорами. Оскільки спектр люмінесцентного світіння залежить від форми зв'язку молекул флюорохрому з ядровою ДНК, то й співвідношення поліхромно осцилюючих клітин залежить в значній мірі від їх вихідного функціонального стану та й, в решті решт, біоенергетики клітини в цілому. Так, при надлишку діючих токсичних чинників ДНК зв'язує флюорохромний барвник у вигляді димеру, що викликає зсув спектру люмінесценції, відповідно до правила Стокса, в сторону збільшення "червоних" клітин. І, навпаки, — із зменшенням вмісту токсичних агентів у крові ядрова ДНК зв'язує флюорохром у вигляді мономеру. Останнє спричиняє збільшення кількості "зелених", у біоенергетичному плані більш активних лейкоцитів. Отже, чим вища концентрація цитотоксичних чинників у крові, тим більшим буде вміст "червоних" лейкоцитів в мікропрепараті, а збільшення числа "зелених" клітин свідчить про пониження рівня пошкоджуючого чинника в крові. Спосіб здійснюють таким чином. У дві мікропробірки вносять по 0,05 мл розчину флюорохрому АО в розведенні 1:10000 ізотонічним розчином хлориду натрію (рН 6,5) та 0,1 мл крові. До суміші в першій пробірці додають 0,020 мл дослідного біосубстрату, наприклад, імунодіагностичної сироватки, яка містить антитіла до відомого збудника інфекційної хвороби. До вмісту в другій пробірці 0,020 мл розчину хлориду натрія (контроль). Отримані в пробірках суміші інкубують при 37°С на протязі і год. Після цього краплину інкубату з кожної пробірки вміщують на чисте знежирене предметне шкло, покривають шхельцем. Мікропрепарати витримують в темноті при кімнатній температурі ще 20 хв., після чого досліджують у полі зору люмінесцентного мікроскопу по 100 клітин, визначачи процентне співвідношення поліхромно осцилюючих лейкоцитів, ядрові структури яких висвічують зеленим (g), оранжевим (о) і червоним (г) світлом. В контрольних пробах, або при внесенні в пробірки з лейкоцитами імунного чинника, який не викликає імунного пошкодження, це співвідношення лежить в межах: "зелених" 90+100%, "оранжевих" 1*10 %» "червоних" 1+5%. При наявності чутливості лейкоцитів до специфічних антитіл співвідношення поліхромних ядер зміщується в сторону збільшення "червоних" та "оранжевих". Конкретно результати дослідження оцінюють шляхом порівняння значень інтегративного показника лейкоцитотоксичності (Vk), який виражає відсоток збільшення лейкоцитотоксичного впливу досліджуваного фактора у порівнянні з контролем.Він визначається за за формулою: Vk = f(Ik-W): hJxlOO, де Ik і Id - значення індексів інтоксикації - контрольного і дослідного, які визначають за формулою: Приклад 1. У дві мікропробірки внесли по 0,05 мл розчину флюорохрому АО в розведенні ї: 10000 (рН 6,5) та 0,і мл крові. В першу пробірку внесли також 0,020 мл дослідного біосубстрату, наприклад, імунодіагностичної сироватки, яка містить антитіла до вірусу кору - збудника повільної інфекції, ймовірного причинного фактору розсіяного склерозу. В другу пробірку (для контролю) внесли 0,020 мл розчину натрію хлориду. Після інкубації з кожної суміші готували міхропрепарати й досліджували їх в люмінесцентному мікроскопі. В обох мікропрепаратах визнача ли процентне співвідношення поліхромно осцилюючих лейкоцитів, ядрові структури яких висвічували зеленим (g), оранжевим (о) і червоним (г) світлом. Спочатку обчислювали дослідний і контрольний інтегративні індекси інтоксикації, а потім порівнювали їх за допомогою показника лейкоцитотксичності \}t. Результати демонстраційного дослідження наведені в таблиці і. Таблиця 1 Дослідний лейкоцнтотоксичний чинник Дослід: Показники зелені (g) •/•% орнажеш(о) червоні(г) Індекс ІІ %% %% протикірна сироватка 77 19 14 27,3 Контроль 93 5 2 11,2 Показник Vk 143,75 Приклад 2. З допомогою зазначеного способу провели імуннодіагностичне дослідження крові 4 хворих на розсіяний склероз та 4 практично здорових людей, що в минулому перехворіли на кір. Для проведення контрольних досліджень використували протидифтерійну сироваїху. Кожне дослідження дублювали, беручи дая аналіза середнє значення. Результати наведені в табл.2 Таблиця 2 Груші обстежених По к аз н и к и Статиетмчяі показники показник Ffc^4V.%) індекс h ПКС пдс Хворі на розсіяний склероз п= 8 X ± s 264 33,2 31,8 22,7 12Д 11,5 12,4 Здорові люди, які перенесли кір в минулому и= 8 X ± s 13,2 17,7 15,5 14,6 113 11,7 Н,4 12,6 ТЧаСІ їм ПДС 11,2 11,6 11Д 132,5 174,4 4,4 8,0 174,1 102,7 8,6« 145,9120,6 1,8 5,7±1,0 11,2 11,4 11,3 11,6 17^ 55,3 37,2 25,9 34,0±8,8 0 ^ 2,6 0 ^ 8,6 3,0+0,8 0,05 Р Примітка: ПКС ПКС -протикірна онроватка ПДС -протидиф^іерійна сирова іка NaCl - ізотонічний розчин З наведених в табл.2 даних видно, що лейкоцити хворих на розсіяний склероз реагують значним збільшенням кількості "червоних" лейкоцитів, що відображено значним підвищенням показника Vie»який становить у цієї категорії хворих 145,9±20,6 %. В той же час у здорових людей» що перенесли кір в минулому, цей показник знаходиться в межах лише 34,0 ±8,8% (Р