Спосіб оптимізації діагностики передракових змін слизової оболонки шлунка

УКРАЇНА (19) UА (и, 39719 (із, А (51) 7G01N33/48 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНО* ВЛАСНОСТІ ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видасться під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ОПТИМІЗАЦИ ДІАГНОСТИКИ ПЕРЕДРАКОВИХ ЗМІН СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА {21)2001010205 (22) 10 01 2001 (24)15 06 2001 (46) 15 06 2001, Бюл № 5, 2001 р (72) Степанов Юрій Миронович, Гриценко Іван Іванович (73) ДНІПРОПЕТРОВСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ (57) Спосіб оптимізаци діагностики передракових змін слизової оболонки шлунка, що включає проведення фіброгастроскопи з гастробюпсією та аналіз діагностичних показників апоптозу слизової оболонки шлунка, який відрізняється тим, що додатково визначають показники інтенсивності апоптозу епітелюцитів при аналізі діагностичних показників розраховують апоптозний індекс (Аі) та на цій підставі визначають ступінь ризику рака Винахід відноситься до медицини, а саме до досліджень або аналізу матеріалів особливими способами переважно біологічних, і може бути використаним у терапії, гастроентерології та онкологи для покращення діагностики передракових станів слизової оболонки шлунка (СОШ) та раку шлунка (РШ) Для практичної охорони здоров'я основною проблемою залишається так звана вторинна профілактика злоякісних новоутворень Вона заключається у ранньому активному виявленні осіб з передпухлинними та початковими стадіями пухлинних захворювань, формуванні груп підвищеного ризику, проведенні їх диспансеризації та лікування, що сприяє ранньому виявленню новоутворення Як відомо, рак шлунка займає одне із провідних місць у структур* онкологічної захворюваності та смертності від злоякісних новоутворень [6] Важливість своєчасної його діагностики важко переоцінити Являючись одним з найбільш розповсюджених онкологічних захворювань, в Україні РШ лише нещодавно поступився абсолютним лідерством за показниками захворюваності та смертності від раку легенів (3] Традиційні підходи до діагностики пухлин, які використовуються до останнього часу, грунтуються, головним чином, на розпізнаванні симп шлунка, якщо Аі 8,1% - це є ознакою високого ризику або навіть наявність рака шлунка, при умові, що апоптозний індекс розраховують за такою формулою Аі = Ай загальна КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН •х 100 , де Ая+Ат - загальна КІЛЬКІСТЬ апоптозних клітин, Ая - КІЛЬКІСТЬ клітин з ознаками апоптозу у ядрах, Ат - КІЛЬКІСТЬ апоптозних тіл, 100 - коефіцієнт перерахунку результату у відсотки томів захворювання при звертанні до лікаря самого хворого [4] На жаль, вказана тактика не сприяє ранньому виявленню злоякісних новоутворень, оскільки у початкові періоди розвитку вони, як правило, перебігають безсимптомно, або під маскою хронічної патології шлунково-кишкового тракту Відсутність виражених клінічних проявів новоутворення збільшує період встановлення правильного діагнозу і, тим самим, відсуває початок лікування Високі показники смертності свідчать про недостатню ефективність своєчасного виявлення передракових станів слизової оболонки РШ існуючими методичними підходами За думками багатьох спеціалістів, результати лікування таких хворих, в першу чергу, залежать від стадії розвитку пухлини [4] Нині В Україні РШ І стадії виявляється лише у 7,2% хворих, незважаючи на використання сучасних методів обстеження, таких як рентгенографія, фіброгастроскопія з прицільною біопсією, ультрасонографія, комп'ютерна томографія тощо На момент встановлення діагнозе РШ в Україні у 1998 році неоперабельними (ІУ стадія) виявилося 39,1% хворих [3] Незадовільний стан ранньої діагностики потребує вдосконалення старих та пошук нових методів виявлення ранніх форм РШ До таких ме о> О) со 39719 тодів відноситься формування груп осіб з підвищеною вірогідністю захворювання злоякісними пухлинами Клінічні критерії такого ризику розроблені поки що у недостатньому обсязі, крім того, вони є малоінформативними Розробка морфологічних показників ризику розвитку РШ також не відповідає сучасним вимогам, та, як правило, є недостатньою для практичної медицини. В зв'язку з цим зростає необхідність у більшій обізнаності лікарів про передрак шлунка. Останнім часом поняття "передрак" зазнало значних змін Нині фахівці виділяють передракові стани та передракові зміни [1]. До перших відносять ті захворювання, які значно збільшують ризик формування пухлини, до других - морфологічні зміни, при яких рак виникає з більшою долею вірогідності ніж у нормальній тканині. Вважається, що РШ розвивається на тлі різноманітних хронічних патологічних станів, які поєднані з певними клітинними та структурними порушеннями СОШ. Патологічний процес починається з явищ запалення у СОШ у вигляді гастриту, ерозії або виразки, виникаючих під впливом різних факторів, що у подальшому може бути тлом для розвитку метаплазії І дисплазії епітеліальних клітин та раннього раку шлунка. До передракових станів шлунка відносять: хронічний атрофічний гастрит, гастрит "перебудови", атрофічно-гіперпластичний гастрит, гастрит резеційованого шлунка, гастрит при перніціозній анемії, гіпертрофічний гастрит (хвороба Менетріє), поліпоз, хронічну виразку шлунка. До передракових відносять такі морфологічні зміни, як виразна кишкова метаплазія та дисплазія епітелію. Однак, межа різної передракової патології'є відносною, Ризик виникнення раку збільшується лише при сполученні перед пухлинних станів та передракових змін, при цьому останні мають рішаюче значення [9]. Відомий спосіб діагностики ранніх стадій РШ є фіброгастроскопія з гастробіопсією [1] Обов'язково отримуються декілька біоптатів, причому перший - із найбільш підозрілої ділянки, тому що у подальшому точність біопсії може бути ускладнена кровотечею. Надалі проводять морфологічне дослідження біоптатів Згідно існуючої гістологічної класифікації ВОЗ, безпосереднім попередником та джерелом РШ є дисплазія епітелію шлунка. Дисплазія характеризується порушенням функціонального та морфологічного диференціювання клітин, дезорганізацією структури епітеліоцитів СОШ та появленням атипових клітин. В залежності від вираженості вказаних змін нині розглядають три ступеня епітеліальної дисплазії - легку (І), помірну (Н) та важку ((II). Вони відрізняються за інтенсивністю запальних, регенераторних та дисрегенераторних процесів у СОШ [7]. Клітинний атипізм характеризується збільшенням розміру клітин: поліморфізмом гіперхроматозом та збільшенням ядер, порушенням полярності їх розташування і збільшенням ядерно-цитоплазм этичного співвідношення; " виникненням ядерець, базофілією цитоплазми: появою та зростанням багаторядності клітинного пласту. Порушення диференціювання пов'язано зі зменшенням або припиненням секреції шлункового епітелію; змінюється її характер; у СОШ ви никають мікропапілярні утворення, які стирчать у просвіт шлункових ямок або локалізуються на поверхні зборок слизової, це створює картину дезорганізації СОШ. При виявленні ознак важкої дисплазії загальноприйнято проводити повторні біопсії, оскільки такий ступінь дисплазії часто свідчить не про те, що у хворого виникає рак, але про те, що він вже існує. Після виявлення дисплазії РШ діагностується, як правило, протягом 6 місяців [4] На підставі даних мікроскопічного дослідження СОШ може бути визначено контингент хворих, страждаючих передпухлинною патологією шлунка, саме такі пацієнти у першу чергу мають бути відібрані у групу підвищеного онкологічного ризику. Отже, злоякісний потенціал атрофічного гастриту та інших передракових станів шлунка визначається за ступенем диспластичних змін СОШ. У разі виявлення важкої дисплазії виконується контрольне дослідження з метою пошука невиявлено'і пухлини. Виявлення дисплазії інших ступенів має бути підставою для формування групи онкологічного ризику, пацієнти цієї групи потребують ретельного диспансерного спостереження та своєчасного адекватного лікування. До причин, що стримують досягнення ефективності раннього розпізнавання РШ, належать труднощі вказаної ендоскопічно-морфологічної діагностики цього захворювання. Наприклад, при гастроскопії досить важко візуально диференціювати початкові форми карциноми від вогнищ гіперта дисплазії зборок СОШ, а також від аденоматозних поліпів [4]. Навіть проведення гастробюпсії з послідуючим морфологічним дослідженням біоптатів не дає гарантії точності встановленого діагнозу. Мікроскопічна диференційна діагностика між вираженими диспластичними процесами СОШ та початковим раком цього органу нерідко є непростою справою. Така рання діагностика РШ базується перш за все на виявленні атипізму клітинних елементів. Однак, оцінка критеріїв, які характеризують клітинний атипізм, часто є суб'єктивною та в значній мірі залежить від особистого досвіду досліджувача. Внаслідок цієї обставини частота хибнопозитивних та хибнонєгативних заключень залишається достатньо високою! До бснови винаходу покладено завдання вдосконалити відомий спосіб діагностики передракових змін СОШ та раннього РШ, застосування якого дозволило би більшою мірою, ніж існуючі методи, об'єкти візувати і таким чином підвищити ефективність морфологічного дослідження біоптатів СОШ у хворих на передракові захворювання шлунка Означений вище технічний результат згідно предмету винаходу досягається тим, що у відомому способі діагностики передракових змін СОШ та раннього РШ особливість полягає у тому, що крім виявлення дисплазії' епітеліоцитів шлунка та визначення ступеня її вираженості додатково проводять якісну та кількісну оцінку клітин, які знаходяться у стані апоптозу. В зв'язку з цим, необхідно відмітити, що роль апоптозу у гастроканцерогенезі з боку фахівців знаходиться у стані інтенсивного вивчення, а методи його оцінки у СОШ поки що недостатньо відомі практичним лікарям Тому 39719 вважаємо доцільним висвітлити певну інформацію, яка стосується цього важливого біологічного явища Нині існує уявлення про те, що у будь-якій КЛІТИНІ багатоклітинного організму закладена певна генетична програма яка обумовлює и природню загибель Ця програма надто важлива дли гомеостазу тканин, збереження КІЛЬКОСТІ ПОВНОЦІННИХ та видалення пошкоджених клітин Апоптоз є фізіологічною альтернативою проліферації, він здійснює їх елімінацію, забезпечуючи рівновагу між цими різноспрямованими процесами Відкриття феномену апоптозу J Кегг [8] можна порівняти з такими відкриттями біологічної науки РК, наприклад відкриття КЛІТИННОГО циклу Нині все більш очевидним стає суттєве значення апоптозу у розвитку патологи Його порушення лежать в основі таких захворювань, як хронічний гастрит, гепатити, аутоімунні серцево судинні, нервові та ОНКОЛОГІЧНІ захворювання [1 5] Процес апоптозу здійснюється за декількома етапами Спочатку виникають зміни ядер з конденсацією хроматину на периферії ядра та зі створенням повних або неповних кілець біля внутрішньої поверхні ядерних мембран При цьому спостерігається зменшення розмірів ядра (пікноз), його фрагментація (карюрексіс) Це є головною морфологічною ознакою апоптозу У подальшому відбувається конденсація, ущільнення клітинних органел. зменшення об'єму цитоплазми Закінчується все тим що клітини розпадаються на дрібні тільця, оточені мембраною, які містять залишки органел та ядра Перелічені поетапні зміни структури клітин виступають морфологічними ознаками апоптозу та використовуються фахівцями як критерії його кількісної оцінки [8] Особливе значення має вивчення апоптозу у СОШ Цей аспект проблеми пов'язаний з існуючими даними відносно суттєвих порушень клітинного обновлення та проліферативних процесів при розвитку хронічного гастриту [1] Більш того, власні дослідження дозволяють нам вважати, що ці порушення в більшій мірі виявляються при атрофічному гастриті, особливо з наявністю метапластичних та диспластичних змін в епітелії СОШ, що є характерним для передракових захворювань шлунка [2] Пропонуємий спосіб діагностики передракових змін СОШ та раннього РШ проводиться після фіброгастроскопн з множинною гастробюпсією При цьому беруть не менш п'яти бюптатів із антрапьного та кардіапьного відділів малої кривизни, передньої та задньої стінок тіла шлунка Виявлення апоптозних клітин та вивчення їх морфологічних особливостей проводиться за допомогою світлової мікроскопи (х400) ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів Для цього використовують тонкошарові зрізи забарвлені загальноприйнятими барвниками азуром А або гематоксилінеозином Мікроскопічними критеріями клітин, ячі знаходяться у стані апоптозу, є швидка конденсація ядерного матеріалу, брунькування клітин зі ство ренням компактних апоптозних тілець, які оточені плазматичною мембраною та містять у собі достатньо збережені органели За цими ознаками апоптозні клітини істотно відрізняються від некротичних клітин у яких ЦІЛІСНІСТЬ хроматину, органел та плазматичної мембрани значно порушена Після ідентифікації клітин, які знаходяться у стані апоптозу, проводять їх кількісну оцінку Для цього окремо підраховують загальну КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН з ознаками апоптозу у ядрах, але ще зі збереженою цитоплазмою (Ая) а також - КІЛЬКІСТЬ апоптозних тіл, утворених після фрагментації ядра та розпаду клітин (Ат) Апоптоз рахують на 100 клітин, інтенсивність його визначають у вигляді апоптозного індексу (Аі) у відсотках за формулою Аі = Ая загальна + А КІЛЬКІСТЬ клітин • 100 , х де Ая+Ат - загальна КІЛЬКІСТЬ апоптозних клітин Ая - КІЛЬКІСТЬ клітин з ознаками апоптозу у ядрах, Ат - КІПЬКІСТЬ апоптозних тіл, 100 - коефіцієнт перерахунку результату у відсотки На завершення порівнюють значення діагностичного індексу з критеріальними і таким чином визначають 4 градації онкопопчного ризику А) Аі At Аі шлунка = 8,1% - високий ризик або наявність раку На кафедрі гастроентерологи та терапії ДДМА заявляємий спосіб був використаний у діагностиці 60 хворих, які страждали хронічним атрофічним гастритом з перебудовою епітелію та іншими передраковими станами шлунка З метою оцінки ефективності та вірогідності пропонуємих діагностичних заходів бупи використані 2 контрольні групи пацієнтів одна - здорових осіб (п=25). друга - з раннім РШ {п=25) У цих групах також проводилось порівняльне визначення кількісних характеристик апоптозу у гастробюптатах Було встановлено (табл 1), що СОШ здорових пацієнтів (І контрольна група) характеризується відносно невисокою КІЛЬКІСТЮ епітелюцитів, які знаходяться у стані апоптозу (Аі=2 2±0 4%) Цей показник складається із сукупності відповідної КІЛЬКОСТІ КЛІТИН за ознаками апоптозу у ядрах {Ая=і ,2±0,4%) та клітин, фрагментованих на апоптозні тіла (Ат=1 0±0,3%) Отримані величини ми у подальшому розглядали як нормативи інтенсивності апоптозу У хворих на атрофічний гастрит відмічається збільшення інтенсивності апоптозу виразність якого залежить від наявності "перебудови" епітелію СОШ та ступеня важкості дисплазм 39719 Показники апоптозу епітеліоцитів шлунка у здорових, хворих з передраковими станами та раком шлунка Характер патології Показники апоптозу П Ая