Спосіб визначення мутацій в гені k-ras у хворих на колоректальний рак

Спосіб визначення мутацій в гені K-ras у хворих на колоректальний рак, що включає виділення дезоксирибонуклеїнової кислоти з біологічного матеріалу та проведення ампліфікації досліджуваної ділянки методом полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що визначення точкових мутацій гена проводять в один етап з використанням специфічних праймерів та флуоресцентних зондів з детекцією результатів в режимі реального часу. (19) (21) u201011894 (22) 07.10.2010 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ХРАНОВСЬКА НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА, СІТЬКО ВАЛЕНТИНА ВІТАЛІЇВНА, СВЕРГУН НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА, СКАЧКОВА ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ 3 Недоліком прототипу є те, що метод визначення поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів є тривалим, багатоетапним процесом, що підвищує імовірність контамінації зразків. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення мутацій в гені K-ras у хворих на колоректальний рак шляхом дослідження наявності точкових мутацій: К12-4 VALINE, К125 ASPARTATE, K12-6 ALANINE, КІЗ ASPARTATE, K12 CYSTEINE, К12-2 SERINE, К12-3 ARGININE в пухлинній тканині та в парафінізованих зразках пухлини за допомогою методу ПЛР з детекцією результатів в режимі реального часу, що дасть можливість прогнозувати відповідь на анти-EGFR терапію у хворих на колоректальний рак. Поставлена задача вирішується наступним чином: У хворих беруть після операційний матеріал пухлинну тканину поміщену в RNA-later або зафіксовану в парафіні. Для визначення наявності мутації в гені K-ras з пухлинного матеріалу виділяють геномну ДНК. Виділення ДНК з парафінових блоків потребує етапу депарафінізації. ДНК з пухлинної тканини, фіксованої в парафіні виділяють за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно рекомендації фірми-виробника. Хід методики виділення ДНК: Покласти невеликий шматок фіксованого в парафіні зразку тканини (вагою не більше 25 мг) в пробірки об'ємом 1,5-2 мл. Пробірки відповідно маркерують. - Додають 1200 мкл ксилену. Інтенсивно перемішують на вортексі. Прогрівають 5 хв при температурі 50°С. - Центрифугують на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. - Обережно відбирають супернатант за допомогою вакуумного відсмоктувача. Надалі працюють з осадом. - До осаду додають 1200 мкл етанолу (96-100 %) і обережно перемішують на вортексі. - Центрифугують на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. - Обережно відбирають етанол за допомогою вакуумного відсмоктувача. - Повторюють пункти 5-6. - Пробірки з відкритими кришками поміщають в термостат на 15-20 хв при 40-45С, потім на 20-40 хв при 37-40С, потім залишають ще на 15-45 хв при кімнатній температурі (до повного випарування етанолу). - Осад ресуспендують у 180 мкл буфера ATL. - Додають 20 мкл протеїнази К. Перемішують на вортексі. - Інкубують пробірки в термостаті при температурі 56 °С 20-30 хв, періодично перемішуючи на вортексі. - Додають в пробірки по 16 мкл РНКази. Перемішують на вортексі 15 сек. - Залишають на 2 хв при кімнатній температурі. 58444 4 - Центрифугують 5 сек на мікроцентрифузі (5000об/хв.), щоб забрати краплі з кришки пробірки. - Додають 200 мкл розчину AL Перемішують на вортексі. - Інкубують пробірки в термостаті при температурі 70 °С протягом 10 хв. - Ще раз перемішують на вортексі і центрифугують 5 сек при 5000 об/хв, щоб забрати краплі з кришки пробірки. - Додають 200 мкл 96 %-го розчину етанолу. Перемішують на вортексі, центрифугують 5 сек при 5000 об/хв. - Всю суміш переносять з 1,5 мл пробірки в 2 мл пробірку з фільтром (колонку). Суміш в колонку вносять, не зачіпаючи країв пробірки. - Центрифугують при 9000 об/хв 1 хв. - Змінюють піддон. Центрифугують 1 хв при 8000 об/хв. Змінюють піддон. - Додають 500 мкл розчину AW-1. Центрифугують 1 хв при 9000 об/хв. Змінюють піддон. - Додають 500 мкл розчину AW-2. Центрифугують 3 хв при 13000 об/хв. Змінюють піддон на 1,5 мл пробірку. - Додають 200 мкл розчину АЕ. Інкубують 5 хв при кімнатній температурі. - Центрифугують 1 хв при 9000 об/хв. У 200 мл елюенту міститься необхідна кількість ДНК/РНК. Зразок ДНК готовий до постановки полімеразної ланцюгової реакції. ДНК можна зберігати впродовж 7 днів при 2-8 °С, впродовж 1 року при - 20 °С та довготривало при - 70 °С. Концентрацію отриманої ДНК вимірюють методом спектрофотометрії на спектрофотометрі Nanodrop 1000, фірми «Thermo Scientific», США. Контроль якості отриманої ДНК проводять на основі визначення експресії гену β-актину, який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в кожній клітині. Для цього проводять реакцію ампліфікації з детекцією результатів в режимі реального часу з використанням приладу для Real-Time PCR та праймерів і зонду: B-actin: Прямий праймер-ТСА ССС АСА CTG TGC ССА ТСТ ACG А Зворотний праймер - CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G Зонд - 6-FAM-ATG ССС ТСС ССС ATG ССА ТСС TGC GT-TAMRA Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містить 1-10 нг геномної ДНК, 0,3 мкМ прямого праймеру, 0,3 мкМ зворотного праймеру, 0,2 мкМ зонду, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Використовують такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °С - 10 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 45 циклів: 95 °С - 15 сек і 60 °С - 1 хв. Після закінчення реакції ампліфікації проводять облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. Для проведення реакції ампліфікації фрагментів гену K-ras використовують праймери та зонди фірми «Applied Biosystems», США: 5 Праймери/зонди TaqMan зонд 1 Прямий праймер А K12-4VALINE(G12V) К12-5 ASPARTATE (G12D) K12-6ALANINE (G12A) КІЗ ASPARTATE (G13D) Праймери/зонди TaqMan зонд 2 Прямий праймер В K12CYSTEINE(G12C) K12-2SERINE(G12S) К12-3 ARGININE (G12R) 58444 6 Послідовність олігонуклеотидів (5'- 3') VIC-CTA ССА САА GTT ТАТ ATT CAG ТСА ТТТ ТСА -TAMRA GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG ТАТ ТАА СС ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC ТА ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC ТТ ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC TG CGT GTA TCG ТСА AGG САС ТСТ TGC СТА ССТ Послідовність олігонуклеотидів (5'- 3') FAM - САА TAMRA GAG TGC CTT GAC GAT АСА GCT A CTC ATG AAA ATG GTC AGA GAA ACC TTT АТС CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CAT CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCA CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCC Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містить: A) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру А, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12V/G12D/G12A/G13D), 0,2 мкМ зонду 1, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). B) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру В, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12C/G12S/G12R), 0,2 мкМ зонду 2, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Реакцію ампліфікації проводять на приладі ПЛР з детекцією результатів в режимі реального часу (7300/7500 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems", США) і використовують такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °С - 10 хв, накопичення ампліфікаційного продукту на протязі 50 циклів, 95 °С - 41 сек, 60 °С - 42 сек і 72 °С - 52 сек. Після закінчення реакції ампліфікації проводять облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені аналізи двох хворих. І. Хвора H.A.I. 1950 p. н. (історія хвороби № 10678) перебувала у відділенні абдомінальної онкології з діагнозом карцинома сигмовидної кишки pT4N1M1 ПГЗ № 35542-48/08 - помірно диференційована аденокарцинома кишки, метастази в реґіонарні лімфовузли; проведено операцію паліативна резекція сигмовидної кишки. Через 3 неділі після операції назначено першу лінію хіміотерапії в режимі XELOX (капецитабін 1000 мг/м2 дні 1-14, 2135 + оксалиплатін 130 мг/м2 дні 1, 21) + бевацизумаб 5мг/кг. Після трьох циклів терапії відповідно до критеріїв RECIST виявлено прогресію захворювання в печінці (за даними компьютерної томографії). В рамках проведення рандомізованого дослідження хворій в ЦВКГ (Центральний воєнний клінічний госпіталь) назначено другу лінію хіміотерапії в режимі FOLFIRI кожні дві неділі (фолінат кальцію 400 мг/м ; день 1, 5-фторурацил 2800 мг/м2 інфузія 46 год, день 1,2; іринотекан 180 мг/м2 день 1). Хвора отримала 16 курсів терапії. За даними компьютерної томографії відповідно до кри теріїв RECIST спостерігається часткова регресія метастазів в печінку. Для проведення аналізу використовували пухлинну тканину зафіксовану в парафіні. Для визначення наявності мутації в гені K-ras з пухлинного матеріалу виділяли геномну ДНК. ДНК з пухлинної тканини, зафіксованої в парафіні виділяли за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно рекомендації фірми-виробника. Невеликий шматок зафіксованого в парафіні зразку пухлинної тканини (вагою не більше 25 мг) поміщали в 1,5-2мл пробірки. Пробірки відповідно маркерували. Додавали 1200 мкл ксилену. Інтенсивно перемішували на вортексі. Прогрівали 5 хв при температурі 50 °С. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали супернатант за допомогою вакуумного відсмоктувача. Надалі працювали з осадом. До осаду додавали 1200 мкл етанолу (96-100 %) і обережно перемішували на вортексі. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали етанол за допомогою вакуумного відсмоктувача. До осаду повторно додавали 1200 мкл етанолу (96100 %) і обережно перемішували на вортексі. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали етанол за допомогою вакуумного відсмоктувана. Пробірки з відкритими кришками поміщали в термостат на 15-20 хв при 40-45 °С,потім на 20-40 хв при 37-40 °С, потім залишали ще на 15-45 хв при кімнатній температурі (до повного випарування етанолу). Осад ресуспендували у 180 мкл буфера ATL. Додавали 20 мкл протеїнази К. Перемішували на вортексі. Інкубували пробірки в термостаті при температурі 56 °С 20-30 хв, періодично перемішували на вортексі. Додавали в пробірки по 16 мкл РНКази. Перемішували на вортексі 15 сек. Залишали на 2 хв при кімнатній температурі. Центрифугували 5 сек на мікроцентрифузі (5000об/хв.), щоб забрати краплі з кришки пробірки. Додавали 200 мкл розчину AL. Перемішували на вортексі. Інкубували пробірки в термостаті при температурі 70 °С протягом 10 хв. Ще раз перемішували на вортексі і центрифугували 5 сек 7 58444 при 5000 об/хв, щоб забрати краплі з кришки пробірки. Додавали 200 мкл 96 %-го розчину етанолу. Перемішували на вортексі, центрифугували 5 сек при 5000 об/хв. Всю суміш переносили з 1,5 мл пробірки в 2 мл пробірку з фільтром (колонку). Суміш в колонку вносили, не зачіпаючи країв пробірки. Центрифугували при 9000 об/хв. 1 хвилину. Змінювали піддон. Центрифугували 1 хв при 8000 об/хв. Змінювали піддон. Додавали 500 мкл розчину AW-1. Центрифугували 1 хв при 9000 об/хв. Змінювали піддон. Додавали 500 мкл розчину AW2. Центрифугували 3 хв при 13000 об/хв. Змінювали піддон на 1,5 мл пробірку. Додавали 200 мкл розчину АЕ. Інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Центрифугували 1 хв при 9000 об/хв. У 200 мл елюенту міститься необхідна кількість ДНК/РНК. Зразок ДНК готовий до постановки полімеразної ланцюгової реакції. Концентрацію отриманої ДНК вимірювали методом спектрофотометрії на спектрофотометрі Nanodrop 1000, фірми «Thermo Scientific», США. Контроль якості отриманої ДНК проводили на основі визначення експресії гену -актину, який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в Праймери/зонди TaqMan зонд 1 Прямий праймер А K12-4VALINE(G12V) К12-5 ASPARTATE (G12D) К12-6 ALANINE (G12A) К13 ASPARTATE (G13D) Праймери/зонди TaqMan зонд 2 Прямий праймер В К12 CYSTEINE (G12C) К12-2 SERINE (G12S) К12-3 ARGININE (G12R) 8 кожній клітині. Для цього проводили реакцію ампліфікації з детекцією результатів в режимі реального часу з використанням приладу для Real-Time PCR та праймерів і зонду: B-actin: Прямий праймер-ТСА ССС АСА CTG TGC ССА ТСТ ACG А Зворотний праймер - CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G Зонд - 6-FAM-ATG ССС ТСС ССС ATG ССА ТСС TGC GT-TAMRA Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містила 1-10 нг геномної ДНК, 0.3 мкМ прямого праймеру, 0.3 мкМ зворотного праймеру, 0.2 мкМ зонду, 12.5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °С - 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 45 циклів: 95 °С - 15 секунд і 60 °С - 1 хвилина. Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. Для проведення реакції ампліфікації фрагментів гену K-ras використовували праймери та зонди фірми «Applied Biosystems», США: Послідовність олігонуклеотидів (5'- 3') VIC-CTA ССА САА GTT TAT ATT CAG ТСА ТТТ ТСА -TAMRA GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG ТАТ ТАА СС ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC ТА ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC TT ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC TG CGT GTA TCG ТСА AGG САС ТСТ TGC СТА ССТ Послідовність олігонуклеотидів (5' -3') FAM - САА TAMRA GAG TGC СТТ GAC GAT АСА GCT A СТС ATG AAA ATG TC AGA GAA ACC TTT АТС CTG ААТ ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CAT CTG ААТ ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCA CTG ААТ ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCC Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містила: A) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру А, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12V/G12D/G12A/G13D), 0,2 мкМ зонду 1, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). B) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру В, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12C/G12S/G12R), 0,2 мкМ зонду 2, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Реакцію ампліфікації проводили на приладі ПЛР з детекцією результатів в режимі реального часу (7300/7500 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems", США) і використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °С - 10 хвилин, накопичення ампліфікаційного продукту на протязі 50 циклів, 95 °С - 41 секунда, 60 °С - 42 секунди і 72 °С - 52 секунди. Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. В результаті досліджень у хворої виявлено мутацію G12V (валін) в гені K-ras. II. Хворий Є.А.К. 1966 р. н. (історія хвороби № 9166) перебував у відділенні абдомінальної онкології з діагнозом карцинома ректосигмовидного відділу товстої кишки pT3N1M1 ПГЗ № 30127-31/09 - низько диференційована аденокарцинома кишки, метастази в реґіонарні лімфовузли; проведено операцію паліативна резекція сигмовидної кишки. Через 3 неділі після операції назначено першу лінію хіміотерапії в режимі XELOX (капецитабін 1000 мг/м2 дні 1-14, 21-35 +оксалиплатін 130 мг/м2 дні 1, 21) + цетуксімаб начальна доза 400 мг/м , наступні - 250 мг/м кожні 7 днів. Після трьох циклів терапії відповідно до критеріїв RECIST виявлено стабілізацію захворювання в печінці (за даними компьюторної томографії). За даними компьюторної томографії відповідно до критеріїв RECIST спостерігалась регресія метастазів в печінці. Для проведення аналізу використовували пухлинну тканину зафіксовану в парафіні. Для визначення наявності мутації в гені K-ras з пухлинного матеріалу виділяли геномну ДНК. 9 58444 ДНК з пухлинної тканини, зафіксованої в парафіні виділяли за допомогою колонок "QIAamp DNA Mini Kit" фірми "QIAGEN" (США), згідно рекомендації фірми-виробника. Невеликий шматок зафіксованого в парафіні зразку пухлинної тканини (вагою не більше 25 мг) поміщали в 1,5-2мл пробірки. Пробірки відповідно маркерували. Додавали 1200 мкл ксилену. Інтенсивно перемішували на вортексі. Прогрівали 5 хв при температурі 50 °С. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали супернатант за допомогою вакуумного відсмоктувача. Надалі працювали з осадом. До осаду додавали 1200 мкл етанолу (96-100 %) і обережно перемішували на вортексі. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали етанол за допомогою вакуумного відсмоктувача. До осаду повторно додавали 1200 мкл етанолу (96100 %) і обережно перемішували на вортексі. Центрифугували на максимальних обертах (13000 об/хв) протягом 3 хв при кімнатній температурі. Обережно відбирали етанол за допомогою вакуумного відсмоктувача. Пробірки з відкритими кришками поміщали в термостат на 15-20 хв при 40-45 °С, потім на 20-40 хв при 37-40 °С, потім залишали ще на 15-45 хв при кімнатній температурі (до повного випарування етанолу). Осад ресуспендували у 180 мкл буфера ATL. Додавали 20 мкл протеїнази К. Перемішували на вортексі. Інкубували пробірки в термостаті при температурі 56 °С 20-30 хв, періодично перемішували на вортексі. Додавали в пробірки по 16 мкл РНКази. Перемішували на вортексі 15 сек. Залишали на 2 хв при кімнатній температурі. Центрифугували 5 сек на мікроцентрифузі (5000об/хв.), щоб забрати краплі з кришки пробірки. Додавали 200 мкл розчину AL. Перемішували на вортексі. Інкубували пробірки в термостаті при температурі 70 °С протягом 10 хв. Ще раз перемішували на вортексі і центрифугували 5 сек при 5000 об/хв, щоб забрати краплі з кришки пробірки. Додавали 200 мкл 96 %-го розчину етанолу. Перемішували на вортексі, центрифугували 5 сек при 5000 об/хв. Всю суміш переносили з 1,5 мл Праймери/зонди TaqMan зонд 1 Прямий праймер А K12-4VALINE(G12V) К12-5 ASPARTATE (G12D) К12-6 ALANINE (G12A) КІЗ ASPARTATE (G13D) Праймери/зонди TaqMan зонд 2 Прямий праймер В K12CYSTEINE(G12C) К12-2 SERINE (G12S) К12-3 ARGININE (G12R) 10 пробірки в 2 мл пробірку з фільтром (колонку). Суміш в колонку вносили, не зачіпаючи країв пробірки. Центрифугували при 9000 об/хв. 1 хвилину. Змінювали піддон. Центрифугували 1 хв при 8000 об/хв. Змінювали піддон. Додавали 500 мкл розчину AW-1. Центрифугували 1 хв при 9000 об/хв. Змінювали піддон. Додавали 500 мкл розчину AW2. Центрифугували 3 хв при 13000 об/хв. Змінювали піддон на 1,5 мл пробірку. Додавали 200 мкл розчину АЕ. Інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Центрифугували 1 хв при 9000 об/хв. У 200 мл елюенту міститься необхідна кількість ДНК/РНК. Зразок ДНК готовий до постановки полімеразної ланцюгової реакції. Концентрацію отриманої ДНК вимірювали методом спектрофотометрії на спектрофотометрі Nanodrop 1000, фірми «Thermo Scientific», США. Контроль якості отриманої ДНК проводили на основі визначення експресії гену Р-актину, який є "house-keeping" геном, що в нормі експресується в кожній клітині. Для цього проводили реакцію ампліфікації з детекцією результатів в режимі реального часу з використанням приладу для Real-Time PCR та праймерів і зонду: B-actin: Прямий праймер-ТСА ССС АСА CTG TGC ССА ТСТ ACG А Зворотний праймер - CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G Зонд - 6-FAM-ATG ССС ТСС ССС ATG ССА ТСС TGC QT-TAMRA Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містила 1-10 нг геномної ДНК, 0,3 мкМ прямого праймеру, 0,3 мкМ зворотного праймеру, 0,2 мкМ зонду, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95°С - 10 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 45 циклів: 95°С - 15 сек і 60°С - 1 хв. Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. Для проведення реакції ампліфікації фрагментів гену K-ras використовували праймери та зонди фірми «Applied Biosystems», США: Послідовність олігонуклеотидів (5'- 3') VIC-CTA ССА САА GTT TAT ATT CAG ТСА ТТТ ТСА -TAMRA GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG ТАТ ТАА СС ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC ТА ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC TT ТАТ CGT САА GGC ACT СТТ GCC TAC GCC TG CGT GTA TCG ТСА AGG САС ТСТ TGC СТА ССТ Послідовність олігонуклеотидів (5' -3') FAM - САА TAMRA GAG TGC CTT GAC GAT АСА GCT A CTC ATG AAA ATG GTC AGA GAA ACC TTT АТС CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CAT CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCA CTG AAT ATA AAC TTG TGG TAG TTG GAG CCC 11 58444 Реакційна суміш об'ємом 25 мкл містила: A) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру А, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12V/G12D/G12A/G13D), 0,2 мкМ зонду 1, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). B) 1-10 нг геномної ДНК, 1,0 мкМ прямого праймеру В, 1,0 мкМ зворотного праймеру (G12C/G12S/G12R), 0,2 мкМ зонду 2, 12,5 мкл 2Х TaqMan Gene Expression Master Mix ("Applied Biosystems", США). Реакцію ампліфікації проводили на приладі ПЛР з детекцією результатів в режимі реального часу (7300/7500 Real-Time PCR Systems фірми "Applied Biosystems", США) і використовували такий температурний режим: початок ампліфікації при 95 °С - 10 хв, накопичення ампліфікаційного продукту на протязі 50 циклів, 95 °С - 41 сек, 60 °С - 42 сек і 72 °С - 52 сек. Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу згідно рекомендацій фірми-виробника приладу. В результаті досліджень у хворого не виявлено мутацій в гені K-ras. Таким чином, наявність мутації в гені K-ras - є чітким прогностичним фактором відповіді на антиEGFR терапію у хворих на колоректальний рак. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 12 Джерела інформації: 1. Анализ соматических K-ras мутаций в полипах толстой кишки / М. А. Сазанова, Ю. Е. Ваганов, Е. Л. Корчагина [и др.] // Медицинская генетика. - 2005. - Т. 4. - С. 263. 2. Cancer Genome Project. BRAF and K-RAS mutations in colorectal hyperplastic polyps and serrated adenomas / Chan T.L., Zhao W., Leung S.Y. [et al.] // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63. - P. 4878-4881. 3. p53 and K-ras as prognostic factors for Dukes' stage В colorectal cancer / Bouzourene H., Gervaz P., Cerottini J. P. [and all.] // Eur. J. Cancer. - 2000. Vol. 36. - №. 4. - P. 1008-1015. 4. Doolittle B. R. detection of the mutated K-ras biomarker in colorectal carcinoma / Doolittle B. R., Emanuel J., Tuttle С // Exp. Мої. Pathol. -2001. - Vol. 70. - №. 3. - P. 289-301. 5. K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study / Brink M, de Goeij A. F., Weijenberg M. P. [et al.] // Carcinogenesis. - 2003. - Vol. 24. - №. 4. - P. 703-710. 6. Выявление K-ras-мутаций в парааортальных лимфоузлах и их прогностическое значение после хирургического лечения рака поджелудочной железы / Б. А. Агаев, Г. Ф. Муслимов, В. Ш. Ягублу, Н. Р. Бабаева // Хирургия. - 2008. - № 9. С. 64 - 69 (прототип). Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601