Штам бактерій sinorhizobium meliloti t17 (імв в-7282) для одержання бактеріального добрива під люцерну

Штам бактерій Sinorhizobium meliloti Т17 (ІMB В-7282) для одержання бактеріального добрива під люцерну. (19) (21) u201007843 (22) 23.06.2010 (24) 10.12.2010 (46) 10.12.2010, Бюл.№ 23, 2010 р. (72) КОЦЬ СЕРГІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ, ВОРОБЕЙ НАДІЯ АНАТОЛІЇВНА, МАЛІЧЕНКО СВІТЛАНА МАРКІВНА, БУТНИЦЬКИЙ ІВАН МИКОЛАЙОВИЧ 3 продукують. Колонії помірно-випуклі, слизисті, з часом розростаються і можуть розтікатись по поверхні агаризованого середовища. Запропонований штам є мікроаерофілом. Температурний діапазон його росту становить 25-28 С. Діапазон рН 6,5-7,4. Генетичні особливості: прототроф, стійкий до антибіотиків. У геномі клітин штаму Т17 S. meliloti, присутній фрагмент транспозону Тn5 довжиною 517н. п. (результати аналізу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР аналіз) ДНК), що відрізняє його від вихідного (батьківського) штаму 425а S. meliloti і забезпечує стійкість до сульфату канаміцину в концентрації 200мкг/мл. Штам непатогенний, нетоксичний. Фізіолого-біохімічні ознаки. Культура бульбочкових бактерій Sinorhizobium meliloti 17 відновлює нітрати і нітрити, використовує гідролізат лактальбуміну, має каталазну та уреазну активність, засвоює сечовину та амонійні солі, амінокислоти, гідролізує казеїн. Культура не розріднює желатину, не використовує клітковину, не утворює сірководень (H2S), слабо пептонізує молоко. Росте на середовищах із вуглеводами. Активно засвоює арабінозу, глюкозу, мальтозу, галактозу, мелібіозу, фруктозу, D-фукозу, L-фукозу, L-ксилозу із утворенням кислих продуктів. Слабо засвоює ксилозу, рафінозу і сорбіт. Полісахариди - крохмаль, глікоген не гідролізує. Із багатоатомних спиртів засвоює маніт. Відмінним джерелом вуглецю для досліджуваного штаму є меляса. Запропонований штам бульбочкових бактерій S. meliloti Т17 добре культивується на середовищах наступного складу: Синтетичне середовище N79 (г/л: К2НРО4 0,5, MgSO4 7Н2О - 0,2, NaCl - 0,1, СаСО3 - сліди, казамінокислоти (або гідролізат лактоальбуміну) 0,1% (1г), маніт - 10,0, агар - 17,0, дист. вода - 1 літр). Стерилізувати при 0,75атм 40хв, рН 6,8-7,2. Бобовий агар (г/л: горох - 100, сахароза - 20,0, NaCl - 1,0, агар - 15-18. В 1л води кип'ятити 100г гороху 30хв, настояти 20хв. Відвар відцідити, розчинити добавки. Стерилізувати при 1атм 30хв, рН 6,8-7,2. Манітно-дріжджовий агар (МДА) (г/л: К2НРО4 0,5, MgSО4 7Н2О -0,2, NaCl - 0,1, маніт - 10,0, дріжджовий екстракт - 1,0, агар - 15,0-17, 0, дист.вода, рН - 7,0. Стерилізувати при 1атм 30хв, рН 6,8-7,2. Має слабкий ріст на картопляному агарі. На МПА бактерії ростуть. Штрих слабкий, утворює менше слизу порівняно з ростом на інших середовищах. Азотфіксувальну активність штаму, що пропонується, визначали в мікровегетаційних, вегетаційних і польових дослідах за редукцією ацетилену в етилен за методом Харді із співавт. [Hardy R.W.F., Holsten R.D, Jackson E.K., Bums R.C. 1968] на газовому хроматографі Agilent Technologies 6850 Network GC System із полум'яно-іонізаційним детектором. 55432 4 Ефективність штаму Т17 S. meliloti перевіряли на люцерні сортів Ярославна Ольга, Зірниця, Зайкевича в умовах мікровегетаційних (перліт, середовище Красильникова-Кореняко), вегетаційних (промитий річковий пісок, збагачений сумішшю Гельрігеля і азотом Са(NO3)2 0,25 норми) і польових дослідів (на чорноземі опідзоленому, середкьосуглинковому, вміст гумусу 3,0%, N - 11,4, Р2О510,4, К2О - 8,1мг/100г ґрунту) у зоні Західного лісостепу України (Тернопільська обл.), а також на сірому опідзоленому лісовому, супіщаному ґрунті (рН 5,9-6,0), вміст гумусу 1,2-1,5%, фосфору 8,810,1, калію 9,4-10,2, азоту 10,4-12,6мг/100г ґрунту) Київської області. Передпосівну інокуляцію насіння проводили бактеріальною суспензією із титром 109клітин/мл. Для її отримання штам Т17 вирощували на манітно-дріжджовому агарі при 28 С протягом 4 діб у пробірках. Культуру із поверхні агару змивали стерильною водою, готували густу суспензію (50мл), якою засівали качалочні колби із 350мл середовища. Культивування проводили протягом 3-4 днів при +27 С із використанням стаціонарної качалки, яка забезпечувала постійну аерацію середовища вирощування. Для виготовлення препарату на твердому носії у пакети із перлітом (вермикулітом) (130г/га) вводили стерильно 50мл суспензії бульбочкових бактерій штаму Т17 і поживні добавки (мелясу, кукурудзяний екстракт, глюкозу), добре перемішували. Приготовлене таким чином бактеріальне добриво витримували при 18-20 С 5-10 діб. Після термостатування перевіряли титр бактерій (в 1г бактеріального препарату на твердому носії повинно бути не менше 1,0-1,5млрд. клітин Sinorhizobium meliloti) і проводили інокуляцію насіння. Для цього гектарну норму насіння зволожували (1-2% води від маси насіння), рівномірно перемішували із бактеріальним препаратом, підсушували в тіні та висівали в ґрунт. Інший спосіб передбачає обробку насіння люцерни водною витяжкою із бактеріального препарату на твердому носії. Для цього 250г препарату розмішували у воді і фільтрували через марлю (грубі частинки перліту таким чином відділяли від основної суспензії). Отриманою суспензією інокулювали гектарну норму насіння. Посів люцерни проводили у другій декаді квітня з шириною міжрядь 45см і глибиною загортання насіння 1,5-2,0см. Передпосівну обробку проводили за 1 годину до висіву насіння в ґрунт бактеріальною суспензією або препаратом на твердому носії. Насіння висівали із розрахунку 15кг/га. Дослідження проведені в умовах вегетаційного та польового дослідів показали, що бактерії рекомендованого штаму утворюють більшу кількість і масу бульбочок на коренях рослини-господаря (табл. 1) та інтенсивніше асимілюють атмосферний азот порівняно із штамами М12 та стандартом 425а (табл. 2, 3). 5 55432 6 Таблиця 1 Динаміка кількості та маси кореневих бульбочок люцерни сорту Ярославна, інокульованої бульбочковими бактеріями S. meliloti (польові досліди, Київська обл., 2005-2006 pp.). Варіант 425а (виробничий) М12 Т17 (запропонований) 425а (виробничий) М12 Т17 (запропонований) Кількість бульбочок, шт./рослину Початок цвітінБутонізація Стеблування ня 5,5 0,6 11,4 1,9 14,5 1,5 6,7 1,0 12,2 2,6 19,0 1,0 8,0 0,9 19,8 1,7 21,0 1,5 Маса бульбочок, мг 9,5 0,3 25,0 1,7 37,6 9,7 13,6 0,5 57,6 7,5 60,6 9,7 17,9 1,2 67,2 4,1 70,0 7,5 Симбіоз люцерни із штамом Т17 S.meliloti характеризується тривалим періодом активної фіксації азоту кореневими бульбочками у т. ч. і у фазу формування генеративних органів порівняно із рослинами, які фіксують азот у симбіозі із штамами 425а або М12 (табл. 3). Ефективність інокуляції люцерни запропонованим штамом перевіряли використовуючи для інокуляції рідке добриво і добриво на твердому сипучому носії (вермикуліт). Інокуляція люцерни рідким препаратом виготовленим на основі штаму Т17 забезпечує прибавку урожаю надземної маси люцерни сорту Ярославна 15,5% (48,2ц/га) (табл. 4), сорту Ольга - 13,1% (39,4ц/га) (табл. 5), сорту Зірниця - 9,6% (16,9ц/га) (табл. 6) порівняно із інокуляцією вказаних сортів виробничим штамом 425а. При використанні сипучого препарату (виготовлений на твердому носії - вермикуліт) на люцерні сорту Зірниця прибавка урожаю зеленої маси люцерни становила 12,6% (22,1ц/га) порівняно із виробничим штамом 425а (табл. 4) і 26,1% (40,9ц/га) порівняно із варіантом без інокуляції. У результаті утворення ефективного симбіозу із люцерною посилюється розвиток рослин та підвищується урожай зеленої маси при одночасному Цвітіння 6,0 0,4 13,0 0,7 21,4 1,0 45,0 4,0 55,0 10,0 63,0 5,7 покращенні його якості за рахунок збільшення вмісту в ньому білка. Внаслідок інокуляції люцерни посівної запропонованим штамом Т17, вміст загального азоту у надземній масі рослин люцерни збільшився відповідно на 0,3 і 0,4%, а протеїну на 1,6 і 2,4абс. % (табл. 7) порівняно із бактеризацією рослин базовим М12 і виробничим штамом 425а S. meliloti. В умовах вегетаційних і польових дослідів, інокуляція люцерни запропонованим штамом Т17 призводила до збільшення вмісту хлорофілів у листках рослин порівняно із штамами М12 і 425а (табл. 7). Додатковою перевагою штаму Т17 є його висока конкурентоздатність, яка забезпечує йому пріоритет у процесі утворення бульбочок при вирощуванні люцерни за присутності сторонньої ризобіальної мікрофлори. Конкурентоздатність штаму Т17 визначали непрямим методом (за надземною масою інокульованих рослин) і розраховували за формулою Амаргер (Amarger N., 1981). На люцерні сорту Ярославна запропонований штам Т17 проявляв конкурентоздатність на рівні еталонного виробничого штаму 425а S. meliloti (табл. 9). Таблиця 2 Динаміка азотфіксувальної активності люцерни сорту Ярославна у вегетаційному досліді. Варіант 425а (виробничий) Т17 (запропонований) Азотфіксувальна активність, мкмоль С2Н4/(рослину·год) Фаза розвитку рослин, доба після сходів Стеблування, 30-а Бутонізація, 38-а Початок цвітіння, 57-а 0,26 0,023 0,80 0,08 2,01 0,04 0,37 0,43 0,94 0,03 5,10 0,14 Таблиця 3 Динаміка азотфіксувальної активності люцерни сорту Ярославна у польовому досліді (2005 р. Київська обл.) Варіант 425а (виробничий) М12 (базовий) Азотфіксувальна активність, (мкмоль C2H4/(рослину·год) Перший рік вегетації Стеблування Бутонізація Початок цвітіння Цвітіння Утворення бобів 0,11 0,01 1,56 0,19 0,87 0,11 0,60 0,05 0,40 0,03 0,60 0,05 3,06 0,31 0,74 0,08 0,74 0,09 0,43 0,03 7 55432 8 Продовження таблиці 3 Азотфіксувальна активність, (мкмоль C2H4/(рослину·год) Перший рік вегетації Стеблування Бутонізація Початок цвітіння Цвітіння Утворення бобів 0,25 0,05 5,38 0,13 1,96 0,30 1,49 0,12 1,55 0,07 Варіант Т17 (запропонований) Таблиця 4 Урожай зеленої маси люцерни сорту Ярославна, інокульованої бульбочковими бактеріями S. meliloti (польовий дослід, 2005-2006 pp., Київська обл.). Урожай зеленої маси, ц/га 2005 р. 1-й рік ве- 2006 р. 2-й рік ве- Середній за 2 Прибавка до штаму 425а гетації гетації роки ц/га % 311,2 308,0 8,7 314,3 8,2 343,6 32,4 10,4 339,4 11,2 347,7 13,4 359,4 48,2 15,5 352,3 7,6 366,5 8,4 28,2 47,2 Варіант 425а (виробничий) М12 Т17 (запропонований) НІР0,05 Таблиця 5 Урожай зеленої маси і азотфіксувальна активність люцерни сорту Ольга у польових дослідах, 2005-2006 pp., (Тернопільська обл.) Азотфіксувальна активність (мкмоль С2Н4/(рослину·год)) Урожай зеленої маси, ц/га Прибавка зеленої маси 1-й рік веге- 2-й рік ве1 -й рік 2-й рік вегеСередній до штаму тації, 2005 гетації, вегетації, тації, 2006 до контролю за 2 роки 425 а р. 2006 р. 2005 р. р. ц/га % ц/га % Контроль (без інок.) 280,3 -20,1 -6,7 0,60 0,03 0,38 0,03 309,8 5,2 250,9 11,1 425а (виробничий) 300,4 20,1 7,2 1,46 0,12 0,71 0,06 310,2 6,2 290,7 9,1 Т17 (запропонований) 1,96 0,08 1,28 0,1 345,6 5,2 333,9 20,2 339,8 59,5 21,2 39,4 13,1 НІР0,05 19,8 12,5 Варіант Таблиця 6 Урожай зеленої маси та азотфіксувальна активність (мкмоль С2Н4/(рослину год) люцерни сорту Зірниця у польових дослідах (2007-2008 pp., Тернопільська обл.). Азотфіксувальна активність Варіант Контроль (без інокуляції) 425а (виробничий) Т17 (запропонований) (рідка форма препарату) Т17 (запропонований) (препарат на твердому носії) Урожай зеленої маси, ц/га Прибавка зеленої маси 1-й рік ве- 2-й рік ве- 1-й рік ве- 2-й рік веСередній до штаму гетації, гетації, гетації, гетації, до контролю за 2 роки 425а 2007 р. 2008 р. 2007 р. 2008р. ц/га % ц/га % 0,22 0,02 0,04 0,05 101,0 8,3 212,4 4,6 156,7 -18,8 -10,8 0,45 0,06 0,16 0,02 126,0 6,1 225,0 9,7 175,5 18,8 12,0 0,91 0,08 0,26 0,03 134,0 2,8 250,8 9,2 192,4 35,7 22,8 16,9 9,6 1,38 0,12 0,38 0,05 136,8 8,3 258,4 8,2 197,6 40,9 26,1 22,1 12,6 9 55432 10 Таблиця 7 Вміст азоту і протеїну у люцерни сорту Ярославна, інокульованої бульбочковими бактеріями S. meliloti (вегетаційний дослід, фаза - початок цвітіння). Варіант 425а (виробничий) М12 Т17 (запропонований) Зелена маса Суха маса г/посудину 34,86 1,05 10,07 0,34 33,20 0,90 10,59 0,36 35,33 2,14 12,20 0,63 Вміст у повітряно-сухій речовині азоту, % протеїну, % 17,3 2,8 0,0 18,1 2,9 0,1 19,7 3,2 0,0 Таблиця 8 Вплив інокуляції штамом Т17 S. meliloti на вміст фотосинтетичних пігментів (мг/г маси сирої речовини) в листках рослин люцерни (фаза - бутонізація). Штам Без інокуляції 425 а (виробничий) Т17 (запропонований) 425а (виробничий) М12 (базовий) ТІ 7 (запропонований) Без інокуляції 425а (виробничий) Т17 (запропонований) Хлорофіл а Хлорофіл b Сума хлорофілів сорт Ярославна (вегетаційний дослід,) 1,42 0,87 0,06 0,55 0,04 2,42 1,78 0,01 0,64 0,03 3,30 2,47 0,15 0,83 0,05* сорт Ярославна (польовий дослід, Київська обл.) 1,55 1,18 0,06 0,37 0,02 1,53 1,20 0,04 О,33 0,03 1,71 1,38 0,01 0,33 0,01 сорт Зірниця (польовий дослід, Тернопільська обл.) 1,92 1,23 0,006 0,69 0,001 1,99 1,27 0,01 0,72 0,001 2,27 1,40 0,06 0,86 0,005 Каротиноїди 0,18 0,01 0,29 0,02 0,39 0,02 0,17 0,01 0,22 0,01 0,26 0,02 0,51 0,01 0,68 0,02 0,53 0,01 Таблиця 9 Ефективність азотфіксації і конкурентоздатність нового штаму бульбочкових бактерій люцерни Т17 у вегетаційному досліді. Варіант Без інокуляції СХМ1-48 (неактивний) 425а (виробничий) Т17 (запропонований) Абсолютно суха речовина, г/посудину інокуляція активним шта- інокуляція сумішшю мом (шт. +) (шт.+ + шт-) 1,54 0,02 1,37 0,07 1,65 0,09 1,59 0,06 2,24 0,02 2,07 0,06 Рекомендований штам Т17 S. meliloti достатньо технологічний і його можна використовуватися у виробництві бактеріального добрива під люцерну, оскільки добре приживається і інтенсивно розмножується на сипучих субстратах-носіях - вермикуліті й перліті, збагачених поживними домішками (кукурудзяний екстракт, меляса, глюкоза). Протягом 45 діб зберігання бактеріальний титр препаратів виготовлених на основі штаму Т17 мав тенденцію до збільшення порівняно із препаративними формами на основі штамів 425а і М12. Отже, запропонований штам Т17 Sinorhizobium meliloti відрізняється від виробничого штаму 425а за фізіолого-біохімічними і генетичними ознаками, утворює високоефективний симбіоз із низкою сортів люцерни у різних ґрунтово Конкурентоздатність, % 78,0 80,0 кліматичних умовах. Використання запропонованого штаму Т17 для бактеризації ряду районованих сортів люцерни у різних ґрунтово-кліматичних умовах збільшує урожай зеленої маси в середньому на 15,1-22,8% (31,7-42,5ц/га) порівняно із варіантом без інокуляції і на 9,6-15,5% (16,948,2ц/га) порівняно із виробничим штамом 425а S. meliloti. Таким чином, запропонований штам Т17 Sinorhizobium meliloti за основними господарськокорисними властивостями - ефективністю симбіозу, накопиченням азоту та протеїну у надземній масі рослини-господаря, конкурентоздатністю та технологічністю переважає штами 425а і М12 та рекомендується для виготовлення бактеріальних добрив під люцерну. 11 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 55432 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601