Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями

1. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями, який відрізняється тим, що спочатку проводять ферментативний гідроліз білків, а потім проводять процес ацилювання (алкілювання) отриманих пептидів та використовують отриману суму ацильованих олігопептидів для застосування у лікуванні вірусних інфекцій людей і тварин. 2. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують овальбумін. 3. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують людський сироватковий альбумін. 4. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують бичачий сироватковий альбумін. 5. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують імуноглобулін G людини. 6. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують імуноглобулін М людини. 7. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують кролячий сироватковий альбумін. 8. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих пептидів з противірусними властивостями за п. 1, де як білок - об'єкт для ферментативного гідролізу використовують лізоцим. 2 (19) 1 3 51123 4 20. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих отриманих олігопептидів використовуються цис- і пептидів з противірусними властивостями за пп. 1трансаконітовий ангідриди. 11, де як фермент для ферментативного гідролізу 30. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих білків використовується еластаза. пептидів з противірусними властивостями за пп. 121. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується глута11, де як ферменти для ферментативного гідроліровий ангідрид. зу білків використовується сума ферментів з пп. 31. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 12-20. пептидів з противірусними властивостями за пп. 122. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується фтале21, де як ацилюючий агент для проведення процевий ангідрид. су ацилювання отриманих олігопептидів викорис32. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих товується оцтовий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 123. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується лимон21, де як ацилюючий агент для проведення процений ангідрид. су ацилювання отриманих олігопептидів викорис33. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих товується пропіоновий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 124. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується ізоли21, де як ацилюючий агент для проведення процемонний ангідрид. су ацилювання отриманих олігопептидів викорис34. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих товується бутановий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 125. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується ацети21, де як ацилюючий агент для проведення процелхлорид. су ацилювання отриманих олігопептидів викорис35. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих товується оцтово-пропіоновий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 126. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується ацети21, де як ацилюючий агент для проведення процелфторид. су ацилювання отриманих олігопептидів викорис36. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих товується оцтово-бутановий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 127. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується пропіо21, де як ацилюючий агент для модифікації суми нілхлорид. отриманих олігопептидів використовується бурш37. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих тиновий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 128. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується бутиро21, де як ацилюючий агент для модифікації суми їлхлорид. отриманих олігопептидів використовується малеї38. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих новий ангідрид. пептидів з противірусними властивостями за пп. 129. Спосіб синтезу суми хімічно модифікованих 21, де як ацилюючий агент для модифікації суми пептидів з противірусними властивостями за пп. 1отриманих олігопептидів використовується етоксі21, де як ацилюючий агент для модифікації суми оксалілмонохлорид. Корисна модель відноситься до ветеринарії та медицини, а конкретно до вірусології, та може бути використана в лікування вірусних інфекцій тварин та людини. Вірусні хвороби складають більш 90% всієї зареєстрованої інфекційної патології. Але противірусних засобів, які впроваджені у виробництво, дуже мало. Такі речовини часто мають токсичні властивості, невеликий спектр дії, до них швидко з'являється ефект звикання. Таким чином, розробка противірусних засобів, які б не мали токсичних властивостей, були ефективними в лікуванні широкого спектру вірусних інфекцій, є актуальною задачею сучасної медицини. Зараз відомо дуже мало речовин, які б мали лікувальну дію на всіх етапах вірусної інфекції. Окрім інтерферонів та їх індукторів ще не відомо таких речовин, які б одночасно обіймали лікувальні та противірусні властивості відносно широко розповсюджених вірусних захворювань - СНІДу, герпесу, грипу та ін. Найбільш відомим засобом для лікування грипу є ремантадин [1]. Це речовина, яка блокує тільки етап проникнення вірусу в клітину і ранню стадію специфічної репродукції, не діє на патогенез захворювання. Довготривале використання цього препарату неможливе, бо він має нейротропні ефекти та може викликати галюцинації, порушувати функції мозку завдяки гальмуванню проведенню імпульсу по нервовому волокну. Серед інших речовин, ефективних у лікуванні грипу, відомий лейкоцитарний - інтерферон [2]. Цей білок синтезується в активованих лейкоцитах 5 51123 6 людини. Він має здатність викликати резистентнізмом дії, використання яких дозволить значно ність до грипу у клітин епітелію носоглотки. Але збільшити ефективність лікування та скоротити його лікувальні властивості дуже незначні. Він матерміни лікування вірусних захворювань, таких як лоефективний на 2-6-й день захворювання грипом грип та герпесвірусні інфекції. та є профілактичним засобом. Рекомбінантні інтеПоставлена задача вирішується шляхом синрферони мають велику вартість та часто призвотезу хімічно модифікованих пептидів, а також їх дять до алергічних реакцій. Окрім того, з розвитвикористання для контролю вірусних інфекцій, ком захворювання ефективність спосіб синтезу відрізняється тим, що спочатку інтерферонотерапії зменшується, а резистентність проводять ферментативний гідроліз білків а потім вірусу до інтерферону збільшується. проводять процес ацилювання (алкилювання) Найближчим прототипом речовини, що патенотриманих пептидів та використовують отриману тується, є модифіковані білки та їх використання суму ацильованих олігопептидів для застосування для контролю вірусних інфекцій [3]. Це оброблені у лікуванні вірусних інфекцій людей і тварин. різними ангідридами та ацилюючими засобами Синтезовані олігопептиди здатні гальмувати білки: альбуміни, лактоферін, трансферін, лактаактивність гетеродимеру - - імпортинів клітини, льбумін. Автори запатентували також механізм дії які транспортують вірусні полінуклеотиди з цитоцих білків - гальмування вірусної адгезії. Ці білки плазми до ядра [4]. Відповідно гальмування цих повинні мати молекулярну масу більше 60000 з транспортних білків призведе до блокади вірусів, невеликим коливанням. Показана значна цитопрореплікація яких залежних від функцій ядра клітини. текторна дія цих білків в дослідах на культурах Окрім того, препарат ефективний при пероральклітин. Речовини проявили активність відносно ному застосуванні. вірусів СНІДу (людини та мавпи), грипу, цитомегаДля синтезу (ацилування/алкилювання) моловірусу, поліовірусу, вірусу лісу Селміки, вірусу жуть бути використані такі білки: овальбумін (ОА), Сендай, парагрипу, Коксакі вірусу. Автори показалюдський сироватковий альбумін (ЛСА), бичачий ли, що ацильовані білки нетоксичні і можуть захисироватковий альбумін (БСА), суміш молочних щати тварин проти інфікування вірусами. білків (СМБ), кролячий сироватковий альбумін Прототип має ряд недоліків: він є суто профі(КСА), лізоцим (ЛЦ), лактоальбумін (ЛА), казеїн лактичним засобом (на клітини, що вже інфіковані (КЗ), соєвий білок (СБ) та їх суміш. вірусом такі білки впливу не мали) та не має лікуДля ферментативного гідролізу можуть вальних властивостей у інфікованих тварин. У бути використані пепсин, трипсин, хімотрипсин, зв'язку з тим, що прототип є високомолекулярним папаїн, протеїназа К, клострипаїн, тромбін, термобілком, він може бути використаний тільки паренлізин, еластаза. терально. Як ацилюючі агенти в синтезі можуть бути виВ основу винаходу поставлена задача синтекористані: зувати суміш хімічно модифікованих олігопептидів з противірусними властивостями та з новим меха H3 C O H3 C O Оцтово-пропіоновий ангідрид O H3 C C H2 O H2 C C H3 C O H2 Малеїновий ангідрид O Бутановий ангідрид H2 O C H3 C C H2 O H2 C C H3 C O H Пропіоновий ангідрид O H3C C H2 O H2 C H3C O Оцтовий ангідрид O 2 Оцтово-бутановий ангідрид O H3 C C H2 O H H3 C H2 C 2 C C H2 O Глутаровий ангідрид O Бурштиновий ангідрид O O O Фталевий ангідрид O O O O O O O 7 Цис- і трансаконітовий ангідриди COOH O 51123 8 Лимонний ангідрид O OH O HOOC O O Пропіонілхлорид H3C O Ацетилфторид O Ацетил хлорид O H3C H3C Cl H2C F Етоксиоксалілмонохлорид H3C Бутіроїлхлорид H2 C O HOOC O O H3 C Ізолимонний ангідрид HO O O O F O H2C Cl В експерименті була підтверджена ефективність препарату при грипі, герпесі, на моделях in vivo та in ovo, що описані нижче. Приклад 1. Спосіб отримання суміші ацильованих пептидів (АП) з антивірусними властивостями, що здатні до самоорганізації на імпортинах. В асептичних умовах 500 мг овальбуміну розчиняють в 50 мл дистильованої води, доводять рН до 8,0 1М розчином гідрооксиду натрію, додають 5 мг папаїну, залишають розчин на 3-45 годин, спостерігається гідроліз овальбуміну з утворенням суміші пептидів. До цієї суміші додають 501-2000 мг аконітового ангідриду, перемішують при температурі 16-65°С 20 хвилин. Суміш пропускають через мембранні фільтри з метою стерилізації та розливають у скляні флакони. Приклад 2. Підтвердження механізму дії АП. Універсальним білком, який транспортує вірусний полінуклеотид (РНК чи ДНК) до ядра клітини, є гетеродимер - - імпортинів [8]. Основний транспортний компонент цієї системи - імпорт має консервативну сигнальну послідовність амінокислот, яку впізнають білки ядерної пори та відкривають її для проходження комплексу нуклеопротеїдтранспортний білок. Ця послідовність відома, її структура та функції підтверджені [6]. -PRO-PRO-LYS-LYS-LYS-ARG-LYS-VALОтримана сума кислих ацильовних олігопептидів (АП) блокує саме цю сигнальну послідовність. Для підтвердження механізму дії АП ми використовували ДНК вірусу простого герпесу 1 типу штамм Л-2. ДНК виділяли за відомою методикою [5]. Кон'югацію ДНК з частинками колоїдного золота проводили за методом [6]. Отриманий комплекс вводили до ліпосом за методом [7]. Докладно експеримент був описаний з вірусом SV40 мавпи в [8]. Такі ліпосоми зливалися з мембранами клітин з культури курячих фібробластів. Після об'єднання ліпосом з мембраною клітин, ДНК вірусу з частками золота потрапляла до цитоплазми. O Cl Гетеродімер - - імпортинів переносив колоїдні частки з полінуклеотидом до ядерних пор. Якщо клітини інкубували з АП, що патентуються, то накопичення часток колоїдного золота на ядерних порах не спостерігалося. Всі частки рівномірно розподілялися по цитоплазмі клітин. В цьому випадку цитопатичної дії вірусу не спостерігалося. Таким чином, спроектована та синтезована сума олігопептидів гальмує постачання вірусної ДНК в клітинне ядро, що і необхідно було підтвердити. Приклад 3. Підтвердження лікувальної дії АП на білих мишах з герпетичним енцефалітом. 20 білих мишей Balb-C інфікували внутрішньочеревно летальною дозою 0,01 мл 7,0 lg ВПГ1 штам Л2 . Через 2 доби у більшості тварин з'явилися ознаки енцефаліту: порушення рухової активності, зменшення споживання їжі, судоми. Лікування починали на другу добу після інфікування. АП використовували перорально в дозі 10 мг/кг ваги тварин два рази на добу 5 діб. Як контроль використовували інфікованих тварин (20 голів), яким давали 0,9% розчин натрію хлориду (вводився перорально в тому ж об'ємі) . Основним критерієм ефективності препарату був відсоток тварин в основній групі, що вижили на 17 добу, проти контролю. В дослідній групі тварин, яким давали препарат, загинуло тільки 2 тварини з 20 (10%), тоді як в контрольні групі загинуло 18 з 20 тварин ( 90%). На другий день після початку лікування АП симптоми герпетичного енцефаліту зникали. Таким чином, препарат мав чіткий терапевтичний ефект у лікуванні герпетичного енцефаліту у мишей. Приклад 4. Лікувальна дія препарату на моделі герпетичного офтальмогерпесу (ОГ) у кролів Найбільш зручними для відтворення ОГ і оцінки ефективності хіміопрепаратів є моделі герпетичного кератиту і кератокон'юнктивіту у кролів [9]. ВПГ-1 штам L2 використовували у вигляді культуральної рідини зараженої культури клітин Нер-2. 9 51123 10 Максимальне значення інфекційного титру склаПрепарат вводили через 48 годин після інфідало 5,0 - 5,5 lg LD50/0,03 мл. кування в дозі 0,01 г препарату на кроля 3 рази на Використовували кролів обох статей вагою 2,5 добу перорально в розчині на дистильованій воді. кг. Для створення моделі ОГ очі кролям промивали Аналогічно, але парентерально (у вушну вену) фізіологічним розчином і обезболювали дикаїном, вводили препарат з прототипу та 0,9% розчин назакапуючи його у кон'юнктиву. ВПГ-1 у інфекційній трію хлориду. дозі (6-7 крапель) наносили на скарифіковану рогіУ 90% кролів контрольної групи виразність вку. Контроль склали дві групи тварин: інфіковані лише кон'юнктивіту становила 3-4 бали. Триватварини, яким вводили 0,9% розчин натрію хлорилість симптоматики - в середньому становила 21 ду та група тварин, яким вводили препарат з продень. Максимального розвитку вона досягала на 4тотипу. 8 день (СІВС рівні 8-10 балам) Інтенсивність клінічної симптоматики ОГ кроКритеріями оцінки лікувального ефекту препаликів оцінювали по 4-бальній системі для кожного ратів були: а) зменшення виразності клінічної симсимптому, які потім сумували. Оцінку ефективності птоматики; б) скорочення тривалості захворюванхіміопрепаратів проводили з врахуванням різниці у ня; в) запобігання летального менінгоенцефаліту. виразності симптоматики (СІВС в балах) у досліді і Дані про ефективність досліджуваних препаратів контролі. представлені у таблиці 1. СІВС у контролі (неліковані тварини) приймали за 100%. Таблиця 1 Ефект лікування хворих кролів АП Назва препарату АП Контрольний препарат з прототипу Нелікований контроль Кількість тварин 7 7 5 Тривалість захворювання (дні) 7,5±2,5* 25,5 ± 2,5* 26 ± 2,5** СІВС (бали) 36,3±4,8 100 2 109,2 2,2 * Р