Спосіб селекції асоціацій мікроорганізмів-деструкторів

Изобретение относится к микробиологической очистке сточных вод и касается получения ассоциаций микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, предназначенных для очистки многокомпонентных и высококонцентри'рованных сточных вод. Целью изобретения является увеличение деструктивной активности и расширение функциональных возможностей ассоциаций и их устойчивости к нагрузкам по токсическим веществам. Способ заключается в том, что образец субстрата помещают в питательную среду с токсическими веществами и проводят периодическое культивирование содержащихся в нем микроорганизмов до отчетливо регистрируемой убыли наиболее стойкого к биодеградации токсиканта, после чего в среду вводят носитель для аутоиммобилизации микроорганизмов и начинают повышать концентрацию токсических "веществ по мере 50%-ного разрушения наиболее стойкого из них, пока деструктивная активность ассоциации по отношению к нему не снизится до 3545% от максимально достигнутой в этих условиях величины, после чего носитель с иммобилизованной ассоциацией переносят в условия непрерывного культивирования и продолжают повышать концентрацию токсических веществ до того момента, когда деструктивная активность ассоциации по отношению к тому же веществу снизится до 25-35% от максимально достигнутой уже в , : условиях непрерывного культивирования величины, затем концентрацию токсических веществ снижают до тех пор» пока ассоциация не начнет проявлять максимальную деструктивную активность. Способ позволяет повысить активность ассоциаций в 3-5 раз и увеличить устойчивость к токсикантам в 2-7 раз. Продолжительность селекции ассоциации составляет 2-3 месяца, 3 табл. С 1 1409657 Изобретение относится к микробиологической очистке сточных вод и касается получения ассоциаций микроорганизмов-деструкторов токсических веществ, предназначенных для очистки многокомпонентных и высококонцентрированных сточных вод. Цель изобретения - увеличение деструктивной активности и расширения 10 функциональных возможностей ассоциаций и их устойчивости к нагрузкам по токсическим веществам. Способ заключается в том, что образцы субстратов, желательно имевших 15 более или менее продолжительный контакт с теми токсикантами, для разрушения которых отбирается предлагаемым способом ассоциация,'например, ил отстойников соответствующих сточ- 20 ных вод, помещают в питательную среду с невысокими концентрациями токсических веществ и проводят периодическое культивирование содержащихся в них микроорганизмов до отчетливо регистрируемой убыли токсических веществ (не менее 30% содержания наиболее стойкого к биодеградации токсиканта), после чего в среду вводят любой носитель для аутоиммобилизации * 30 микроорганизмов и продолжают культивирование в тех же периодических условиях, дробно повышая концентрацию токсикантов по мере 50%-ного разрушения наиболее устойчивого из них до тех пор, пока максимально достигну- 35 тый в этих условиях уровень его разрушения не снизится до 35-45%, после чего ассоциацию микроорганизмов, иммобилизованную на носителе, переносят в условия непрерывного культивирова- 40 ния и продолжают обработку возрастающими концентрациями до того момента, когда деструктивная активность ассоциации по отношению к наиболее устойчивому токсиканту снизится до 25-35% 45 от максимально достигнутой уже в условиях непрерывного культивирования величины, после чего концентрацию , токсических вешеств постепенно снижают до тех пор, пока ассоциация не 50 начнет проявлять максимальную деструктивную активность. Особенностью способа является смена условий культивирования микроорга55 низмов, закрепленных на носителе, с периодических на непрерывные, что позволяет продолжить обработку ассоциаций возрастающими концентрациями токсических веществ для повышения их I деструктивной активности. Способ позволяет повысить активность ассоциации в 3-5 раз и увеличить устойчивость к токсикантам в 2-7 раз. Продолжительность селекции ассоциации составляет 2-3 месяца. Соотношение между концентрацией основного токсического вещества, уровнем его разрушения и количеством жизнеспособных клеток микроорганизм мов в ассоциации представлено в табл. 1. П р и м е р 1. Для селекции ассоциации микроорганизмов-деструкторов надсмольных сточных вод производстг ва анклино-фенол-формальдегидных смол, содержащих 2,4% фенола, 3,6% метанола и 2,3% формальдегида, берут 100 г соскоба со стен отстойника этих вод и помещают в колбы Эрленмейера емкостью 1 л. Средой для культивирования микроорганизмов служат реальные сточные воды отстойника, разбавленные водопроводной водой таким образом, чтобы первоначальное содержание наиболее стойкого из токсических субстратов (фенола) не превышало 500 мг/л, и при этом добавляют соли, г/л: 1,0 NH 4 NO 3 ; 0,7 К 2 Н Р 0 4 ; 0,3 KHjPO*; 0,1 MgSO 4 . Первую стадию селекции осуществляют в условиях периодического культивирования: колбы помещают на качалку с 150 об/мин при 34°С. Ежедневно определяют убыль токсических веществ в среде по общепринятым методикам, Пбсле отчетливо регистрируемой убыли (на 30%) наиболее стойкого к биоразрушению токсического вещества (фенола) в среду вносят носитель (стеклоерш массой 10 г) для закрепления микроорганизмов. Затем по мере 50Х-НОЙ убыли фенола концентрацию токсических веществ увеличивают с интервалом 250 мг фенола/л до величины 2 г/л, при которой уровень разрушения фенола снижается до 45% от максимально достигнутого (табл. 1, * этап I ) . Затем носитель с ассоциацией микроорганизмов, отселекционированнои на первой стадии, помещают в условия непрерывного культивирования: в колонку прямоточной установки емкостью 1 л с автоматической подачей сточной воды при Д - 0,033 ч~* , и продолжают 57 повышать концентрацию токсических веществ в подаваемом в установку растворе с интервалом 500 мг/п фенола с 2 г/л до величины 12 г/л, при которой степень разрушения фенола снижается до 35% от максимально достигнутой в протоке, после чего нагрузку по токсическим веществам уменьшают с тем же интервалом (500 мг/л) до вели- 10 чины, равной 5 г/л фенола, при которой уровень его разрушения оказывается максимальным для данных условий - 98% (табл. 1, этап II). Общая продолжительность селекции 15 ассоциации по данному способу составляет 2-3 мес. По способу получена ассоциация микроорганизмов-деструкторов для очистки надсмольных сточных вод произ- 20 водства анилино-фенол-формальдегидньгх смол (ПО "Карболит"), содержащих фенол, метанол и формальдегид, и состоящая из Bacillus licheniformis (40%), Bacillus megaterium (40%) и 25 Pseudomonas sp. (20%). Для сравнения деструктивной активности ассоциаций, полученных предлагаемым и известным способами, изуча-( ют удельную производительность ассо30 циаций по известной сЬормуле: t p • i = = (С,~С 0 )*Д, где С, - исходная концентрация токсического вещества; С о его остаточная концентрация; Д - скорость разбавления, Полученные расчеты 35 приведены в табл, 2, Как видно из табл. 2, удельная про- і изводительность ассоциации по известному способу составляет 0,018 г-л-ч*' а по предлагаемому 0,2178 г л-ч~*, 40 т.е. в 12 раз выше. Для сравнения устойчивости ассоциаций, полученных предлагаемым и изизвестным способами, к нагрузкам по токсическим веществам бактериальную 45 массу каждой ассоциации из расчета 10 клеток/мл вносят в два ряда колб емкостью 50 мл с синтетической питательной средой, содержащей смесь химически чистых реществ фенол-метанол50 -формальдегид в концентрации от 1 до 10 г/л, и устанавливают ту наивысшую концентрацию ксенобиотиков, при которой число жизнеспособных клеток в ассоциации не снижается. Определение микробной биомассы проводят через 55 24 ч контакта по оптической плотности бактериальных суспензий, которую измеряют при 600 нм па спектрофото p Эксперимент показал, что ассоциация, полученная по предлагаемому способу, после 24 ч контакта с ксенобиотиками не снижает жиянеспособности при нагрузке фенол-метанол-формальдегидом в концентрации 4-5-5 г/л, а по известному способу при 1-2-2 г/л соответственно. П р и м е р 2. Для селекции ассоциации микроорганизмов-деструкторов с целью использования ее для очистки сточных вод производства "АНИД" от гексаметилендиамина (ГМД) и соли АГ (адипиновая кислота и гексаметилендиамин) почвенную болтушку активно- ' го ила (4 г) помещают в колбу Эрленмеиера емкостью 1 л. В дальнейшем выполняют манипуляции, аналогичные описанным в примере 1, Общее время адаптации микроорганизмов по данному способу 2-3 мес. Полученная ассоциация разрушает гексаметилендиамин за 48 ч на 99%. П р и м е р 3. Для селекции ассоциации микроорганизмов-деструкторов органических соединений производства полиизоцианата (анилина и др.) сточную воду из промотвала (500 мл) помещают в колбы Зрленмейера. В даль- * нейшем применяют манипуляции, описанные в примере 1. Общее время адаптации комплекса микроорганизмов-деструкторов - 2 мес„ Ассоциация разрушает анилин за 24 ч на 100%. Сравнительные данные по деструктивной активности ассоциаций, полученных для очистки различных сточных вод известными и предлагаемым способами, приведены в табл. 3„ Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов для очистки сточных вод, предусматривающий формирование ассоциаций в процессе периот дического или непрерывного культивирования микроорганизмов в питательной среде с постепенно возрастающей концентрацией токсических веществ и аутоиммобилизациеи микроорганизмов на носителе, о т л и ч а ю в; и й с я тем, что, с целью увеличения деструктивной активности и расширения функциональных возможностей ассоциаций и их устойчивости к нагрузкам по токсическим веществам, культивирование 1409657 осуществляют в две стадии с изменением условий с периодических на непрерывные, при этом на первой стадии концентрацию токсических веществ по- 5 вышаю? до уровня, при котором деструктивная активность ассоциации по отношению к наиболее стойкому к биодеградации токсиканту из числа присутствующих в среде снижается до 35- 10 45% от максимально достигнутой в этих условиях величины, а затем процесс осуществляют в непрерывных условиях и концентрацию токсических веществ продолжают повышать до уровня, при 15 котором деструктивная активность ас сопиации по отношению к -этому же веществу снижается до 25-35% от максимально достигнутой в этих условиях величины, вслед за чем концентрацию токсических веществ снижают до величины, при которой ассоциация осуще~ ствляет максимальное разрушение наиболее устойчивого токсиканта, при этом процесс на второй стадии проводят с аутоиммобилизованнои ассоциацией, полученной на первой стадии, для чего носитель с микроорганизмами непосредственно переносят из периоди— ческих условий в непрерывные. f Т а б л и ц а Этап селек Исходная концентрация фено Разрушение фенола, х ла, г/л Количество жизнеспособных клеток,% nuu ЦП И Условия культивирования периодичес непрерыв- перио- непредичес- рывное ное периодичес кое 0,5 20 33 64 1,0 42 I 43 1,25 54 39 1.5 60 1,75 55 ное 75 0,75 непрерыв кое 31 25 кое 2,00 2,00 45 50 20 31,4 2,25 2,5 2,5 56 34,6 3,00 38,2 3,5 59 63 4,0 65 46,8 4,5 73 66,4 5,0 78 69,3 5,5 76 65,2 6,0 75 64,4 6,5 71 59,0 7,0 65 47,4 7,5 60 42,5 2,75 3,00 1 39,0 140% f 8 Продолжение табл. 1 Этап селекция Исходная концентрация фенола, г/л Разрушение фе нола, % Количество жизнеспособных клетокГХ Условия культивирования перноцнческое непрерыв- перно ное дичес Kqe непрерывное перио дичес кое непрерыв ное 8,0 58 37,8 8,5 56 37,4 9,0 54 37,0 9,5 52 36,2 10,0 50 35,8 10,5 49 34,2 11,0 48 31,5 11,5 48 31,5 45 25,0 12,0 , 12,5 40 45 20,0 25,0 13,0 11,0 30 48 15,0 33,0 13,5 II 11,5 10,5 25 50 35,0 14,0 10,0 20 55 41,0 9,5 60 52,0 9,0 67 55,0 8,5 69 57,0 8,0 70 63,2 7,5 73 64,3 7,0 75 67,2 6,5 81 71,2 6,0 83 75,1 5,5 87 76,3 5,0 98 78,9 4,5 98 78,9 1409657 Т а б л и ц а С., г/л С по с of» (С,-С о ) Д*, С., г/л г/л Г* Л • Ч " Известный 1,403 0,945 0,557 Предлагаемый 4,025 0,350 3,675 П р и м е ч а н и е . 0,018 0,2178 * Д = 0,033 ч ~ ( . I Состав сточных вод (загрязнители) Т а б л и ц а периодический Фенол непрерывный Предлагаемый способ 6,3 12 Метанол 1 2 13 20 Формальдегид 2, 5 12 18 1 3 6 1 2 5 0,5 о,3 1 3 0,7 2 II Соль АГ III Метакрилат Стирол 1 4 Крезол о,5 о,7 2 5 Ароматические амины в т.ч. . анилин 1 3 5 IV Бензол V Редактор И. Сегляник 3 Количество разрушенных ксе нобиотиков, г/л Известные способы I 1 составитель С. Лях Техред л.Олийнык Корректор Э.Лончакова Заказ 3446/26 Тираж 520 Подписное ВНІЇИІІИ Государственного комитета СССР по долам изобретений и открытий 1130^5, Мосьвя, Ж-35, Раушская наб„, д , 4/5 Производс'ВРННО-ПОПИІ ряфч-др^кое предприятие, г. Ужгород, уп. Проекгнан. 4