Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти

1 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти, який передбачає промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином, подрібнення плацентарної тканини, багатоетапне заморожування до -196°С в розчині, якій містить крюконсервант, занурення і зберігання у рідкому азоті, який відрізняється тим, що отриману плацентарну тканину спочатку промивають стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком, потім здійснюють перфузію, відокремлюють від плаценти хоріон і амнютичну оболонку, а також значні кровоносні судини, після подрібнення плацентарну тканину гомогенізують у фізіологічному розчині до одержання сметаноподібної маси, до гомогенату додають 10-20% розчин диметилсульфоксиду (ДМСО) на розчині Хенкса, перемішують, розливають у поліетиленові ампули, заморожують із наступним зануренням у рідкий азот 2 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти по п 1, який відрізняється тим, що плацентарну тканину отримують від породіль і жінок, що надійшли на добровільне переривання вагітності, сироватка крові яких дає негативний результат при тестуванні на гепатити В і С, вірус імунодефіциту, сифілісу, токсоплазмоз, цитомегаловірус, хламідм, мікоплазму, уреоплазму, краснуху, вірус простого герпесу 3 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти по п 1, який відрізняється тим, що промивання плацентарної тканини стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком повторюють тричі 4 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти по п 1, який відрізняється тим, що при подрібненні плацентарну тканину розрізають на окремі фрагменти розміром 3-5 см, потім фрагменти плаценти подрібнюють у ножовому гомогенізаторі MPW-324, а потім - у скляному гомогенізаторі Поттера 5 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти по п 1, який відрізняється тим, що 1020% розчин диметилсульфоксиду на розчині Хенкса додають до гомогенату в співвідношенні 1 0,81,2 6 Спосіб одержання препарату суспензії клітин плаценти по п 1, який відрізняється тим, що замороження здійснюють у програмному заморожувачі зі швидкістю 0,6 - 1,2°С/хв до -ЗО -42°С, із ініціюванням процесу кристалоутворення при температурі -3,5 -4,5°С, потім із швидкістю 10 12°С/хв до-90 -110°С із наступним зануренням у рідкий азот Винахід відноситься медицини і косметологи, а саме до створення імунобюлопчних препаратів і лікувально-профілактичних косметичних засобів Відомий спосіб одержання біологічно активного тканинного препарату з плаценти тварини (див патент Роси № 2148408, МПК 5А 61К 35/50, дата публікації 2000 05 10), який передбачає відмивку плаценти очищеною водою, отримання гомогената плаценти, гемоліз тканин в очищеній воді, перше тонке подрібнення тканин в роторнопульсаційному апараті, обеззараження и окислен ня 3%-ним розчином перекису водоводу, повторну обробку полупродукту в роторно-пульсаційному апараті, фільтрацію и отримання готового продукту Недоліком такого способу є обмежена сфера його використання по перше через необхідність використання препарату безпосередньо після приготування Згідно проведених власником цього патенту досліджень, використання такого препарату передбачається лише для певних тварин ю 00 о (О ю 56085 зневоднюванням клітин і утворенням асоціативних молекулярних з'єднань із водневими зв'язками Утворять комплекси з металами, що призводить до зниження концентрації солей у середовищі заморожування і зменшує можливість виникнення осмотичного шоку в біологічних структурах при заморожуванні Обидві ці речовини застосовуються в крюбюлогм, проте при спільному використанні їх, крюпротектор ДМСО швидше проникне усередину клітини й установиться концентраційна рівновага між усередині і позаклітинного вмісту, проте ПЭО м м 400, знаходячись у позаклітинному середовищі, буде витягати воду з клітини, тим самим збільшуючи концентрацію ДМСО усередині клітини, що викликають необоротні зміни білок-ліпідних і ЛІПІДЛІПІДНИХ взаємодій і призведе до ослаблення впливу ЛІПІДІВ, що стабілізує, на структурні і функціональні білки Результатом такого впливу буде зниження життєздатності клітин при заморожуванні Запропонований режим охолодження клітин припускає повільне охолодження до 0°С, це можна пояснити необхідністю захисту клітин від температурного шоку, проте подальше збільшення швидкості заморожування до 5 - 6°С/хвил призведе до виникнення переохолодження в зразках що заморожуються, що, без додаткової ініціації кристалоутворення, викликає загибель клітин Третій етап запропонованого способу - витримування 1,5-2 годин при температурі -10°С При даній температурі, навіть якщо відбулася кристалізація, навколо клітин і клітинних мембран є не замерзла рідка фаза, у якій знаходяться концентровані розчини солей і крюпротектора, у таких умовах багато реакцій можуть пришвидшуватися Змінюється рН середовища, полярність і іонна сила розчинів, наслідком цього може бути активація або гальмування процесів кислотно-лужного каталізу, інактивація ферментів, руйнація клітинних мембран, що також здійснить негативний вплив на біологічні об'єкти що заморожуються Збереження продукту у вигляді фрагментів розміром 3 х 2см призводить до зниження якості кінцевого продукту Лише клітини, які знаходяться на поверхні фрагментів внаслідок дифузії отримуНедоліком даного способу є те, що перфузують достатню КІЛЬКІСТЬ ДМСО і внаслідок цього вання плацентарної тканини через пупкову вену зберігають життєздатність Решта клітин гинуть фізіологічним розчином протягом 10 хвилин не забезпечує и достатнього очищення і призводить Використання суспензії клітин плаценти за тадо зниження якості кінцевого продукту ким способом після завершення процесу збереження потребує додаткових операцій подрібнення Суттєвим недоліком даного способу є те, що та гомогенізації полупродукту за прототипом, що композицію крюпротекторів, запропоновану для ускладнює застосування такого продукту та ствокрюконсервування, не можна вважати прийнятною рює додаткові можливості для забруднення мікоптимальною з погляду теоретичних основ крюушрофлорою кодження і крюзахисту біологічних об'єктів Крюпротектор ДМСО є речовиною, що проникає усеЗавданням винаходу є створення способу редину клітин, і у силу своєї хімічної природи одержання препарата суспензії клітин плаценти у здійснює сильний вплив на рідку фазу, створюючи якому шляхом зміни операцій способу та знайдеводневі зв'язки з молекулами води, зв'язується з них емпіричним шляхом режимів, використовуваіонними компонентами при зниженні температури і ної сировини, допоміжних речовин, обладнання, та здійснюють вплив на процес зародишеутворення дій з його використанням забезпечується покракристалів льоду і формування його структури щання умів збереження клітин плаценти, збільПроникність його через мембрану клітин набагато шення періоду збереження та підвищення КІЛЬКОСТІ вища, чим у ПЭО м м 400, який у основному, є не життєздатних клітин що зберігаються після періоду проникаючою у клітини речовиною збереження, що в цілому покращує ЯКІСНІ характеристики отримуваного препарату Крюпротекторна дія ПЭО м м 400 пов'язана зі Метод обеззараження препарату з використанням 3%-ного розчину перекису водню змінює його рН, що також обмежує сферу його використання В короткий термін між отриманням препарату та його використанням неможливо провести повноцінну перевірку інфекційного забруднення отриманого препарату Відомий спосіб одержання біологічно активного тканинного препарату з плаценти (див патент Роси № 2080118, МПК 5А 61К 35/50, дата публікації 1997 05 27), який передбачає використання плацентарної тканини людини, віддалення з плаценти хоральної пластинки разом з великими судинами и амнютичною оболонкою, подрібнення плацентарної тканини і наступне використання препарату безпосередньо після приготування Недоліком такого способу є обмежена сфера його використання по перше через необхідність використання препарату безпосередньо після приготування Для забезпечення курсу лікування потрібно декілька введень препарату обсягом 3 - 7 грам, що перевищує обсяг отриманого препарату з плаценти В короткий період між отриманням препарату та його використанням неможливо провести повноцінну перевірку інфекційного забруднення отриманого препарату Відомий спосіб одержання біологічно активного тканинного препарату з плаценти (див патент України № 30808 А, дата публікації 15 12 2000, номер бюлетеня 7), ВІДПОВІДНО до якого плацентарну тканину перфузують через пупкову вену фізіологічним розчином, подрібнюють плацентарну тканину на фрагменти розміром 3 x 2 , здійснюють заморожування тканини до -196°С в розчині, якій містить 10% концентрацію диметилсулфоксида (далі ДМСО) і додатково 10% полиэтиленоксида м м 400 (далі ПЭО м м 400), а заморожування роблять із швидкістю 1 - 2°С/хвил до 0°С, потім із швидкістю 5 - 6°С/хвил до -10°С, а далі витримують при -10°С протягом 1 , 5 - 2 годин, після чого занурюють у рідкий азот, де зберігають протягом одного місяця 56085 одержання препарату суспензії клітин плаценти при подрібненні плацентарну тканину розрізають на окремі фрагменти розміром 3 - 5см, потім фрагменти плаценти подрібнюють у ножовому гомогенізаторі MFW-324, а потім у скляному гомогенізаторі Поттера Внаслідок використання зазначених ознак способу забезпечується рівномірна гомогенізація тканини що додатково покращує наступний процес дифузії диметилсулфоксида в клітини тканини, внаслідок чого всі клітини отримують достатню КІЛЬКІСТЬ диметилсулфоксида і внаслідок цього КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин підвищується В конкретних варіантах реалізації способу одержання препарату суспензії клітин плаценти 10 - 20% розчин диметилсулфоксида на розчині Хенкса додають до гомогената в співвідношенні 1 0,8 -1,2 Запропонований інтервал співвідношення гомогената до розчину диметилсульфоксиду на розчині Хенкса, оснований на отриманих імперічних Внаслідок використання зазначених ознак даних і забезпечує оптимальні умови для початку способу забезпечується достатнє очищення планаступного процесу замороження центарної тканини і призводить до підвищення якості кінцевого продукту В конкретних варіантах реалізації способу одержання препарату суспензії клітин плаценти Гомогенізування плацентарної тканини після замороження здійснюють у програмному заморооперації подрібнення покращує наступний процес жувачі зі швидкістю 0,6 - 1,2°С/хв до - ЗО - 42°С, із дифузії ДМСО в клітини тканини внаслідок чого всі ініціюванням процесу кристалоутворення при темклітини отримують достатню КІЛЬКІСТЬ ДМСО і внапературі - мінус 3,5 - 4,5°С, потім із швидкістю 10 слідок цього зберігають життєздатність 12°С/хв до - 90 - 110°С із наступним зануренням у Продукт у вигляді гомогенату не потребує дорідкий азот даткових операцій подрібнення та гомогенізації продукту, що зменшує КІЛЬКІСТЬ операцій при заЗапропонований режим охолодження клітин стосуванні продукту спрощує застосування такого забезпечує оптимальну швидкість заморожування продукту Зменшення КІЛЬКОСТІ операцій при забез температурного шоку і одночасно гарантовану стосуванні продукту зменшує можливість для заі оптимальну ініціацію кристалоутворення, що сутбруднення мікрофлорою при здійсненні таких опетєво зменшить негативний вплив операцій заморацій рожування на біологічні об'єкти Внаслідок застосування зазначеного розчину Для порівняння прототипу та запропонованого крюпротектора концентраційна рівновага між позаспособу здійснювали спосіб за прототипом та заклітинним середовищем і всередині клітин устанопропонований на зазначених нижче прикладах 1 виться на оптимальному рівні що забезпечить під14 В прикладах здійснювали такі дії вищення життєздатності клітин при заморожуванні Для приготування препарату за прототипом та запропонованим способом використовували плаВ конкретних варіантах реалізації способу центарну тканину, отриману в породілей і жінок, одержання препарату суспензії клітин плаценти що надійшли на добровільне переривання вагітноплацентарну тканину отримують в породілей і жісті за показниками, сироватка крові яких дає неганок, що надійшли на добровільне переривання тивний результат при тестуванні на гепатити В и вагітності за показниками, сироватка крові яких С, вірус иммунодефицита, сифілісу, токсоплазмоз, дає негативний результат при тестуванні на гепацитомегаловирус, хламідм, микоплазму, уреоплатити В и С, вірус імунодефіциту, сифілісу, токсозму, краснуху, вірус простого герпеса плазмоз, цитомегаловирус, хламиди, микоплазму, уреоплазму, краснуху, вірус простого герпеса При виконанні прикладу способу за прототиВнаслідок використання зазначених ознак пом отриману плацентарну тканину перфузували способу покращується якість отриманого препарачерез пупкову вену фізіологічним розчином, подріту бнювали плацентарну тканину на фрагменти розміром 3 x 2 , здійснювали заморожування тканини В конкретних варіантах реалізації способу до -196°С в розчині, якій містить 10% концентраодержання препарату суспензії клітин плаценти цію ДМСО і додатково 10% полиэтиленоксида промивання плацентарної тканини стерильним м м 400 (далі ПЭО м м 400), а заморожування фізіологічним розчином з антибіотиком повторюздійснювали із швидкістю 1 - 2°С/хвил до 0°С, ють тричі потім із швидкістю 5 - 6°С/хвил до -10°С, а далі Внаслідок цього на початковій стадії процесу витримували при -10°С протягом 2 годин, після забезпечується гарантоване очищення полупрочого занурювали у рідкий азот, де зберігали протядукту від мікрофлори, що виключає можливість її гом одного місяця розвитку на протязі здійснення способу що також призводить до підвищення якості кінцевого продуВ прикладах 1 - 14 за запропонованим спосокту бом плацентарна тканина, отримана під час родів, зроблених за допомогою кесарева перетину, або В конкретних варіантах реалізації способу Ця задача вирішується тим, що в способі одержання препарату суспензії клітин плаценти, який передбачає промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином, подрібнення тканини плаценти, багатоетапне заморожування до -196°С в розчині, якій містить крюконсервант, занурення і зберігання у рідкому азоті, новим є те що отриману плацентарну тканину спочатку промивають стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком, потім здійснюють перфузію, відокремлюють від плаценти хоріон й амнютичну оболонку, а також значні кровоносні судини, після подрібнення плацентарну тканину гомогенізують у фізіологічному розчині до одержання сметанообразної маси, до гомогената додають 10 - 20% розчин крюпротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) на розчині Хенкса, перемішують, розливають у поліетиленові ампули для наступного замороження та крюконсервування 56085 8 класичного іммуноферментного аналізу (див Импростагландинового переривання вагітності за муноферментный анализ Нго Т Т , Ленхофф Г показниками, тричі промивалася стерильним фізі(ред), Москва, "Мир", 1988), робили підрахунок ологічним розчином з антибіотиком (канаміцин ЗО КІЛЬКОСТІ життєздатних клітин шляхом фарбування ед/мл), в асептичних умовах робили відділення витальним барвником трипановим синім плаценти від хоріона й амнютичної оболонки, а також від значних кровоносних судин Як видно з поданих у таблиці результатів, ЦІЛІСТЬ гормонів і білків у препаратах плаценти, Очищену плацентарну тканину ще раз промиотриманих запропонованим способом набагато вали за допомогою перфузм стерильним фізіологівище, чим в отриманих за прототипом чним розчином через пупочний канатик, після чого розрізали на окремі фрагменти розміром 3 - 5см Оцінити КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН у гомогенизированих препаратах плаценти, що заморожували по спосоФрагменти плацентарної тканини подрібнювабу прототипу складно Матеріал майже весь подали у ножовому гомогенізаторі MPW-324, а потім у ний конгломератами клітин і невеличкої КІЛЬКОСТІ скляному гомогенізаторі Поттера у фізіологічному КЛІТИН цито-1 синцитиотрофобласта розчині до одержання сметанообразної маси До гомогената в співвідношенні 1 1 додавали 10 При фарбуванні трипановим синім для підра20% крюпротектора диметилсулфоксида (ДМСО) хунку життєздатних клітин вибирали окремі клітини на розчині Хенкса, перемішували, розливали у або невеличкі по 5 - 10 скупчень конгломерати і поліетиленові ампули обсягом 4,5мл, які герметивважали клітини, що виключають фарбування базували, маркірували і заморожували у програмнорвником по 500 клітин на препарат, життєздатниму заморожувачі зі швидкістю 0,6 - 1,2°С/хв до ми Неокрашених клітин в препараті, консервоваЗО - 42°С, із ініціюванням процесу кристалоутвоному запропонованим способом, було 75 - 90% рення при температурі - мінус 3,5 - 4,5°С, потім із Як показують результати прикладів, підготовшвидкістю 10 - 12°С/хв до - 90 - 110°С із наступлені запропонованим способом препарати плаценим зануренням у рідкий азот нти, можуть довгостроково зберігатися без зміни всіх досліджуваних показників і по необхідності У Таблиці 1 зазначені режими виконання завикористовуватися як вихідний матеріал для попропонованого способу, а в Таблиці 2 подані ретреб трансплантологи, медицини, у косметологічзультати, отримані при порівняльному дослідженні ній практиці в якості біоматериалу в біотехнологіях препаратів, отриманих по режиму, описаному в і у фармакології для готування різноманітних фапрототипі і по запропонованому способу (в прирмакопейних препаратів, а також для одержання кладах 1-14) гормонів, вивірок, амінокислот, ростових чинників, У препаратах отриманих за способом протоа-фетопротешу типом через місяць і у препаратах в прикладах 1 14 через шість МІСЯЦІВ після крюконсервування визначали рівень гормонів і білків за допомогою —і. —І о "-st -33 -42 £ t Is» "СО Співвідношення гомогената до розчіну кріопрскгектора % «J> 'to к> о ся О) о 00 ся Швидкість охолодження °С/ХЕ. -107 -95 Кінцева температура етапу °С > "en W tn Температура Іініціюеання процесу кристалоутворення °С, о Швидкість охолодження °С/хв. Кінцева температура етапу °С if» го "м «1. -д. тЛ. -105 -35 "о* Концентрація диметилсулфоксида в розчіні Хэнкса % "К» -90 -34 -4,5 "•ч тЛ, СП О о шХ о ~т -37 -96 шЛ. -109 -110 -94 -110 -А О Термін гомогенізації, хвилин. -92 Ъ Q оэ -31 "ёп о -А j . Розмір фрагментів см -30 о "со а 3x3 о 3x5 тЛ, —а. j» о to го о 102 тЛ. м -93 -л. -к -л со С П -38 со а "о 00 08 , со -4,4 -42 о о» to ф К9 О о -40 0,6 .о і "о -л. 3x3 ш : о> 108 :, 00 -А о 4x4 й —*. СП № приклада Н 3x4 "м KJ о ш 3x5 4x3 "ш 00 О) 3x4 3x5 шЛ, -А ш 3x3 3x5