Спосіб отримання полімерних матеріалів

1 Спосіб отримання полімерних матеріалів, який включає обробку крохмалю хлорним залізом, фосфорною кислотою, пероксидом водню, силікатом натрію, який відрізняється тим, що додатково включає обробку крохмалю різними комбінаціями солей металів з перемінною ва лентністю, фосфористою, метафосфорною, фосфорнуватистою, фосфорновольфрамовою, фосфорномолібденовою, сірчаною, азотною, соляною кислотами або/і кремнієвою, кремніємолібденовою, кремнієвольфрамовою кислотами або їх солями при наступному співвідношенні крохмалю, солей металів з перемінною валентністю, фосфорних кислот, пероксиду водню, кремнієвих кислот та їх солей 1 5 10 5 -210Ь510-21015102-21012,5 102-1101 при температурі 15-45°С і водному середовищі 2 Спосіб по п 1, який відрізняється тим, що дані полімерні матеріали використовують як замінники агар-агару або плівкотвірні в концентрації 50-200 г/л Винахід належить до виробництва і застосування полімерних матеріалів, що мають гелеутворюючі властивості для спеціалізованого використання у сільському господарстві, сільськогосподарській біотехнологм рослин, мікробіологи, медицині, ветеринарії і інших галузях народного господарства Раніше (пріоритет матеріалів заявки на патент № 96031166/04 (6609) від 27 03 96) нами був описаний спосіб отримання модифікованого крохмалю солями кремнеземової кислоти у присутності перекису водню, фосфорної кислоти і хлорного заліза Спосіб отримання полімерних матеріалів та їх використання у сільськогосподарській біотехнологм і інших галузях народного господарства Винахід належить до виробництва і застосування полімерних матеріалів, що мають гелеутворюючі властивості для спеціалізованого використання у сільському господарстві, сільськогосподарській біотехнологм рослин, мікробіологи, медицині, ветеринарії і інших галузях народного господарства Раніше (пріоритет матеріалів заявки на патент № 96031166/04 (6609) від 27 03 96) нами був опи саний спосіб отримання модифікованого крохмалю солями кремнеземової кислоти у присутності перекису водню, фосфорної кислоти і хлорного заліза Для розвитку даного напрямку нами розширено асортимент вихідних матеріалів Для цієї мети було використано, взамін раніше запропонованого тільки хлорного заліза, солі органічних і неорганічних кислот всіх металів з перехідною валентністю, а в якості кислого агента були взяті фосфорна, фосфориста, метафосфорна, фосфорноватиста, фосфорновольфрамова, фосфорномолібденова, сірчана, азотна і соляна кислоти, в якості кремнійвмісних сполук були взяті не тільки різні солі кремнійової кислоти, а й кремніймолібденову, кремнійвольфрамову кислоти і їх солі Найближчими аналогами по дії є 1) агар-агар - еталон-1 [1] або його ПОХІДНІ (наприклад, агароза), які рекомендовані для використання при вирощуванні в асептичних умовах рослинних об'єктів на штучних поживних середовищах, 2) ВІДМІННІ за ХІМІЧНОЮ побудовою від агар агару ІНШІ фітогельні агенти поживних середовищ, наприклад фітогель "Gelnte" еталон-2, який пропо CO о сч Ю 52031 нується компанією "Sigma" (США) для застосуванЗОмг кобальту хлорного, 20г фосфорномолібденоня у бютехнолопчних дослідженнях воі кислоти, 2мл сірчаної кислоти і Юмл перекису водню отримують продукт наступного складу, % С Головними недоліками еталону-1 і еталону-2 -44,18, Н-6,28, Р-0,018 Динамічна в'язкість 1% є розчину — 6,9МПа-с, кислотність - 1,65ммоль на - іноземне виробництво, висока закупівельна 100г вартість і відсутність вітчизняної сировини для налагодження технології виробництва в Україні, Спосіб 5 100г картопляного крохмалю суспен- використання еталону-1 у бютехнолопчних зують в 700мл води, до суспензії додають 40мг дослідах підвищує собівартість виробництва окрехлорного заліза, Юмл перекису водню, 5г силікату мих технологічних процесів, пов'язаних з вирощунатрію і 28г фосфорно вати сто і кислоти Реакційну ванням in vitro рослинних об'єктів, особливо, якщо суміш перемішують 4 години при 45°С, фільтруце потрібно проводити у великих об'ємах, ють, а осадок промивають водою Висушують на повітрі ХІМІЧНИЙ склад продукту, % С - 44,45, Н -використання еталону-2 у проведених нами 6,35, Р - 0,02, Si - 0,23 Динамічна в'язкість 1% бютестах виявило деякі суттєві недоліки цього розчину при 20°С становить - 13,8 мПа-с, кислотпрепарату, зокрема у ініціації вітрифікації вегетаність - 1,7ммоль на 100г тивного потомства різних овочевих культур при застосуванні у технології мікроклонального розСпосіб 6 За умов досліду описаному в способі множення рослин in vitro 5 із 100г картопляного крохмалю 700мл води, ЗОмг Завданням запропонованого винаходу є розхлорногозаліза, 15мл перекису водню, 40г натрієробка високоактивних полімерних матеріалів, вої солі кремніймолібденової кислоти, Юмл фосстворених на основі широкого асортименту вихідфорної кислоти отримують продукт наступного них ХІМІЧНИХ сполук для застосування у бютехноскладу, % С - 4 4 , 2 1 , Н -6,18, Р - 0 , 0 2 1 , Si - 0 , 1 логм Динамічна в'язкість 1% розчину при 20°С становить 13,1мПа-с, кислотність - 2 Іммоль на 100г Поставлена задача вирішується тим, що в якості модифікаційних реагентів крохмалю викориСпосіб 7 За умов досліду описаного в способі стовують різні солі металів з перемінною валентні5 із 100г картопляного крохмалю, 700мл води, стю, фосфорну, фосфористу, метафосфорну, фо50мг хлористої МІДІ, 15мл перекису водню, 5г СІЛІсфорноватисту, фосфорновольфрамову, кату натрію,28г фосфорноватої кислоти отримують фосфорномолібденову, сірчану, азотну і соляну продукт наступного складу, % С - 44,61, Н - 6,22, кислоти, пераксидводню або і кремнійову, кремР - 0,025, Si - 0,24 Динамічна в'язкість 1% розчиніймолібденову, кремніцвольфрамову кислоти або ну— 13,5мПа-с, кислотність - 2,2ммоль на 100г їх солі у співвідношенні Приклад 2 Тестування препаратів на фізіоло1 5-105-2-103 5-102-2-101 5-Ю 1 2,5-102-8-101 гічну активність у бютехнолопчних дослідженнях при температурі 15-45°С і водному середовищі При формуванні de novo рослин в культурі ізоДля кращого розуміння винаходу наводяться льованих тканин in vitro слід враховувати що у конкретні приклади процесі морфогенезу відбувається специфічна Приклад 1 Спосіб отримання модифікованих взаємодія "екс-плант-середовище", як єдиної біокрохмалі в логічної системи, яка може бути лише наближеною Спосіб 1 100г картопляного крохмалю суспенкопією тих процесів, які відбуваються у природних зують в 700мл води, до цієї суспензії добавляють умовах регенерації або вегетативного розмножен20 мг хлористого кобальту (шестиводного), Юмл ня рослин перекису водню і Юмл 85% фосфорної кислоти Згідно сучасних уяв основними кофакторами Суспензію ефективно переміщують при темпераформоутворення in planta є фізіологічні процеси, турі до 35°С 8 годин Після ЦЬОГО реакційну масу які виконують функцію підтримання полярної струвідстоюють, деканту-ють, осадок три рази таким ктури рослинного організму Серед них базипетачином промивають водою Висушують на повітрі льний транспорт ауксину, акропетальний рух ХІМІЧНИЙ склад продукту, % С - 44,5, Н - 6,3, Р кальцію, аксиальні градієнти біопотенціалів [1] 0,015 Динамічна в'язкість 1%-го розчину при 26°С Відомо, ЩО регуляторна роль ауксина пов'язана в становила 6,88мПа-с, кислотність даного продукту спланованій у часі експресії життєвоважливих становила - 1,28ммоль на 100г процесів Зокрема, у ініціації роботи Н+-помпи, яка підсилює поглинаючу активність тканин і ініціацію Спосіб 2 За умов досліду описаного в способі входження у клітину водних розчинів осмотично 1 із 100г картопляного крохмалю, 700 мл води, 20 активних речовин у антипорті з іонами водню [3] мг хлористого марганцю, Юмл 85% фосфорної Осмотичний фактор виконує важливу роль у водкислоти і Юмл перекису водню отримують продукт ному транспорті в рослинах На відміну від існуюнаступного складу, % С-44,25, Н — 6,2, Р-0,012 чого вертикального градієнту осмотичноактивних Динамічна в'язкість 1% розчину - 6,75мПа-с, кисречовин (від коренів до верхівки пагона), акропелотність - 1,37ммоль на 100г тальний транспорт кальцію потрібен для роботи Спосіб 3 За умов досліду описаного в способі кальмодулінової системи, секреції, а також для 1 із 100г картопляного крохмалю, 700мл води, підтримання ростового розтягнення і поділу мери25мг однохлористої МІДІ, 5Г двохзаміщеного фосстематичних клітин в апекальній зоні фату натрію, 4мл сірчаної кислоти і Юмл перекису водню отримують продукт наступного складу, % С Сучасна експериментальна практика добору -44,35, Н-6,27, Р-0,015 Динамічна в'язкість 1% умов культивування in vitro потребує проведення розчину — 6,8мПа-с, кислотність- 1,4ммоль/100г додаткового вивчення кожного кофактору окремо або їх комбінованої дії на реалізацію морфогенеСпосіб 4 За умов досліду описаного в способі тичних програм культивованих експлантів рослин1 із 100г картопляного крохмалю, 700мл води, 52031 них тканин При цьому дія того чи іншого кофактору визначається ступенем його присутності у поживному середовищі (за аналогією законові "Лімітуючих факторів Лібіха", який враховує елементи мінерального живлення рослин в умовах вирощування на відкритому грунті) Наслідком саме такого експериментального підходу є уявлення про існування критичного періоду біологічної системи "експлант-середовище" найбільш вразливому до недостатньої дії одного з факторів або їх комбінованої дії на кінцевий результат - отримання фенотипічно нормальних рослин-регенерантів після завершення циклу культивування БІЛЬШІСТЬ штучних поживних середовищ, що використовуються для культивування in vitro тканин чи органів рослин мають усі мінеральні і осмотичні компоненти за допомогою яких можливо регулювати важливі фізіологічні процеси морфогенезу Регуляторна роль гельних агентів у цьому аспекті пов'язана, перш за все, з забезпеченням належних умов для реалізації обмінних процесів, які відбуваються між культивованим рослинним об'єктом та поживним середовищем для вирощування Методика проведення досліду по бютестуванню запропонованих фітогельних агентів поживних середовищ_ Для визначення фізіологічної дії запропонованих фітогельних агентів використовувались сорти овочевих культур селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААН Зокрема, білоголової капусти (сорт Леся), томату (сорт Світанок pS), огірка (сорт Джерело) і цибулі ріпчастої (сорт Мавка) Препарати оцінювали у дослідах по мікророзмноженню (тобто при при вирощуванні in vitro на штучних поживних середовищах експлантів меристе-матичних тканин) У попередніх дослідах були визначені елементи технології мік-ророзмноження рослин кожної овочевої культури, пов'язані з добором трофічних, осмотичних і фітогормональних компонентів поживних середовищ Зокрема, для капусти білоголової використовувалось модифіковане середовище Шенка-Хільдебрандта (ШХ, 1972 [4]), для цибулі ріпчастої - Гамборга В5 (БДС, 1979 [5]), для огірка і томату - Мурасіге і Скуга (МС, 1962 [6]) Приготування поживних середовищ, а також досліди по вирощуванню in vitro проводилось за загальноприйнятими методиками запропонованими у роботах [7, 8] (див табл 1) Для всіх відібраних сортозразків овочевих культур мікророзмноження проводилось утри етапи 1) попереднє вирощування в асептичних умовах розсади на безгормональних поживних середовищах протягом одного місяця, 2) живцювання ювенільних рослин на сегменти з вмістом меристематичних тканин і висадка отриманих експлантів на поживні середовища для індукції адвентивних пагонів (див табл 2), 3) відокремлення сформованих de novo адвентивних пагонів від донор-них меристематичних тканин, їх подальша висадка і дорощування на поживних середовищах для укорінення Оцінка фізіологічної дії запропонованих гельних агентів проводилась з урахуванням взаємодії "експлант-поживне середовище", як єдиної біологічної системи Тому, окрім фенологічних спостережень за розвитком, отриманого in vitro вегетативного потомства, додатково проведено вивчення впливу різних гельних агентів на динаміку іонообмінних процесів, які спостерігалися протягом циклу культивування між культивованим експлантом та середовищем А саме методом колориметричного визначення рН проведено вимірювання фізіологічного рН протягом 2-го етапу культивування (від стадії висадки експлантів тканин на поживне середовище до індукції адвентивних пагонів) 3 цією метою було використано спосіб реєстрації рН, описаний у роботі [9], який передбачає застосування індикатора рН метилового червоного (метил рот) для забезпечення реєстрації фізіологічного рН в межах 4,4-6,2 [9] Вивчення гельних агентів, як еталонних так і запропонованих, проводилось під час 2-го і 3-го етапів мікророзмноження рослин Результати фенологічних спостережень за розвитком культури in vitro представлені за результатами одного (першого) пасажу Під час тестових аналізів враховувались такі статистичні показники формування вегетативного потомства коефіцієнт розмноження (КР) - КІЛЬКІСТЬ утворених адвентивних пагонів на один культивований експлант тканини, процент невітрифікованих адвентивних пагонів з нормальним фенотипом Процент сформованих de novo рослинрегенерантів, що мали некрози тканин корінців, пов'язані з незворотнім процесом підкислення поживного середовища, внаслідок обмінних процесів між рослинами і середовищем для вирощування Для підрахунку КР використовували статистичний спосіб оцінки результатів досліджень, який враховував дискретне варіювання ознаки, що контролювалася Для одного варіанту досліду, процент невітрифікованих адвентивних пагонів брався від загальної суми сформованих пагонів, як з нормальним, так і аномальним (вітрифікованим) фенотипом Для сортозразка овочевої культури процент некротизацм тканин корінців брався від загальної суми висаджених експлантів меристематичних тканин для індукції адвентивних пагонів у 2-му циклі культивування Індикатор рН - метиловий червоний розчиняли у етиловому спирті і додавали у поживні середовища після автоклавування і охолодження останніх до 40-50°С Повторність кожного варіанту досліду трьохкратна Порівняльний аналіз бютестів еталонних і аналізованих полімерних (гель-них) матеріалів_ Як зазначено вище, для використання у бютестах було використано два полімерних матеріали (ДККмод і БД-1 а - модифіковані крохмалі, одержані по способу 4 і 6 в опису прикладу 1) Результати вивчення фізіологічного впливу вище-наведених і еталонних препаратів на процеси росту і розвитку рослинних об'єктів на 2-му і 3-му етапах мікророзмноження сортозразків овочевих культур представлені у таблиці 3 Як свідчать ці дані, головною 52031 8 особливістю рослин, які вирощували на двох заземних частин експлантів на 2-му етапі мікророзмпропонованих замінниках агар-агару (ДККмод і БДноження фітогель "Gelnte" у капусти білоголової і 1а), було збереження їх нормального росту і розцибулі ріпчастій відмічено 100% вітрифікацію адвитку без будь-яких наявних ознак некротиза-цм вентивних пагонів, у томатів - 87,4%, огірка тканин, пов'язаних з незворотнім процесом закис34,5% Слід відзначити покращання показника КР лення поживного середовища внаслідок іонних (коефіцієнту розмноження) для деяких овочевих обмінних процесів На 2-му етапі культивування, культур, особливо - цибулі ріпчастій і огірка У де за умов досліду рослини протягом двох МІСЯЦІВ капусти білоголової спостерігалось незначне знине пересаджували на свіже поживне середовище, ження КІЛЬКОСТІ сформованих адвентивних пагонів, відмічено відсутність некротизацм тканини корінців але при цьому вітрифікація була відсутня, тому у і збереження нормального фенотипу сформованих загальному плані слід відзначити позитивний реde novo пагонів усіх сортозразків овочевих кульзультат застосування гельних препаратів ДККмод тур Тоді, ЯК при застосуванні агар-агару некротита БД-1а для цієї культури Однією з імовірних призація коренів томатів досягала майже 100%, на чин збереження нормального (невітрифікованого) фітогелі "Gelnte" - 78,3 % Дія інших овочевих фенотипу овочевих культур протягом довготривакультур ці показники негативного впливу закислого вирощування без пересадки можуть також лення поживного середовища були дещо нижчі, бути високі осморегуляторні властивості запропоале при застосуванні препаратів ДККмод і БД-1 а нованих гельних агентів некротизація коренів була відсутня у всіх сортоНа 3-му, заключному етапі культивування, бюзразків овочевих культур тести препаратів на поживних середовищах для укорінення адвентивних пагонів виявили аналогічАналіз динаміки зміни фізіологічного рН свідні вищенаведеним ефекти по осмо- і протонній чить про наявність високих буферних властивосрегуляції процесу вирощування рослинтей обох препаратів на відміну від агар-агару та регенерантів Додатковим позитивним моментом у фіто-гелю "Gelnte" (табл 3) Оскільки у бютестах використанні препаратів ДККмод і БД-1 а слід відвикористовували гормональні середовища для значити те, що на етапі укорінення пагонів мікророзмноження, то додатково слід відзначити позитивний ефект запропонованих препаратів на дорощування не потребувало застосування нормалізацію водного обміну адвентивних пагонів повторних пасажів для адаптації рослинз поживним середовищем для культивування Так, регенерантів до умов in vivo Тим самим знижувапри застосуванні агар-агару відсоток вітрифіковались норми розходу інших компонентів поживних них пагонів томату складав 14,57 %, цибулі ріпчассередовищ і зменшувалась загальна собівартість тої - 11,4%, капусти білоголової - 43,7%, огірка технологічного процесу мікророзмноження овоче23,1% Особливо, стимулював вітрифікацію надвих культур Таблиця 1 Протоколи поживних середовищ для культивування експлантів меристематичних тканин овочевих культур (без урахування вмісту фітогормонів) Компоненти, мг/л 1 (NH4)2S04 KNO3 NH4NO3 Ca(NO3)2-4H20 СаСІ2-2Н20 MgS04-7H20 КН2Р04 NaH2P04-H2O КСІ Ма2ЭДТА FeSO4-7H2O НзВОз MnSO4-5H20 ZnSO4-7H2O Na2MoO4-2H2O KJ CoCI2-6H2O MC 2 Макроелементи 1900 1650 440 370 170 Fe-хелат 37,3 27,8 Мікроелементи 6,2 24,1 8,6 0,25 0,83 0,025 ШХмод 3 БДС 4 670 2125 400 354 200 134 2500 750 250 150 37,3 27,8 37,8 27,8 11,2 16,9 5,0 0,25 0,83 3,0 10,0 2,0 0,25 0,75 0,025 ОД Продовження табл 1 52031 10 МС 2 ШХмод 3 БДС 4 0,025 Компоненти, мг/л 1 CuSO 4 -5H 2 O 0,25 0,025 Вітаміни та ІНШІ біологічно активні речовини 100 1000 2 2 10 ОД 0,5 1 0,5 1 200 800 мезошозит ГЛІЦИН Ві в6 РР гідролізат казеїну глутамш Сахара сахароза глюкоза агар 100 2 10 1 1 30000 8000 51300 27000 8000 5,8 5,8 5,8 30000 рН 8000 Таблиця 2 Задіяні у бютестах еталонні і запропоновані гельні агенти поживних середовищ з урахуванням етапів мікророзмноження сортозразків овочевих культур Рослинні об'єкти на почат- Поживні середовища з ураху- Перелік застосоЕтап мікроро- Овочева культуку етапу мікророзмножен- ванням гормональних препа- ваних гельних змноження ра (сорт) ня ратів агентів 1 2 3 Білоголова капуста (Леся), томат вирощування (Світанок pS), розсади in огірок (Джерело), vitro цибуля ріпчаста (Мавка) культура білоголова капуексплантів ста (Леся) меристема томат (Світанок тичних ткаpS) нин огірок (джерело) 4 5 насіння МС (без гормонів) агар-агар (8г/л) експланти ппокотилів ШХмод (1мг/л БАП-бензиламінопурш) Пазушна брунька МС (без гормонів) агар-агар (8г/л) фітогель "Gelnte"(2,5r/n), ДККмод (150г/л, БД-1а(150г/л) апікальна меристема МС (4мг/л БАП, 2мг/л НОКнафтилоцтова кислота) квітколоже БДС (4мг/л БАП, 2мг/лНОК) цибуля ріпчаста (Мавка) білоголова капуста (Леся), томат Укорінення (Світанок pS), рослиногірок (Джерело), регенерантів цибуля ріпчаста (Мавка) Овочева культура (сорт) 1 Тип експланта меристемаТип тичної тканигельни, склад горного монів поживагенту ного середовища 2 3 адвентивні пагони МС (0,1 мг/л НОК) агар-агар (8г/л) фітогель "Gelnte" (2,5г/л), ДККмод (150г/л, БД-1 а (150г/л) Результати фенологічних спостережень за станом вегетативного потомства ступінь Значення фізіологічного рН поживноКІЛЬКІСТЬ некрого середовища протягом 1-го пасажу вітрифікова- тизацій коефіцієнт (дні культивування) них адвен- адвен- размножетив-них па- тивних ния гонів, % пагонів, % 15 день ЗО день 45 день 60 день 4 5 6 7 8 9 10 Продовження табл 2 52031 11 1 12 4 5 6 7 8 9 10 Білоголова ДККмод експланти пкапуста БД-1а п о шти(сорт Леагар лів,1мг/л БАП ся) Gelnte 5,8 5,8 5,5 5,3 5,5 5,3 5,1 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,73±0,51 2,07±0,56 5,5 5,0 4,5 4,2 67,34±0,16 24,3 3,06±0,92 5,3 4,9 4,5 4,1 100,00 11,9 3,13±2,0 ДККмод Томат пазушні бруа (сорт Сві- БД-1 ньки без горагар танок pS) монів Gelnte 5,8 5,8 5,6 5,4 5,7 5,7 5,2 4,8 5,6 5,5 5,0 4,3 5,4 5,1 4,6 4,0 0,0 0,0 14,57±0,47 87,42±0,21 0,0 0,0 96,7 78,3 1,00±0,0 1,00±0,0 1,00±0,0 1,00±0,0 ДККмод апікальні меОгірок а ристеми, 4мг/л (сорт Дже- БД-1 БАП, 2мг/л агар рело) НОК Gelnte 5,8 5,8 5,8 5,6 5,8 5,8 5,5 5,3 5,5 5,5 5,3 4,5 5,3 5,2 5,0 4,2 0,0 0,0 23, 10±1,78 34,54±0,99 0,0 0,0 10,1 5,3 6,45±1,8 7,56±2,1 3,24±0,8 4,81±1,3 ДККмод Цибуля квітколоже, 4 ріпчаста БД-1а мг/л БАП, (сорт Мав- агар 2мг/л НОК ка) Gelnte 5,8 5,8 5,8 5,6 5J 5,5 5,4 5,2 5,6 5,3 4,7 4,4 5,3 5Л 4,3 4,1 0,0 0,0 11,4±0,61 100 0,0 0,0 15,6 9,3 48,3±5,7 39,6±2,3 41,7±1,5 0,1 2 3 Література 1 Кретович В А Основы биохимии растений М Высшая школа, 1974, 464 с 2 Медведев С С Физиологические основы полярности растений С Петербург "Кельна", 1996, 159 с 3 Michelet В , Boutry M The plasma membrane H+-ATPase Plant Physiol, 1995, Vol 108, P 1-6 4 Schenk R U , Hildebrandt A C Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dycotyledonous plant cell culture Can J Bot, 1972, Vol 50, P 199-204 5 Dunstan D J , Short К С Scient hort 1978 9, P 99-100 6 Murashige T , Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol plant, 1962, Vol 15, P 473-497 7 P Г Бутенко "Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений", М , 1964, 350 с 8 Ф Л Калшша, В В Сарнацька, В Е Полщук "Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений", К , 1980, 270 с 9 Агрохимические методы исследований Москва "Наука", 1965, 350 с под ред А А Фролова, М Е Анцеловича ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71