Спосіб інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу, наприклад, лінії пухлинних клітин молочної залози

Спосіб інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу, наприклад, лінії пухлинних клітин молочної залози, який включає внесення in vitro у культуральне середовище через 24 год. після ви 3 ефектів, оскільки всі застосовані на сьогодні в онкологічній практиці антинеопластичні препарати поєднують в характері своєї дії як статичні, так і токсичні аспекти біологічного впливу. Актуальність проблеми полягає у пошуку препаратів, які б володіли переважаючою дією цитостатиків чи посилювали її в комбінованому застосуванні із цитотоксиками та, водночас, могли застосовуватись як додаткові засоби для корекції токсичних проявів наслідків перебігу захворювання та лікування. Особливе місце у вирішенні цієї проблеми займають засоби рослинного походження, яким властивий широкий спектр фармакологічної активності та біодоступність. Такі рослини як алтей, береза, цмин, девясил, женьшень, звіробій, календула, кропива, кульбаба, подорожник, шалфей, елеутерокок застосовуються паралельно з хіміотерапією. Збільшення кількості досліджуваних нових препаратів спонукає до застосування модельних тестсистем для експрес-аналізу характеру біологічної дії та оцінки перспектив подальшого застосування. В цьому відношенні використання методу клітинних культур in vitro дозволяє швидко в часі, у широкому діапазоні концентрацій провести скринінг перш, ніж переходити до проведення досліджень на тваринах (in vivo). Ще одним важливим моментом є можливість проведення експериментів на культурах клітин людини. Для дослідження антинеобластичних препаратів використовується культура пухлинних клітин, оскільки механізм дії більшості антинеобластичних препаратів зводиться до безпосередньої дії на клітини. Так, відомий «Спосіб визначення локальної пухлинної імуносупресії шляхом дослідження в клітинах пухлини супресивних цитокінів методом полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР)» (ПУ на корисну модель № 17905) та «Спосіб визначення показань до хіміотерапії раку молочної залози» (ДПУ на винахід № 50595А), які включають дослідження пухлинних клітин in vitro та визначення ефективності впливу різних препаратів на проліферативну активність клітин пухлини, щойно видаленої під час хірургічного втручання. Способи дозволяють судити про доцільність тих, чи інших препаратів для хіміотерапії після хірургічного втручання і не можуть біти використані для профілактики захворювання. Відомий спосіб інгібуючого впливу циспластину на проліферативну активність клітин лінії L 1210 лейкемії миші (Якимович М.Я. Національна академія наук України Інститут Біохімії ім.. О.В.Палладіна «Вплив трансформуючого фактора росту типу бета на клітини лінії лейкемії миші з різною чутливістю до дії циспластину». Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук. Київ - 1999.). Дослідження були проведені на культурі клітин лінії L 1210 лейкемії миші та клітин сублінії L1210/R з підвищеною резистентністю до дії протипухлинного препарату циспластину отриманих з Колекції клітинних культур Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Визначені дози циспластину, які найбільш ефективно інгібували проліферативну здатність пухлинних клітин. Недоліком способу є недостатня його ефективність та відсут 57662 4 ність інформації про можливість використання досліджуваного цитостатика на клітини пухлин сільськогосподарських тварин та людей. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб інгібування проліферативної здатності та процесів метаболізму клітин in vitro за використання алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (Осип Ю.Л. Інститут біології тварин УААН. «Вплив алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (Chelidonium majus) на проліферативну активність та метаболічні показники клітин in vitro.». Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Льві - 2006.). Спосіб забезпечує виявлення впливу алкалоїдів чистотілу на функціональну активність гранулоцитів крові людини та використання стимульованих мітогеном лімфоцитів як клітин-мішеней при тестуванні на антипроліферативну активність. Заявлений спосіб і прототип мають спільні суттєві ознаки: внесення in vitro у культуральне середовище через 24 год. після висіву клітин цитостатичного препарату рослинного походження в різних дозах та визначення ефективності інгібування проліферативної здатності клітин шляхом підрахунку їх кількості в камері Горяєва та обчисленнявідсотка мертвих клітин за використання трипанового синього. Недоліком відомого способу є те, що він розрахований на інгібування проліферативної активності та зміни метаболічних показників лише лінії L 1210 і придатність його для впливу на лінії пухлинних клітин молочних залоз невідома. Крім того, у відомому способі були використані алкалоїди та тритерпени чистотілу та визначено їх вплив на функціональну активність гранулоцитів крові людини. Заявлений наш спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує інгібування проліферативної активності пухлинних клітин молочної залози in vitro, що передбачає можливість його використання в подальшому для профілактики і лікування онкологічних захворювань молочної залози у людей і тварин. В основу корисної моделі покладено завдання - розробити новий ефективний спосіб інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу, наприклад, лінії пухлинних клітин молочної залози з допомогою препаратів рослинного походження, зручний у застосуванні, економічно вигідний для установ в яких він застосовується. Технічний результат заявленого способу досягають тим, що як рослинний препарат цитостатичної дії використовують галеновий препарат софори японської (Sophora japonica) при цьому найбільшого ефекту інгібування активності проліферативної здатності клітин досягають при внесенні галенового препарату софори японської в дозі 0,1-10 мкл/мл культурального середовища. Технічний результат заявленого способу обумовлений властивостями галенового препарату софори японської, використаного у способі, роллю біологічно активних речовин, що входять до його складу, яку вони здійснюють у метаболізмі клітин тваринного організму. 5 Софора японська містять комплекс біологічно активних речовин (БАР): флавоноїди, аскорбінову кислоту, фенолкарбонові кислоти. Домінуючий комплекс цих БАР зумовлює антиоксидантні властивості препарату, виготовленого на основі софори японської. Застосування таких препаратів при антинеопластичній терапії впливає на загальний рівень вільнорадикальних процесів, що відіграє суттєву роль за умов канцерогенезу і злоякісного росту. Оцінка морфофункціональних змін у культурі клітин за умов in vitro дає можливість проаналізувати перспективи застосування та спрогнозувати вплив галенового препарату софори японської in vivo. Антиканцерогенна дія флавоноїдів досліджується як на модельних системах, так і безпосередньо у клініці [Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine / University Press. Oxford. 1999]. Флавоноїди можуть інгібувати процеси канцерогенезу завдяки: інгібуванню процесів метаболічної активації проканцерогенів в реактивні інтермедіати, індукції і активації ферментів, що каталізують процеси детоксикації і безпосередньої хімічної взаємодії з активними канцерогенами, перешкоджаючи їхній дії на внутрішньоклітинні мішені - молекули ДНК, РНК і білків [Wattenberg L.W. Wattenberg L.W. (1985) Chemoprevention of cancer // Cancer Res. 1985. Vol.45. P. 1-8.]. Механізми протипухлинної дії флавоноїдів включають модуляцію сигнальних шляхів, залучених до регуляції проліферації пухлинних клітин, індукцію апоптозу або диференціювання клітин, а також інгібування ангіогенезу та подолання лікарської резистентності [Фільченков О.О., Завелевич М.П. Порівняльний аналіз дії різних флавоноїдів на проходження клітинного циклу та індукції апоптозу у клітинах лінії МТ-4 гострої лімфобластної лейкемії людини / Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 5]. Таким чином, наведені вище відомості розкривають механізм впливу галенового препарату софори японської на проліферативну активність in vitro лінії пухлинних клітин молочної залози і пояснюють технічний результат заявленого способу. При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником і авторами знайдено технічне рішення, що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим (Осип Ю.Л. Інститут біології тварин УААН. «Вплив алкалоїдів і тритерпенів чистотілу (Chelidonium majus) на проліферативну активність та метаболічні показники клітин in vitro.». Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Львів 2006.): внесення in vitro у культуральне середовище через 24 год. після висіву клітин цитостатичного препарату рослинного походження в різних дозах та визначення ефективності інгібування проліферативної здатності клітин шляхом підрахунку їх кількості в камері Горяєва та обчислення відсотка мертвих клітин за використання трипанового синього. Однак наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали із заявленим, не виявлено. Це до 57662 6 зволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) -«новизна». В патентній і науково-технічній літературі не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату тим, що як рослинний препарат цитостатичної дії використовують галеновий препарат софори японської (Sophora japonica) при цьому найбільшого ефекту інгібування активності проліферативної здатності клітин досягають при внесенні галенового препарату софори японської в дозі 0,1-10 мкл/мл культурального середовища. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок, про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) «винахідницький рівень». Заявлена корисна модель належить до галузі біології, медицини і ветеринарії, зокрема онкології, а саме до способів зниження та усунення проліферативної здатності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу, наприклад, лінії пухлинних клітин молочної залози. Спосіб може бути використаний науководослідними і фармацевтичними установами, які розробляють препарати та схеми лікування онкологічних захворювань препаратами рослинного походження, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) - «промислова придатність». Таки чином, заявлений спосіб інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає усім умовам патентоспроможності винаходу (корисної моделі) відповідно до статті 7 розділу II Закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі» № 1771-III, 2000 р. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: лінії пухлинних клітин молочної залози культивують у культуральних флаконах (25 см2) у середовищі Дульбекко в модифікації Ігла (DMEM, Sigma Chem. Co., США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (ВРХ, Sigma Chem. Co., США) та 500 одиниць/мл гентаміцину (Sigma, США) при 37 °С в атмосфері 5 % СО2 при 100 % вологості. Пересів клітин здійснюють у співвідношенні 1:3-1:5 через кожні 2-3 дні. Клітини висівають на 8 мм культуральні пластикові (96- лункові) планшети (Sarstedt, США) у кількості 5105 клітин в 0,25 мл культурального середовища. Галеновий препарат софори японської у кількості 0,1-10 мкл/мл культурального середовища вносять через 24 год. після висіву клітин. Для контролю використовують інтактну культуру клітин та контролі з внесенням спирту (70 %) - 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл культурального середовища і контроль з внесенням фізіологічного розчину. Для визначення ефективності інгібування проліферативної здатності досліджуваних клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу підрахунок кількості клітин здійснюють на 24, 48, 72, 96, 120, 144, 164 год. залежно від виду досліджуваних клітин. Для визначення життєздат 7 ності клітин використовують тест на оцінку проникності плазматичної мембрани трипановим синім. Ефективність заявленого способу і його переваги над прототипом підтверджені прикладами конкретного виконання. Приклади конкретного виконання способу Експериментальне підтвердження заявленого способу проведено в умовах Вроцлавського природничого університету (Польща), Інституту біології клітини НАН України (Львів). Об'єктом досліджень слугували лінії пухлинних клітин MDA-MB231 (аденокарцинома молочної залози людини), 4Т1 (аденокарцинома молочної залози мишей), отримані з Клітинного банку ліній клітин Вроцлавського природничого університету (Польща). Приклад 1. Для впровадження способу інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу зокрема лінії пухлинних клітин молочної залози людини використовували лінію пухлинних клітин MDA-MB231. MDA-MB-231 - клітини аденокарциноми молочної залози людини, отримані у 1973 р. лікарем P. Calleau від 51 річної жінки. Клітини веретеноподібної форми, епітеліоцити. У процесі трансформації втратили Е-кадгерин, рецептори естрогену і прогестерону. Після ін'єкції 110 6 клітин у хвостову вену «голим» мишам, спричиняє пухлини, що метастазують. Клітини культивували у культуральних флаконах (25 см ) у середовищі Дульбекко в модифікації Ігла (DMEM, Sigma Chem. Co., США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (ВРХ, Sigma Chem. Co., США) та 500 одиниць/мл гентаміцину (Sigma, США) при 37 °С в атмосфері 5 % СО2 при 100 % вологості. Пересів клітин здійснюють у співвідношенні 1:3-1:5 через кожні 2-3 дні. Клітини висівають на 8 мм культуральні пластикові (96-лункові) планшети (Sarstedt, США) у кількості 5105 клітин в 0,25 мл культурального середовища. Галеновий препарат софори японської у кількості 0,1-10 мкл/мл культурального середовища вносять через 24 год. після висіву клітин. Для контролю використовують інтактну культуру клітин та контролі з внесенням спирту (70 %) - 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл культурального середовища і контроль з внесенням фізіологічного розчину. Для визначення ефективності інгібування проліферативної здатності досліджуваних клітин MDA-MB-231 підрахунок кількості клітин здійснюють на 24, 48, 72 год.. Для визначення життєздатності клітин використали тест на оцінку проникності плазматичної мембрани трипановим синім. За дії доз галенового препарату 1, 10 мкл/мл середовища спостерігаємо цитостатичну дію, яка характеризується зменшенням приросту кількості клітин відносно контрольних зразків, при цьому усі клітини трипаннегативні. Так, на 24 год. кількість клітин за дії галенового препарату софори японської 3333±1922 на 1 мл середовища за дії дози 10 мкл/мл середовища, що у 3,3 рази менше відповідної кількості клітин у контролі та 7500±1448 на 1 мл середовища за дії дози 1 мкл/мл середовища. 57662 8 Приріст кількості клітин є невисоким і залишається майже незмінним упродовж 72 год. за найвищої діючої дози та спостерігаємо зменшення кількості клітин за дози 1 мкл/мл середовища на 72 год. до 3333±833, що у 4,9 разів менше відповідної кількості клітин у контролі. Некротичні процеси не спостерігаються. На 14 добу, очевидно, старіюча небагаточисельна популяція клітин гине. За дії дози галенового препарату 0,1 мкл/мл середовища на 72 год. культивування у 2,4 рази нижчий приріст клітин порівняно з контролем, деструктивних змін клітин не спостерігаємо. Вміст білка у пробах досліджували методом P. Skehana (1990 р.). Результати отримано на 72 год. культивування клітин після внесення до культурального середовища галенового препарату софори японської. На 72 год. гальмували ріст клітин 50 % трихлороцтовою кислотою. Інкубували проби з 0,4 % розчином сульфородаміну В, після чого вносили по 10 мМ розчином Tris. Результати читали за =540 нм на фотометрі Multiscan RC. Значення оптичної густини за =540 нм у зразках популяції MDA-MB-231: 0,896; 0,73; 1,18 за дії найвищої, середньої, найнижчої доз відповідно. Отримані результати свідчать про вміст білка у пробах, що у 3,6 разів нижчий за дії дози 10 мкл/мл середовища, у 4,3 рази нижчий за дії дози 1 мкл/мл середовища, у 2,7 рази за дії дози 0,1 мкл/мл середовища порівняно з контролем і доводять інгібування проліферативної активності клітин галеновим препаратом софори японської. Визначення вмісту глюкози у пробі проводили на 24, 48, 72 год. культивування клітин після внесення до культурального середовища відповідних досліджуваних речовин глюкозооксидазним методом (Н.І. Журавльов, В.Н. Титов 2001 р.). За дії 10 мкл/мл середовища галенового препарату софори японської на клітини MDA-MB-231 показник оптичної густини поглинання середовища 0,629±0,0003 (24 год.), на 48 год. -0,608±0,0003, на 72 год. 0,55±0,0003, що свідчить про значно нижчий рівень утилізації глюкози, порівняно з контролем. Але зменшення концентрації глюкози у часовому відрізку свідчить про існування життєздатної, молочисельної популяції. Досліджуючи дію галенового препарату софори японської за дози 1 мкл/мл середовища на клітини MDA-МВ-231 спостерігаємо низький рівень використання глюкози на 24 год., починаючи з 48 год. не відбувається утилізації глюкози. Дані, можливо, свідчать про відсутність проліферації клітин, поступове відмирання популяцій. Про рівень використання глюкози на 24 год. свідчить показник поглинання середовища 0,467±0,0003 - зразки за дії галенового препарату софори японської та 0,476±0,0003 - інтактна культура. Незначна різниця результатів між дослідними і контрольними зразками є такою лише на 24 год. культивування, використання глюкози на цьому етапі за даної діючої дози препарату припиняється, на відміну від контрольних зразків. Результати вище описаних досліджень, що свідчать про інгібування проліферативної здатності клітин біологічно активним комплексом з софори японської, а отже, його протипухлинною здатністю підтверджено морфологічними дослідженнями з 9 використанням флюорохромів. Для фарбування цитологічних препаратів епітеліальних клітин флюорохромами акридиновим оранжевим (АО) (Sigma, США) і DAPI (Sigma, США) клітини вирощували у пластикових 96-лункових (8 мм) культуральних планшетах. Перед переглядом і фотографуванням до проби додавали флюорохроми у кінцевій концентрації 0,3 - 1,0 мкг/мл та інкубували 15 хв. Піддослідні культури оглядали під люмінесцентним мікроскопом МікМед-12 (ЛОМО, СанктПетербург, Росія) при збільшенні ~ 500-1000 разів в області збудження 450-480 нм та емісії 480-700 нм у випадку фарбування АО і в області збудження 330-360 нм та емісії 420-500 нм у випадку фарбування DAPI. Приклад 2. Для впровадження способу інгібування проліферативної активності клітин з високим рівнем експресії трансформованого фенотипу зокрема лінії пухлинних клітин молочної залози миші використовували лінію пухлинних клітин 4Т1. 4Т1 - клітини пухлини молочної залози миші. Клітинна лінія отримана Б. Пуласкі із пухлини молочної залози (аденокарциноми) миші. За морфологічними ознаками ці клітини епітеліального походження. При введенні в організм BALB/С мишей 4Т1 спонтанно призводить до виникнення пухлини, метастазів у легенях, печінці, лімфатичних вузлах і мозку. Пухлинний ріст і метастазування клітин 4Т1 у організмі BALB/С мишей є моделлю пухлини молочної залози людини. Клітини культивували у культуральних флаконах (25 см2) у середовищі Дульбекко в модифікації Ігла (DMEM, Sigma Chem. Co., США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (ВРХ, Sigma Chem. Co., США) та 500 одиниць/мл гентаміцину (Sigma, США) при 37 °С в атмосфері 5 % СО2 при 100 % вологості. Пересів клітин здійснюють у співвідношенні 1:3-1:5 через кожні 2-3 дні. Клітини висівають на 8 мм культуральні пластикові (96-лункові) планшети (Sarstedt, США) у кількості 5105 клітин в 0,25 мл культурального середовища. Галеновий препарат софори японської у кількості 0,1-10 мкл/мл культурального середовища вносять через 24 год. після висіву клітин. Для контролю використовують інтактну культуру клітин та контролі з внесенням спирту (70 %) - 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл культурального середовища і контроль з внесенням фізіологічного розчину. Для визначення ефективності інгібування проліферативної здатності досліджуваних клітин 4Т1 підрахунок кількості клітин здійснюють на 24, 48, 72, 96, 120, 144, 164 год. Для визначення життєздатності клітин використали тест на оцінку проникності плазматичної мембрани трипановим синім. Враховуючи тривалість лаг-фази клітин 4Т1, можна передбачати про певну подібність результатів дослідження життєздатності клітин MDA-MB231 і 4Т1. Характеризуючи популяції клітин лінії 4Т1 за дії галенового препарату софори японської у дозі 10 мкл/мл середовища спостерігаємо пригнічення проліферативної здатності клітин. На 24 год. у пробі за найвищої діючої дози галенового препа 57662 10 рату 1667±601 клітин на 1 мл середовища, що у 3,5 разів менше клітин контрольних зразків. Кількість клітин у середовищі з галеновим препаратом софори японської - 833±167 клітин на 1 мл середовища на 96 год. культивування. Спостерігаємо відсутність проліферації, відсутність трипанпозитивних клітин. На 14 добу відновлення не спостерігаємо, популяція гине. Проліферативна здатність на 48 год. за діючої дози 1 мкл /мл середовища досить висока, кількість клітин 5833±833 на 1 мл середовища, що відповідає такому у контрольних зразках, та з 72 год. клітинна лінія поступово відмиратиме, трипанпозитивних клітин не виявлено. За дії препарату у дозі 0,1 мкл/мл середовища негативного впливу щодо клітин 4Т1 не досліджено. Отже, інгібуюча дія галенового препарату софори японської виявляється лише за дози 1 та 10 мкл/мл середовища. Вміст білка у пробах досліджували методом P. Skehana (1990 р.). Результати отримано на 72 год. культивування клітин після внесення до культурального середовища галенового препарату софори японської. На 72 год. гальмували ріст клітин 50 % трихлороцтовою кислотою. Інкубували проби з 0,4 % розчином сульфородаміну В, після чого вносили по 10 мМ розчином Tris. Результати читали за =540 нм на фотометрі Multiscan RC. Значення оптичної густини за =540 нм у зразках популяції 4Т1: 1,1; 1,7; 2,0 за дії найвищої, середньої, найнижчої доз відповідно. Отримані результати свідчать про вміст білка у пробах, що у 2,5 разів нижчий за дії дози 10 мкл/мл середовища, у 1,6 разів нижчий за дії дози 1 мкл/мл середовища, у 1,4 рази за дії дози 0,1 мкл/мл середовища порівняно з контролем і доводять інгібування проліферативної активності клітин галеновим препаратом софори японської. Характер дії препарату на популяцію 4Т1 дозозалежний. Визначення вмісту глюкози у пробі проводили на 24, 48, 72 год. культивування клітин після внесення до культурального середовища відповідних досліджуваних речовин глюкозооксидазним методом. За дії 10 мкл/мл середовища галенового препарату софори японської на клітини 4Т1 показник оптичної густини поглинання середовища 0,442±0,0003 (24 год.), на 48 год. - 0,402±0,0003, на 72 год. - 0,402±0,0003, що свідчить про нижчий рівень утилізації глюкози, порівняно з контролем. Досліджуючи дію галенового препарату софори японської за дози 1 мкл/мл середовища на клітини 4Т1 виявлено низький рівень використання глюкози на 24 год. - 0,415 о.о.г., починаючи з 48 год. не відбувається утилізації глюкози. Дані свідчать про відсутність проліферації клітин, поступове відмирання популяцій. Інтенсивно відбувається утилізація глюкози за дії 0,1 мкл/мл середовища препарату з софори японської - на 72 год. оптична густина поглинання свідчить про мінімальну кількість глюкози - 0,039 о.о.г., яка, очевидно використана великою кількістю клітин на процеси життєдіяльності. Результати вище описаних досліджень, що свідчать про інгібування проліферативної здатності клітин галеновим препаратом софори японської, а отже, його протипухлинною здатністю підтверджено морфологічними дослідженнями з викорис 11 57662 танням флюорохромів. Для фарбування цитологічних препаратів епітеліальних клітин флюорохромами акридиновим оранжевим (АО) (Sigma, США) і DAPI (Sigma, США) клітини вирощували у пластикових 96-лункових (8 мм) культуральних планшетах. Перед переглядом і фотографуванням до проби додавали флюорохроми у кінцевій концентрації 0,3-1,0 мкг/мл та інкубували 15 хв. Піддослідні культури оглядали під люмінесцентним мікроскопом МікМед-12 (ЛОМО, Санкт-Петербург, Росія) при збільшенні ~ 500-1000 разів в області збудження 450-480 нм та емісії 480-700 нм у випадку фарбування АО і в області збудження 330-360 нм та емісії 420-500 нм у випадку фарбування DAPI. У популяції 4Т1за дії 10 мкл/мл середовища препарату з Sophora japonica спостерігаємо клітини з проапоптичними змінами. За дії препарату у дозах 1 мкл/мл, 0,1 мкл/мл середовища у популяціях клітин значних морфологічних відмінностей клітин відносно контролю не спостерігаємо. Для дослідження апоптозу клітини культивувались у культуральних флаконах (25 см2), у які висіяно по 500000 клітин. На 72 год. інкубування з досліджуваною речовиною для виявлення апоптозу виділяли ДНК. Апоптичні клітини виявляли за характерною фрагментацією ДНК, яку виділяли і Комп’ютерна верстка І.Скворцова 12 розділяли методом електрофорезу в 1 % агарозному гелі (Кудрявец и др., 1996). ДНК фарбували етидій бромідом, який додавали в електродний буфер до кінцевої концентрації 2 мкг/мл. Зони ДНК на електрофореграмі виявляли в ультрафіолетовому випромінюванні. Деградація ДНК - показник термінальної фази апоптозу. При деградації ДНК спочатку відбувається фрагментування з утворенням великих фрагментів, що відповідають приблизно 300 тис. пар основ, трохи пізніше - 30-50 тис. пар основ. Наступний етап - міжнуклеосомна деградація ДНК, з формуванням фрагментів довжиною 180 пар основ (довжина нитки ДНК у нуклеосомі) чи кратних цій величині. Саме ці фрагменти були виявлені у вигляді «драбинки» при електрофорезі ДНК лізатів апоптичних клітин, який застосовується для ідентифікації апоптозу. Результати електрофореграми свідчать про виявлення фрагментації ДНК, а отже, загибель за механізмом апоптозу клітин лінії 4Т1, що культивувались у присутності галенового препарату Sophora japonica. При цьому значна частина ДНК знаходиться у низькомолекулярній формі. Таким чином, одержані результати досліджень у прикладах конкретного виконання способу, підтверджують ефективність заявленого способу. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601