Спосіб зменшення токсичності, яка виникає внаслідок застосування ретровіру

1. Спосіб зменшення токсичності, яка виникає внаслідок застосування ретровіру, який характеризується тим, що застосовують 2,3димеркаптопропансульфонат натрію в кількості, що не перевищує максимальну терапевтичну дозу. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що 2,3димеркаптопропансульфонат натрію застосовують одночасно або до, або після прийому ретровіру. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що 2,3димеркаптопропансульфонат натрію застосовують переважно до прийому ретровіру. (19) (21) u200905658 (22) 03.06.2009 (24) 10.02.2010 (46) 10.02.2010, Бюл.№ 3, 2010 р. (72) РОЗЕНФЕЛЬД ВЛАДИСЛАВ ЛАЗАРЬЄВИЧ, ДЯЧЕНКО СЕРГІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, МІХЄЙЦЄВ ОЛЄГ ФЬОДОРОВІЧ, RU, ІВАНОВ АЛЄКСАНДР ВЛАДІМІРОВІЧ, RU (73) РОЗЕНФЕЛЬД ВЛАДИСЛАВ ЛАЗАРЬЄВИЧ, ДЯЧЕНКО СЕРГІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, МІХЄЙЦЄВ ОЛЄГ ФЬОДОРОВІЧ, RU, ІВАНОВ АЛЄКСАНДР ВЛАДІМІРОВІЧ, RU 3 При цьому унітіол вводять в організм до прийому ретровіру, або одночасно з прийомом ретровіру, або після прийому ретровіру. 2,3-димеркаптопропансульфонат натрію (унітіол) - натрієва сіль меркаптоспирту має наступну структуру HC SH HC SH HC SO3Na Відомо застосування унітіолу як антидоту при отруєнні важкими металами (див. Машковский М.Д., Регистр лекарственных средств России, «Энциклопедия лекарств», М., Изд.7, 2000г., с.949). Відомо також застосування унітіолу як інгібітору вірусів герпесу та імунодефіциту людини (див. патент України на винахід №63020, опублікований 15.01.2004р.). З науково-технічної та патентної літератури невідомо застосування унітіолу як засобу для зниження токсичності, яка виникає внаслідок прийому лікарського препарату ретровіру. Приклади застосування способу. Приклад 1. Визначення гострої токсичності здійснювали на білих нелінійних щурах. Групу в кількості 6 самців підібрано випадково методом рандомізації. В якості критерію прийнятності рандомізації вважали відсутність зовнішніх ознак захворювань, гомогенність групи за статтю та вагою тіла від 160 до 180г. В досліді використовували препарат «Ретровір капсули 100мг» (виробництво Сміт Кляйн Бічем Фармасьютікалз, Великобританія, серія №х1750, годен до 05.2012р.), який вводили білим щурам самцям крізь атравматичний металевий зонд у зростаючих дозах, мг/кг: 5000;7500;10000;12500;15000 (в розрахунку на діючу речовину) по Літчфілду - Уілкоксону. Для цього із умісту капсул препарату ретровір одержували водні завісі. Розрахунки середніх летальних доз проводили по В.Б.Прозоровському (див. Фармакологія і токсикологія, 1978, №4, с.с.497-502). Тварини спостерігалися протягом 2 тижнів з початку експерименту. При цьому реєстрували смертність, а також тривалість життя загиблих тварин. Результати наведені в таблиці 1. Приклад 2. Дослідження проводили на другій групі тварин аналогічно тому, як наведено в прикладі 1, але кожній тварині після введення препарату ретровіру через 20 хвилин внутрішньочеревне вводили препарат унітіол в кількості 500мг/кг. Результати наведені в таблиці 2. Приклад 3. Дослідження проводили на третій групі тварин аналогічно тому, як наведено в прикладі 1, але в якості дослідних тварин використовувалися самки білих щурів. Результати наведені в таблиці 3. Приклад 4. Дослідження проводили на четвертій групі тварин аналогічно тому, як наведено в 47460 4 прикладі 2, але в якості дослідних тварин використовувалися самки білих щурів. Результати наведені в таблиці 4. Як видно з даних, наведених в таблицях №№1-4, при введенні ретровіру самцям білих щурів в дозі 10000мг/кг одна тварина з шести гине, а при дозі 15000мг/кг гинуть всі тварини дослідної групи самців. Введення самцям білих щурів додатково унітіолу дозволило збільшити дозу введення ретровіру, тобто при дозі ретровіру 15000мг/кг не загинула жодна тварина. Виявлена закономірність спостерігалася і в дослідах на самках білих щурів, але самки сильніше реагують на токсичність препарату ретровір. Зокрема, при дозі ретровіру 10000мг/кг без застосування унітіолу загинуло дві тварини з шести, а при введені ретровіру в дозі 12500мг/кг у унітіолу одна з шести тварин загинула. Виявилося, що спільне застосування препаратів достовірно знижує токсичність ретровіру у щурів приблизно у 1,5-1,6 разів (збільшує величину ЛД50). Таким чином, наведені дані свідчать, що додаткове введення унітіолу зменшує токсичність препарату ретровір. Приклад 5. Вивчали переносимість при підгострому введенні. В експериментальній групі, яка отримувала ретровір, наприкінці дослідження спостерігалася загибель 2 щурів (на 25 та 27 день дослідження). Це свідчить про наявність у препарату слабких кумулятивних властивостей. Крім того, в цій групі спостерігалося деяке зниження активності тварин, шерсть турів набувала тьмяного відтінку, тварини споживали менше корму. У групах, які отримували комбінацію препаратів ретровір та унітіол, тварини були більш активними протягом всього періоду спостереження, ніж у групі з ретровіром, шерсть щурів була блискучою, тварини регулярно і в повному обсязі споживали їжу. Загибелі тварин не відмічалося. Приклад 6. Вплив препарату на масу тіла білих щурів вивчався протягом 30-денного періоду введення препаратів. Отримані результати представлені в таблиці 5. Аналіз даних, представлених в таблиці 5, показав наступне. Вже на 7-й день дослідження зниження маси тіла у дослідних тварин, які отримували ретровір, по відношенню до контролю в середньому склало 6,3%. В решту періодів спостережень зниження маси тіла в цій групі продовжилося, і на 30-й день дослідження різниця у вазі склала 8,4%. Застосування унітіолу підвищило темпи набору ваги. Найменша різниця у вазі порівняно з контролем була відмічена при профілактичному прийомі унітіолу та склала менше 1%. Приклад 7. Вивчення тривалості гексеналового сну. Функціональний стан печінки оцінювали у самців наприкінці дослідження за тривалістю гексеналового сну. Експеримент проводився в теплому та тихому приміщенні. Тварину зважували та внутрішньочеревинним шляхом вводили розчин гексенала у дозі 90мг/кг, розчинник - 0,9% р-н NaCl. Дані представлені у таблиці 6. 5 Як можна бачити з даних, наведених у таблиці 6, ретровір викликає достовірно значуще підвищення тривалості гексеналового сну. Введення унітіолу знижує тривалість сну, наближуючи його до контрольних величин. Найбільш ефективним виявилося попереднє введення унітіолу в групі 4. Гематологічні і біохімічні показники плазми крові. Гематологічні і біохімічні дослідження крові проводилися наприкінці дослідження. Кров отримували після евтаназії тварин. Отримані дані представлені в таблиці 7. Аналіз показав, що у групі, яка отримувала ретровір, виявилося достовірно зниженими: рівень гемоглобіну - на 17% відносно рівня контрольних груп і рівень гематокриту - на 10%. В цих же групах констатувалося також зниження числа формених елементів крови: еритроцитів - на 20%, тромбоцитів - на 18%, а ось зниження числа лейкоцитів було більш значущим - близько 22%. ШОЕ в цій групі була підвищена вдвічі. Аналіз лейкоцитарної формули показав, що у групі, яка отримувала ретровір, дещо збільшилася частка лімфоцитів за рахунок клітин гранулоцитарного ряду. Однак ці зміни не мають статистично достовірного характеру, і про них можна говорити тільки як про тенденцію. Застосування унітіолу усуває негативні зрушення у гематологічних показниках, які викликані ретровіром. Достовірно значущих відмінностей між контрольними групами та групами, у яких тварини отримували унітіол, не відмічено. Дослідження біохімічних показників крові щурів були виконані наприкінці дослідження, на 30-й день. Результати зведені у таблицю 8. Аналіз отриманих даних виявив достовірні зміни, котрі мали місце в групі, що отримувала ретровір у дозі 1000мг/кг. У цій групі відмічалося зниження загального білку на 9%, достовірне підвищення холестерину (15%), білірубіну (24%), АсАТ (23%), АлАТ (343%), лактатдегідрогенази (25%) та лужної фосфатази (49%). Що стосується інших показників, то міжгрупові відмінності, які мають місце, узгоджуються з гіпотезою, що вони викликані природнім розкидом, притаманним самим показникам та методам їх вимірювання. Унітіол усував токсичні проявлення, викликані ретровіром, та нормалізував показники, які характеризують функціональний стан печінки. Найбільш позитивні зрушення були відмічені у групі, яка отримувала унітіол за 20 хвилин до прийому ретровіру. Проведені патоморфологічні дослідження показали, що розмір печінки тварин, які отримували тільки ретровір, дещо підвищений. В інших групах розмір печінки без змін. Поверхня печінки гладка, однорідного темно-червоного забарвлення, капсула тонка, прозора. Тканина печінки на розрізі повнокровна, помірно щільна. 47460 6 Аналіз отриманих даних показав, що масові коефіцієнти печінки тварин, які отримували тільки ретровір, достовірно підвищені порівняно з контрольними групами в середньому на 23%. Застосування унітіолу нормалізувало цей показник, достовірно значуще знизивши масові коефіцієнти печінки в 4, 5 та 6 групах до контрольних величин. За іншими показниками змін не спостерігалося. Введення тваринам ретровіру призвело до розвитку дифузної дрібнокрапельної жирової дистрофії печінки, яка відповідає низькому ступеню вмісту ліпідів (див. Рисі). На парафінових зрізах, пофарбованих гематоксилін-еозином, на місцях жирових включень спостерігалися дрібні вакуолі. Порушень трабекулярної будови печінки не спостерігалося. Ядра гепатоцитів були чіткими. Епітелій звитих канальців нирок має сліди набухання. Цитоплазма оксифільна, з включенням окремих вакуоль, ядра чіткі,з тонкою мембраною та достатньою кількістю хроматину, клітинні кордони помітні. Капіляри клубочків і судини, що розташовані між канальцями, повнокровні. У групі тварин, котрим вводили ретровір та унітіол, печінка має виражену часточкову будову. Трабекулярна структура часточок порушень не має. Кордони гепатоцитів виразні, цитоплазма зерниста, слабко оксифільна. Осередкових порушень тинкторіальних властивостей цитоплазми немає. Ядра містять чіткі ядерця та достатню кількість хроматину. Синусоїди печінки повнокровні (див. Фіг.2). Таким чином, щоденне внутішньошлункове введення препарату ретровір супроводжується розвитком дистрофічних змін у печінці, які проявляються у вигляді легкого ступеню жирової дистрофії. В інших гістологічних препаратах внутрішніх органів цієї групи змін не виявлено. У поєднанні з унітіолом ретровір не викликає подразнення, запалення або деструкції тканин шлунково-кишкового тракту, а також не супроводжується розвитком дистрофічних, деструктивних, осередкових склеротичних змін в паренхіматозних клітинах і стромі внутрішніх органів. Були також проведені дослідження щодо впливу порядку введення в організм унітіолу. Досліди проводили на групі щурів, яка включала 24 тварин. Групу розділили на дві підгрупи по 8 тварини в кожній підгрупі. Тваринам І підгрупи унітіол вводили за 20 хвилин до введення ретровіру. Тваринам II підгрупи унітіол вводили одночасно з введенням ретровіру. Ретровір і унітіол вводили в дозах, аналогічних тим, що наведені в прикладах 1, 2. Отримані результати підтвердили ефективність введення в організм тварини унітіолу з метою зменшення токсичності, яка виникає внаслідок застосування ретровіру. Ефективність проявляється при одночасному введенні, після введення ретровіру і до введення ретровіру. При цьому невелику перевагу має введення унітіолу за 20хв. до прийому ретровіру. 7 47460 8 Таблиця 1 Токсичність препарату ретровір при гострому внутрішньочеревному введенні щурам-самцям Доза, мг/кг 5000 Ефект, загинуло/всього 0/6 7500 Ретровір 0/6 10000 12500 15000 1/6 4/6 6/6 Ретровір ЛД50=11950±400мг/кг ЛД16=9750±550мг/кг ЛД84=14000±700мг/кг Таблиця 2 Токсичність препарату ретровір при додатковому введенні унітіолу при гострому внутрішньочеревному введенні щурам-самцям Доза, мг/кг 10000 Ефект, загинуло/всього 0/6 12500 15000 Ретровір + Унітіол 0/6 0/6 20000 25000 3/6 6/6 Ретровір + Унітіол ЛД50=18700±750мг/кг ЛД16=14200±950мг/кг ЛД84=23500±1200мг/кг Таблиця 3 Токсичність препарату ретровір при гострому внутрішньочеревному введенні щурам-самкам Доза, мг/кг 5000 Ефект, загинуло/всього 0/6 7500 Ретровір 0/6 10000 12500 15000 2/6 3/6 6/6 Ретровір ЛД50=11850±465мг/кг ЛД16=8500±700мг/кг ЛД84=16850±800мг/кг Таблиця 4 Токсичність препарату ретровір при додатковому введенні унітіолу при гострому внутрішньочеревному введенні щурам-самкам Доза, мг/кг 10000 Ефект, загинуло/всього 0/6 Ретровір + Унітіол ЛД50=17200±550мг/кг ЛД16=12700±650мг/кг ЛД84=21500±1100мг/кг 12500 15000 Ретровір -+- Унітіол 1/6 2/6 20000 25000 4/6 6/6 9 47460 10 Таблиця 5 Вплив підгострого введення препарату унітіол на масу тіла білих щурів, які отримували ретровір (г, М±m) Терміни досліджень (дні) Фон 7-й день 14-й день 21-й день 30-й день Інтактн. Контроль 188,5±2,7 192,9±3,4 203,0±4,3 206,8±4,3 208,2±3,8 188,3±1,6 193,8±2,4 202,7±2,0 204,0±2,1 206,2±2,4 Експериментальна група Ретровір + унітіол (групи) Ретровір 4 5 6 189,3±2,5 189,0±2,4 187,8±2,2 189,4±2,1 181,7±2,5 192,0±2,3 189,9±2,2 190,9±2,3 183,7±3,0 201,6±2,7 199,0±2,6 198,2±2,6 186,6±3,0 204,8±2,1 201,8±2,8 200,4±3,1 190,8±3,0 205,0±2,4 203,5±3,3 202,0±3,2 Таблиця 6 Вплив препарату унітіол на тривалість гексеналового сну у білих щурів, які отримували ретровір (хв., М±m) Терміни досліджень (дні) Фон 30-й день Інтактн. Контроль 41,8±6,0 39,3±5,5 44,4±3,9 40,3±3,5 Експериментальна група Ретровір + унітіол (групи) Ретровір 4 5 6 39,9±4,3 43,1±5,6 40,3±2,4 42,3±3,4 48,2±3,0* 39,7±5,2 42,2±6,1 44,2±6,1 * - достовірні відміни від контрольних (плацебо) тварин при р