Спосіб оцінки ефективності застосування нанокомпозиту високодисперсного кремнезему та кластерів срібла

Реферат: Спосіб оцінки ефективності застосування нанокомпозиту високодисперсного кремнезему та кластерів срібла включає проведення мікробіологічних досліджень протимікробних властивостей. Оцінюють ефективність композиту по мінімальній інгібуючій концентрації та мінімальній бактерицидній концентрації. UA 68895 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ЕФЕКТИВНОСТІ ЗАСТОСУВАННЯ НАНОКОМПОЗИТУ ВИСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМУ ТА КЛАСТЕРІВ СРІБЛА UA 68895 U UA 68895 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до експериментальної медицини, точніше до визначення протимікробної активності і може використовуватися для покращення результатів застосування препаратів на основі високодисперсного кремнезему. Значний науково-практичний інтерес мають дослідження препаратів з наносрібла, що проявляють активність проти мікроорганізмів, в тому числі, стійких до антибіотиків [1]. Саме тому розробка методів оцінки ефективності даних нових лікарських засобів, синтезованих шляхом нанотехнологій, з більш вираженими фармакологічними властивостями, є актуальним завданням сьогодення [2]. Проведені дослідження показали можливість формування нанокластерів срібла шляхом механосорбційного покриття поверхні нанорозмірного кремнезему моношаром срібла нітрату (AgNО3) у газовому дисперсійному середовищі і наступного термолізу солі. Розроблений і синтезований спільними зусиллями вчених Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця та Інституту хімії поверхні ім. О.О.Чуйка НАН України нанокомпозит "високодисперсний кремнезем-кластери срібла" розглядається як перспективний препарат комплексної антибактеріальної і сорбційно-детоксикаційної дії для застосування у медичній практиці [3,4]. Таким чином, важливою частиною застосування нанокомпозиту, є протимікробними ефект, що пов'язаний з сорбційними та детоксикаційними властивостями. Існує спосіб оцінки протимікробних властивостей нанокомпозиту "високодисперсний кремнезем-кластери срібла" [5]. Однак, вказаний спосіб не дозволяє оцінити клінікофармакологічну ефективність застосування нанокомпозиту в медичній практиці. Найбільш близьким за технічним вирішенням до способу, що заявляється, є спосіб дослідження протимікробної активності та ефективності [6], який виступає як прототип. Цим способом досліджують протимікробні властивості композиту високодисперсного композиту кремнезему срібла, за допомогою мікробіологічного дослідження на мікроорганізмах штамів: Escherichia coli (ATCC 2732, Klebsiella pneumoniae (АТСС 4352), Pseudomonas fluorescens (LME 2333), Salmonella enterica serovar Enteritidis (Dl), Salmonella enterica serovar Typhimurium (DB 7155), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Bacillus cereus (ATCC 14579), Listeria monocytogenes (Scott A), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Candida albicans (ATCC 10259), Aspergillus niger (ATCC 9642). Однак, цей спосіб має недоліки, так як він має низьку інформативність для медичної практики через те, що в ньому використовуються штами мікроорганізмів, які не є тестовими штамами для визначення антимікробної дії лікарських засобів, потребує використання спеціальних поживних середовищ та отримання ліцензії та організації спеціальних умов для роботи зі штамами даних мікроорганізмів. Задачею корисної моделі є встановлення ефективності застосування нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла", як протимікробного лікарського засобу. Технічний результат, який досягається, полягає в удосконаленні методів оцінки протимікробної активності препаратів наночастинок срібла. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, що передбачає мікробіологічні дослідження протимікробних властивостей нанокомпозиту "високодисперсного кремнеземукластерів срібла", згідно корисної моделі, оцінюють ефективність композиту по мінімальній інгібуючій концентрації та мінімальній бактерицидній концентрації по відношенню до Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027), отримані результати порівнюють з активністю срібла нітратом і при нормалізації показників оцінюють ефективність препарату. Переваги цього способу: використання тестових штамів мікроорганізмів для визначення антимікробної дії лікарських засобів, зручність роботи з даними культурами мікроорганізмів, доступність даних культур мікроорганізмів, відсутність потреби проходження спеціального ліцензування для роботи з ними. За допомогою цього способа можливо прогнозувати ефективність застосування нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла", та проводити контроль протимікробної активності нової сполуки. Спосіб здійснювався наступним чином. Використані штами мікроорганізмів. Дослідження антимікробної активності нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" та нітрату срібла проводили на отриманих із УКМ (Українська колекція мікроорганізмів): Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027). Дані мікроорганізми є тестовими штамами для визначення антимікробної дії лікарських засобів [7]. 1 UA 68895 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використані поживні середовища. Отримання добових культур мікроорганізмів, приготування вихідних і робочих суспензій мікроорганізмів та препаратів, визначення мінімальних інгібуючих концентрацій (МІС) досліджуваних речовин проводили у рідкому середовищі LB (Luria-Bertani broth, Merck, Germany). Висів аліквот дослідних і контрольних суспензій для встановлення мінімальних бактерицидних/фунгіцидних концентрацій (MBC/MFC) препаратів проводили на щільне поживне середовище LB (Luria-Bertani medium, Merck, Germany) в чашки Петрі. Дослідження антимікробних властивостей сполук. Вихідний розчин нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" одержували шляхом розчинення 672,8 мг в 2 мл середовища LB. Отримана таким чином суспензія сполуки із концентрацією 336,4 мг/мл застосовували для визначення антимікробних властивостей щодо S. aureus. Для С. albicans концентрацію композиту у вихідному розчині знижували вдвічі (168,2 мг/мл). З цією метою 1 мл вихідного розчину змішували із аналогічними об'ємом вихідного середовища. Таким же ж чином досягали двократного зниження концентрації вихідного розчину (84,1 мг/мл) для дослідження активності щодо Е. соїі та Р. aeruginosa. В подальшому, для кожного виду мікроорганізмів готували ряд із 12 пробірок, в які вносили по 0,5 мл середовища LB. Із вихідного розчину нанокомпозиту відбирали 0,5 мл і вносили у перші пробірки кожного ряду, після чого готували подвійні серійні розведення. Приготування вихідних і робочих розчинів нітрату срібла проводилось за описаною вище методикою із деякими модифікаціями. Для отримання вихідного розчину відбирали 125,4 мг нітрату срібла і розчиняли в 2 мл LB. Даний розчин розводили у співвідношенні 1:10 (по об'єму) і досягали необхідної вихідної концентрації препарату - 6,27 мг/мл. Розчин такої концентрації вносили у пробірки із С. albicans. Для впливу на S. aureus вміст нітрату срібла знижували до 3,14 мг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - до 1,57 мг/мл. В подальшому у пробірки із 0,5 мл чистого середовища LB вносили аналогічні об'єми вихідних розчинів нітрату срібла і також проводили серію із 12 подвійних серійних розведень. Добові культури мікроорганізмів отримували шляхом їх культивування у рідкому середовищі LB протягом 18-24 год при 37°С. Із добових культур готували вихідні бактеріальні суспензії за стандартом мутності 0,5 Од по МакФарланду (титр близько 1,5x10 КУО/мл). Останні розводили у співвідношенні 1:5 (по об'єму) і отримували робочі суспензії мікроорганізмів. В подальшому, у пробірки із приготовленими подвійними розведеннями досліджуваних препаратів вносили по 0,5 мл робочих суспензій. Таким чином, кінцевий об'єм розчину в досліджуваних пробірках сягав 1 7 6 мл. При цьому, титр S. aureus, Ε. соlі і P. aeruginosa становив 10 КУО/мл, а С. albicans - 10 КУО/мл. В дослідних зразках робочі концентрації, із яких розпочинали досліджувати вплив нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" на мікроорганізми, становили: для S. aureus - 84,1 мг/мл, для С. albicans - 42,05 мг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - 21,03 мг/мл. Кінцевими досліджуваними концентраціями нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" були: для S. aureus - 0,04 мг/мл, для С. albicans -0,02 мг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - 0,01 мг/мл. Вміст чистого срібла у новосинтезованому нанокомпозиті срібла «Аргосил» становив 7,61%. Виходячи із цього, діапазон концентрацій чистого срібла у дослідних пробірках із вказаним препаратом для S. aureus знаходився в межах від 6400 до 3,13 мкг/мл, для С. albicans - від 3200 до 1,56 мкг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - від 1600 до 0,78 мкг/мл. Робочі концентрації нітрату срібла в дослідних зразках для С. albicans становили від 1567,5 до 0,77 мкг/мл, для S. aureus - від 783,75 до 0,38 мкг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - від 391,88 до 0,19 мкг/мл. Ступінь чистоти досліджуваного препарату нітрату срібла становив 99,8%, а вміст чистого срібла у даній солі відповідав 63,5%. Виходячи із цього, діапазон концентрацій чистого срібла у дослідних пробірках із нітратом срібла для С. albicans знаходився в межах від 998,95 до 0,49 мкг/мл, для S. aureus - від 499,47 до 0,24 мкг/мл, а для Е. соlі та P. aeruginosa - від 249,74 до 0,12 мкг/мл. Одночасно із дослідними варіантами в дослідженнях були також використані контрольні зразки. Для отримання позитивних контролів росту мікроорганізмів у пробірки із 0,5 мл LB вносили аналогічні об'єми кожної із досліджуваних культур без додавання препаратів. Як негативні контролі росту мікроорганізмів використовували пробірки із 0,5 мл LB та 0,5 мл робочих суспензій досліджуваних культур (без внесення препаратів), які витримували протягом 24 год. при 4°С. Як негативні контролі чистоти середовища слугували пробірки із 1 мл середовища LB без додавання бактеріальних суспензій і препаратів. Як негативні контролі чистоти препаратів використовували їх подвійні серійні розведення в концентраціях, аналогічних створюваним у дослідних зразках, до яких замість бактеріальних суспензій 2 UA 68895 U 5 10 15 20 25 добавляли 0,5 мл вихідного LB. Всі описані контролі готували у двох зразках. Інкубування дослідних і контрольних суспензій, за виключенням негативних контролів росту мікроорганізмів, здійснювали на качалці при 37°С та інтенсивному перемішуванні (240 об/хв.) протягом 24 год. Перед врахуванням результатів перевіряли негативні контролі середовища і препаратів на відсутність росту мікроорганізмів, а позитивні контролі - на наявність росту. Після цього дослідні зразки порівнювали із негативними контролями росту мікроорганізмів, вносячи корективи на наявність мутності у суспензіях відповідно до негативних контролів чистоти препаратів. Для кожного ряду дослідних пробірок визначали першу концентрацію, при якій спостерігалась відсутність видимого росту мікроорганізмів. Дану концентрацію позначали як мінімальну інгібуючу (пригнічуючу, бактеріостатичну) концентрацію (МІС) відповідного препарату по відношенню до досліджуваного виду мікроорганізмів. Наступним етапом досліджень було визначення мінімальних бактерицидних концентрацій препаратів. Для цього із усіх дослідних зразків з відсутністю видимого росту, а також із усіх контрольних пробірок здійснювали висів 200 мл відповідних суспензій на чашки із щільним середовищем LB. Після рівномірного розподілення кожної із суспензій по поверхні агару і його підсихання, чашки інкубували при 37°С протягом 24 год в термостаті. В подальшому, на щільному середовищі підраховували утворені колонії, які вказували на кількість життєздатних мікроорганізмів у відповідних бактеріальних суспензіях. Даний показник виражали у колонієутворюючих одиницях (КУО). Мінімальну бактерицидну (фунгіцидну) концентрацію відповідного препарату по відношенню до досліджуваних видів мікроорганізмів визначали за першою концентрацією, при якій із внесених на щільне середовище аліквот бактеріальних суспензій виявлявся ріст менше 200 КУО. Вказані показники для S. aureus, Ε. coli та P. aeruginosa позначали як МВС (мінімальна бактерицидна концентрація), а для С. albicans - як MFC (мінімальна фунгіцидна концентрація). У висівах із позитивних і негативних контролів росту оцінювали наявність газонів зливного росту , а з негативних контролів середовища і чистоти препаратів (із зразків з максимальними концентраціями препарату) - відсутність росту мікроорганізмів. При дотриманні зазначених умов для контрольних зразків проведений експеримент розглядали як поставлений коректно. Описані дослідження повторювали двократно, отримані результати піддавали статистичній обробці. 30 Таблиця Результати експериментальної перевірки активності нанокомпозиту "високодисперсного кремнеземукластерів срібла" по відношенню до досліджуваних мікроорганізмів Видова належність досліджуваних мікроорганізмів Мінімальна інгібуюча концентрація МІС (мкг/мл) перерахунок на препарату чисте срібло Мінімальна бактерицидна/фунгіцидна концентрація MBC/MFC (мкг/мл) перерахунок на препарату чисте срібло Staphylococcus aureus 330 25 2630 200 УКМ В-904 Escherichia coli УКМ В330 25 660 50 906 Candida albicans YKMY660 50 2630 200 1918 Pseudomonas 2630 200 5260 400 aeruginosa УКМ В-900 Активність нітрату срібла по відношенню до досліджуваних мікроорганізмів Мінімальна інгібуюча концентрація МІС Мінімальна бактерицидна/фунгіцидна Видова належність (мкг/мл) концентрація MBC/MFC (мкг/мл) досліджуваних перерахунок на перерахунок на мікроорганізмів препарату препарату чисте срібло чисте срібло Staphylococcus aureus 73,48 46,76 97,97 62,43 УКМ В-904 Escherichia coli УКМ В12,24 7,8 73,48 46,76 906 Candida albicans УКМУ73,48 46,76 146,96 93,51 1918 Pseudomonas 36,73 23,37 73,48 46,76 aeruginosa УКМ В-900 3 UA 68895 U 5 10 15 20 25 30 Аналізуючи отримані результати по дослідженню антимікробної активності нанокомпозиту срібла та нітрату срібла необхідно відмітити, що речовини характеризувались неоднаковим впливом на досліджувані мікроорганізми. Однак, отримані експериментальні дані підтверджують протимікробні властивості нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла", по відношенню до досліджуваних мікроорганізмів. Результати експериментальних досліджень прогнозують доцільність застосування нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" як протимікробного препарату з сорбційними властивостями. На базі Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України та кафедри фармакології та клінічної фармакології НМУ ім. О.О.Богомольця проведено вивчення застосування синтезованого нанокомпозиту на досліджувані штами мікроорганізмів. Таким чином, даний спосіб досить точний для оцінки ефективності застосування нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" і може бути рекомендованим для впровадження в медичну практику. Література 1. The antibacterial activity of biogenic silver and its mode of action / L. Sintubin, B. De Gusseme, P. Van der Meeren et al. // Appl Microbiol Biotechnol. -2011.- Vol.91. - № 1. - P. 153 - 62. 2. Dallas P. Silver polymeric nanocomposites as advanced antimicrobial agents: classification, synthetic paths, applications, and perspectives / P. Dallas, V. Sharma, R. Zboril // Adv Colloid Interface Sci. - 2011. - Vol.166. - P.I 19 -35. 3. Носач Л.В., Савченко Д.С., Власенко О.М. «Одержання і характеризація кластерів срібла на поверхні нанодисперсного кремнезему». Український науковий-медичний молодіжний ж-л: Київ, 2011. - №4. - С 178. 4. Савченко Д.С. «Розробка матриці-носія для наночастинок срібла». Український науковиймедичний молодіжний ж-л: К., 2011. - №2. - С. 289-290. 5. Antimicrobial properties of a novel silver-silica nanocomposite material / S. Egger, R.P. Lehmann, M.J. Height et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2009. -75, №9. -P. 2973 -2976. 6. Antimicrobial products - test for antimicrobial activity and efficacy. (JIS Ζ 2801:2000): JIS Ζ 2801:2000. - [Чинний від 2000-12-20]. Tokyo: Japanese Standards Association, Japan, 2000. (Japanese Industrial Standard) 7. Украинская коллекция микроорганизмов. Каталог культур / Под ред. B.C. Подгорского, О.И. Коцофляк, Е.А. Киприановой, О.Р. Гвоздяк. - К.: Наукова думка, 2007. - 270 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб оцінки ефективності застосування нанокомпозиту високодисперсного кремнезему та кластерів срібла, що включає проведення мікробіологічних досліджень протимікробних властивостей, який відрізняється тим, що оцінюють ефективність композиту по мінімальній інгібуючій концентрації та мінімальній бактерицидній концентрації по відношенню до Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027), отримані результати порівнюють з активністю срібла нітратом і при нормалізації показників оцінюють ефективність препарату. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4