Спосіб визначення молекулярно-генетичних маркерів діагнозу та прогнозу у дітей, хворих на саркому юїнга

Спосіб визначення молекулярно-генетичних маркерів діагнозу та прогнозу у дітей, хворих на саркому Юїнга, що включає дослідження наявності химерних транскриптів у пухлині та кістковому мозку методом полімеразно-ланцюгової реакції з використанням специфічних праймерів, який відрізняється тим, що полімеразно-ланцюгову реакцію проводять з використанням флюоресцентних зондів з детекцією результатів в режимі реального часу. (19) (21) u201103884 (22) 31.03.2011 (24) 25.11.2011 (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) ХРАНОВСЬКА НАТАЛЯ МИКОЛАЇВНА, КЛИМНЮК ГРИГОРІЙ ІВАНОВИЧ, ІОНКІНА НАТАЛІЯ ВАЛЕРІЇВНА, СВЕРГУН НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА, КАРАЧАРОВА ІРИНА ЮРІЇВНА, ПАВЛИК СЕРГІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ, ШАЙДА ОЛЕНА ВІКТОРІВНА, ЛУЗАН ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ 3 гностики и лечения прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей и лиц молодого возраста / Авт.: Л.П. Киселев, С.В. Петрович, Е.В. Баранов [и др.]: инструкция по применению, ГУ "Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии" и "Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова". - Минск, 2009.-11 с.], за яким визначають наявність химерних транскриптів EWS-FLI1, EWS-ERG за допомогою методу "вкладеної" ПЛР. Проведення аналізу включає такі етапи: виділення тотальної рибонуклеїнової кислоти (PF1K) з біологічного матеріалу, проведення реакції зворотної транскрипції з отриманням комплементарної до РНК дезоксирибонуклеїнової кислоти (кДНК), ампліфікація досліджуваної ділянки методом ПЛР з використанням двох пар специфічних праймерів, детекцією продуктів реакції методом електрофорезу в агарозному гелі. Позитивним в прототипі є те, що метод молекулярно-генетичного аналізу є досить чутливим та специфічним, і дозволяє виявити транскрипти химерних генів у біологічному матеріалі. Недоліком прототипу є те, що метод визначення химерних генів є тривалим та трудомісткім процесом, а також є недостатньо чутливим при виявленні дисемінованого ураження кісткового мозку та моніторингу мінімальної залишкової хвороби. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення молекулярногенетичних маркерів діагнозу та прогнозу у дітей, хворих на саркому Юїнга шляхом дослідження наявності химерних транскриптів EWS-FLI1, EWSERG, EWS-ETV1, EWS-ETV4, EWS-FEV в пухлині та кістковому мозку за допомогою двоетапної полімеразної ланцюгової реакції з детекцією результатів в режимі реального часу, що дасть можливість покращити диференційну діагностику, підвищити точність прогнозування перебігу захворювання, з можливістю подальшої оптимізації програм терапії. Поставлена задача вирішується наступним чином: У хворих отримували зразок пухлини шляхом трепан- або відкритої біопсії або (та) пунктат кісткового мозку з трьох точок (грудини, лівого та правого крила клубової кістки). Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки з 0,3 мл RNA-later фірми "Ambion" (США) для стабілізації РНК. Кістковий мозок переносили в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (6 % ЕДТА в співвідношенні 1:20 або 3,8 % розчин цитрату Na в співвідношенні 1:9). Пробірки обережно перевертали декілька разів для змішування кісткового мозку з антикоагулянтом. Забір, транспортування та зберігання біологічного матеріалу проводили згідно з рекомендаціями фірми-виробника RNA-later. Загалом, протягом 1 доби матеріал зберігали при 2-8 °C, довготривало - при -70 °C. РНК з пухлинної тканини виділяли за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно з рекомендаціями фірмивиробника. 64864 4 РНК з кісткового мозку виділяли методом кислотно-фенольної екстракції, використовуючи ПЛРтест-набір "Рибо-золь" фірми "Амплісенс" (Росія), згідно з рекомендаціями фірми виробника. Для роботи з РНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, які мають спеціальне маркування "Rnase-free", "Dnase-free". Використаний пластиковий посуд (пробірки, накінечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 %-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/1) в присутності RNase inhibitor (10 U/1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37 °C та протягом 5 хв при 75 °C з метою позбавлення від геномної ДНК, яка в даному випадку може бути джерелом хибних результатів. Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). Для проведення реакції зворотної транскрипції з отриманою РНК використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-100" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Отриману в результаті реакції зворотної транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНК-буфером. Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гена гліцеральдегід-3фосфат дегідрогеназа (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GAPDH. Для цього проводили реакцію ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США) та праймерів і зонду: - прямий праймер GAPDH-TGC-ACC-ACCAAC-TGC-TTA-GC; - зворотний праймер GAPDH-CAC-GAT-ACCAAA-GTT-GTC-ATG-GA; - флюоресцентний зонд GAPDH-TAMRA-CCCCTG-GCC-AAG-GT-VIC. Праймери використовували в концентрації 10М, зонд в концентрації - 20М. Готували таку реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер, 1 мкл зворотний праймер, 1 мкл флюоресцентний зонд, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems", США, 4,5 мкл ПЛР-води, 5 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 50 °C - 2 хвилини, 95 °C 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95 °C - 15 секунд і 60 °C - 1 хвилина. Одну частину отриманої кДНК використовували для проведення реакції ПЛР, іншу зберігали при -20 °C протягом 3 місяців та при -70 °C протягом року. Після закінчення реакції ампліфікації облік одержаних результатів проводили в режимі реального часу згідно з рекомендаціями фірмивиробника приладу. Метод визначення химерних транскриптів EWS-FLI type 1 та type 2 включає проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems" (США), з такою послідовністю: - прямий праймер FLU-5' CCA-AGT-CAA-TATAGC-CAA-CAG 3'; 5 - зворотний праймер FLI1-3' GGC-CAG-AATTCA-TGT-TAT-TGC 5'; - флюоресцентний зонд 1(EWS-FLI type 1) - 6FAM-ACG-GGC-AGC-AGA-ACC-CTT-CTT-ATTAМRA; - флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) VIC-ACG-GGC-AGC-AGA-GTT-CAC-TGC-TTAMRA. Праймери використовують у концентрації 0,5 мкМ, та флюоресцентні зонди у концентрації 0,25 мкМ. Для проведення реакції ампліфікації готують реакційну суміш: 1 мкл прямого праймера (FLI1), Імкл зворотного праймера (FLI1), флюоресцентний зонд 1 (EWS-FLI type 1) 0,5 мкл, флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) 0,5 мкл, 4,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США). До отриманої суміші додають 5 мкл розчину кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °C - 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів: 95 °C - 15 секунди, 60 °C - 1 хвилина. По закінченні реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Метод визначення химерних транскриптів EWS-ERG, EWS-ETV1, EWS-E1AF, EWS-ETV4 включає проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems" (США), з такою послідовністю: - прямий праймер ERG-5' ССA-AGT-CAA-TATAGC-CAA-CAG 3'; - зворотний праймер ERG-3' ТСС-AGG-AGGAAC-TGC-CАА-AG 5'; - прямий праймер FEV-5' TGG-TGG-ACC-CATGGA-TGA-AG 3'; - зворотний праймер FEV-3' TCG-GGT-TCTTCC-CGT-CCT-TG 5'; - прямий праймер ETV1-5' ACA-GCC-AAGCTC-CAA-GTC 33'; - зворотний праймер ETV1-3' TGT-GGG-TCCTTC-CCG-ATA-C 5'; - прямий праймер ETV4-5' TCC-TAC-AGCCAA-GCT-CC 3'; - зворотний праймер ETV4-3' GAG-AAG-CCCTCT-GTG-TGG 5'. Праймери використовують у концентрації 20 мМ. Для проведення реакції ампліфікації готують реакційну суміш: 1 мкл прямого праймера (ERG/ FEV/ ETV1/ ETV4), 1 мкл зворотного праймера (ERG/ FEV/ ETV1/ ETV4), 5,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США). До отриманої суміші додають 5 мкл розчину кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °C - 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів: 94 °C - 3 секунди, 58 °C - 6 секунд і 72 °C - 27 секунд та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 °C - 15 секунд, 60 °C - 30 секунд, 95 °C - 15 секунд, 60 °C 15 секунд. По закінченні реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реа 64864 6 льного часу згідно з рекомендаціями фірмивиробника приладу. При визначенні позитивного результату, тобто наявності химерних транскриптів EWS-FLI type 1 та type 2, або EWS-ERG, EWS-ETV1, EWS-ETV4, EWS-FEV в пухлині, ми можемо діагностувати у хворого саркому Юїнга, встановити належність хворого до певної „групи ризику". При наявності химерних транскриптів в кістковому мозку можемо підтвердити наявність метастазів або мінімальної дисемінованої хвороби в кістковий мозок, уточнити стадію захворювання. Все вищевикладене дозволяє оптимізувати програму терапії хворого. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені результати молекулярно-генетичних досліджень біологічного матеріалу двох хворих. І. Хворий Є-ий С. 2003 р. н. (амб. медична карта № 5126/08). Був прийнятий на консультацію в ДУ „Національний інститут раку" з діагнозом остеогенна пухлина крижово-здухвинного сегмента зліва, ПГЗ № 28853/2007: саркома Юїнга. Проведено операційне видалення пухлини. У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. З пухлинної тканини виділяли РНК за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/1) в присутності RNase inhibitor (10 U/1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37 °C та протягом 5 хв. при 75 °C з метою позбавлення від геномної ДНК Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). А також у хворого отримували зразки кісткового мозку з трьох точок (з грудини, лівого та правого крила клубової кістки та змішували з антикоагулянтом (6 % ЄДТА в співвідношенні 1:20 або 3,8 % розчин цитрату Na в співвідношенні 1:9) до та після проведеного лікування. РНК з кісткового мозку виділяли методом кислотно-фенольної екстракції, використовуючи ПЛР-тест-набір "Рибо-золь" фірми "Амплісенс" (Росія), згідно з рекомендаціями фірми виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/1) в присутності RNase inhibitor (10 U/1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37 °C та протягом 5 хв при 75 °C з метою позбавлення від геномної ДНК. Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). З отриманою РНК було проведено реакцію зворотної транскрипції. Для цього використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-100" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно з рекомендаціями фірмивиробника. Отриману в результаті реакції зворотної транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНКбуфером. Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гена гліцеральдегід-3фосфат дегідрогеназа (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GAPDH. Для цього проводили реакцію ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США) та праймерів і зонду: - прямий праймер GAPDH-TGC-ACC-ACCAAC-TGC-TTA-GC; 7 - зворотний праймер GAPDH-CAC-GAT-ACCAAA-GTT-GTC-ATG-GA; - флюоресцентний зонд GAPDH-TAMRA-CCCCTG-GCC-AAG-GT-VIC. Праймери використовували в концентрації 10М, зонд в концентрації - 20М. Готували таку реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер, 1 мкл зворотний праймер, 1 мкл флюоресцентний зонд, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems", США, 4,5 мкл ПЛР-води, 5 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 50 °C - 2 хвилини, 95 °C 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95 °C - 15 секунд і 60 °C - 1 хвилина. Метод визначення химерних транскриптів EWS-FLI type 1 та type 2 включає проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems" (США), з такою послідовністю: - прямий праймер FLI1-5' CCA-AGT-CAA-TATAGC-CAA-CAG 3'; - зворотний праймер FLI1-3' GGC-CAG-AATTCA-TGT-TAT-TGC 5'; - флюоресцентний зонд 1(EWS-FLI type 1) - 6FАM-ACG-GGC-AGC-AGA-ACC-CTT-CTT-ATTAMRA; - флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) VIC-ACG-GGC-AGC-AGA-GTT-CAC-TGC-TTAMRA. Праймери використовують у концентрації 0,5 мкМ, та флюоресцентні зонди у концентрації 0,25 мкМ. Для проведення реакції ампліфікації готують реакційну суміш: 1 мкл прямого праймера (FLI1), 1 мкл зворотного праймера (FLI1), флюоресцентний зонд 1(EWS-FLI type 1) 0,5 мкл, флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) 0,5 мкл, 4,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США). До отриманої суміші додають 5 мкл розчину к ДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °C - 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів: 95 °C - 15 секунд, 60 °C - 1 хвилина. По закінченні реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. Метод визначення химерних транскриптів транскриптів EWS-ERG, EWS-ETV1, EWS-FEV, EWSETV4 включає проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems", США з такою послідовністю: - прямий праймер ERG-5' CCA-AGT-CAA-TATAGC-CAA-CAG 3'; - зворотний праймер ERG-3' TCC-AGG-AGGAAC-TGC-CAA-AG 5'; - прямий праймер FEV-5' TGG-TGG-ACC-CATGGA-TGA-AG 3'; - зворотний праймер FEV-3' TCG-GGT-TCTTCC-CGT-CCT-TG 5'; 64864 8 - прямий праймер ETV1-5' ACA-GCC-AAGCTC-CAA-GTC 3'; - зворотний праймер ETV1-3' TGT-GGG-TCCTTC-CCG-ATA-C 5'; - прямий праймер ETV4-5' TCC-TAC-AGCCAA-GCT-CC 3'; - зворотний праймер ETV4-3' GAG-AAG-CCCTCT-GTG-TGG 5'. Праймери використовують у концентрації 20 мМ. Для проведення реакції ампліфікації готують реакційну суміш: 1 мкл прямого праймера (ERG/ FEV/ ETV1/ ETV4), 1 мкл зворотного праймера (ERG/ FEV/ ETV1/ ETV4), 5,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США). До отриманої суміші додають 5 мкл розчину кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °C - 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів: 94 °C - 3 секунди, 65 °C - 1 хвилина 58 °C - 6 секунд і 72 °C - 27 секунд та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 °C - 15 секунд, 60 °C - 30 секунд, 95 °C - 15 секунд. По закінченні реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. В результаті досліджень до призначення курсів хіміотерапії у хворого був виявлений химерний транскрипт EWS-ERG в біопсійному матеріалі, що дає можливість уточнити діагноз саркома Юїнга. Враховуючи відсутність химерних транскриптів EWS-FLI1, EWS-ERG, EWS-ETV1, EWS-ETV4, EWS-FEV в кістковому мозку, можна свідчити про відсутність метастазів у хворого. Після проведення 4-х курсів хіміотерапії по схемі "VIDE", через 3 місяці після початку лікування, було здійснене повторне молекулярно-генетичне дослідження кісткового мозку. В результаті дослідження химерний транскрипт EWS-ERG виявлено не було, що свідчить про правильний вибір стратегії лікування і доводить його ефективність. II. Хворий И-в.И. 1994 р. н. (амб. медична карта № 5131/10). Був прийнятий на консультацію в ДУ „Національний інститут раку" з діагнозом пухлина лівої лопатки. ПГЗ № 5525/07 саркома Юїнга лівої лопатки, з метастазами в ліву легеню. Проведено радикальне оперативне видалення пухлини лівої лопатки. ПГЗ № 332669-78/07 від 27.12.07 пухлина в некрозі після проведення поліохіміотерапії. У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. З пухлинної тканини виділяли РНК за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/1) в присутності RNase inhibitor (10 U/1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 37 °C та протягом 5 хв при 75 °C з метою позбавлення від геномної ДНК Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). А також у хворого отримували зразки кісткового мозку з трьох точок (з грудини, лівого та правого крила клубової кістки, які змішували з антикоагулянтом (6 % ЄДТА в співвідношенні 1:20 або 3,8 % 9 розчин цитрату Na в співвідношенні 1:9) до та після проведеного лікування. РНК з кісткового мозку виділяли методом кислотно-фенольної екстракції, використовуючи ПЛР-тест-набір "Рибо-золь" фірми "Амплісенс" (Росія), згідно з рекомендаціями фірми виробника. Виділену РНК обробляли ДНКазою 1 (3 U/1) в присутності RNase inhibitor (10 U/1) та MgCl2 (2mM) протягом 60 хв. при 3 °C та протягом 5 хв. при 75 °C з метою позбавлення від геномної ДНК Для цього використовували реактиви фірми "Applied Biosystems" (США). З отриманою РНК було проведено реакцію зворотної транскрипції. Для цього використовували ПЛР-тест-набір "Реверта-L-lOO" фірми "Амплісенс" (Росія) згідно з рекомендаціями фірмивиробника. Отриману в результаті реакції зворотньої транскрипції кДНК, розводили в 2 рази ДНКбуфером. Контроль якості отриманої кДНК проводили на основі визначення експресії гена гліцеральдегід-3фосфат дегідрогеназа (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GAPDH. Для цього проводили реакцію ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США) та праймерів і зонду: - прямий праймер GAPDH-TGC-ACC-ACCAAC-TGC-TTA-GC; - зворотний праймер GAPDH-CAC-GAT-ACCAAA-GTT-GTC-ATG-GA; - флюоресцентний зонд GAPDH-TAMRA-CCCCTG-GCC-AAG-GT-VIC. Праймери використовували в концентрації 10М, зонд в концентрації - 20М. Готували таку реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер, 1 мкл зворотний праймер, 1 мкл флюоресцентний зонд, 12,5 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems", США, 4,5 мкл ПЛР-води, 5 мкл кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 50 °C - 2 хвилини, 95 °C 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 40 циклів: 95 °C - 15 секунд і 60 °C - 1 хвилина. Метод визначення химерних транскриптів EWS-FLI type 1 та type 2 включає проведення реакції ампліфікації з використанням приладу 7300 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems" (США). Для цього використовували праймери і зонди фірми "Applied Biosystems" (США), з такою послідовністю: - прямий праймер FLI1-5' ССA-AGT-CАА-ТАТAGC-CАА-СAG 3'; - зворотний праймер FLI1-3' GGC-CAG-AATTCA-TGT-TAT-TGC 5'; - флюоресцентний зонд 1(EWS-FLI type 1) - 6FAM-ACG-GGC-AGC-AGA-ACC-CTT-CTT-ATTAMRA; - флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) VIC-ACG-GGC-AGC-AGA-GTT-CAC-TGC-TTAMRA. Праймери використовують у концентрації 0,5 мкМ, та флюоресцентні зонди у концентрації 0,25 мкМ. Для проведення реакції ампліфікації готують реакційну суміш: 1 мкл прямого праймера (FLI1), 1 мкл зворотного праймера (FLI1), флюоресцентний 64864 10 зонд 1(EWS-FLI type 1) 0,5 мкл, флюоресцентний зонд 2 (EWS-FLI type 2) 0,5 мкл, 4,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл Power SYBR Green PCR Master Mix фірми "Applied Biosystems" (США). До отриманої суміші додають 5 мкл розчину кДНК. Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 9 °C - 5 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів: 9 °C - 15 секунди, 60 °C - 1 хвилина. По закінченні реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. В результаті досліджень у хворого був виявлений химерний транскрипт EWS-FLI1 type 1 в пухлині, що свідчить про належність пухлини до сімейства саркоми Юїнга та характеризується поганим прогнозом. А також виявлено химерний транскрипт EWS-FLI I type 1 в кістковому мозку. Після проведення 6-х курсів хіміотерапії, через 1 рік після початку лікування, було здійснене повторне молекулярно-генетичне дослідження кісткового мозку. В результаті дослідження химерний транскрипт EWS-FLI I type 1 був виявлений в кістковому мозку, що дає нам можливість свідчити про метастази в лівому крилі здухвинної кістки. Виходячи з цього, хворому була встановлена належність до „групи високого ризику", та призначено лікування за протоколом Euro-EWING 99 для сарком Юїнга. Через 2 місяці, після оперативного видалення пухлини лівої лопатки та проведення поліхіміотерапії було здійснене повторне молекулярно-генетичне дослідження кісткового мозку. В результаті дослідження химерний транскрипт EWS-FLI1 type 1 виявленний не був, що свідчить про правильний вибір стратегії лікування і доводить його ефективність. Таким чином, визначення химерних генів транскриптів EWS-FLI1, EWS-ERG, EWS-ETV1, EWSETV4, EWS-FEV в клітинах пухлини та кісткового мозку за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу дозволяє діагностувати саркому Юїнга та примітивну нейроектодермальну пухлину; відповідним чином провести стратифікацію хворих; уточнити ступінь розповсюдженості процесу; визначити повноту досягнутої ремісії та забезпечує можливість оптимізації програм терапії. Джерела інформації: 1. Семенова А.И. Саркома Юинга и примитивные нейроэктодермальные опухоли (клиника, диагностика, лечение) / А.И. Семенова // Практическая онкология.-2005. - Т. 6, № 4. - С. 234-239. 2. Киселев Л.П. Клиническая значимость вида патологических химерных онкогенов EWS-FLI1 (t(11;22) (g22;g12)) и EWS-ERG (t(21;22) (g24;g12)) при опухолях семейства саркомы Юинга у детей / Л.П. Киселев, Т.М. Савицкая, О.В. Алейникова // Детская онкология.-2006. - № 1. - С. 11-15. 3. Мацко Д.Е. Саркомы костей: классификация, гистологическое строение, особенности морфологической диагнастики / Д.Е. Мацко // Практическая онкология.-2010. - Т. 11, № 1. - С. 1-10. 4. Иммуноцитохимическая диагностика сарком из малых округлых клеток / Л.М. Скляренко, Д.Ф. 11 Глузман, В.А. Надгорная [и др.] // Онкология.-2005. - Т. 7, № 4. - С. 327-329. 5. Семенова А.И. Саркома Юинга: заболевание, особенности диагностики, лечебная тактика / А.И.Семенова // Практическая онкология.-2010. Т. 11, № 1. - С. 45-52. 6. Undifferentiated Small Round Cell Sarcomas with Rare EWS Gene Fusion / L. Wang, R. Bhargava, T. Zheng [at el.] // J Моl. Diagn.-2007. - Vol.9, № 4. P. 498-509. 7. Association of EWS-FLI1 fusion with lower proliferative rate Ewing's sarcoma / E. de Alava, A. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 64864 12 Panizo, С R. Antonescu [at el.] // Am J Path.-2000. Vol. 156, № 3. - P. 849-855. 8. Способы диагностики и лечения прогностически неблагоприятных форм саркомы Юинга у детей и лиц молодого возраста / Авт.: Л.П. Киселев, СВ. Петрович, Е.В. Баранов [и др.]: инструкция по применению, ГУ "Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии" и "Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова". - Минск, 2009.-11 с. (прототип). Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601