Спосіб визначення алелю короткостебловості rht-ble в генотипах м’якої пшениці

Реферат: UA 69103 U UA 69103 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ДНК-технології і може бути використана для детекції алелю короткостебловості Rht-Ble у генотипах м'якої пшениці. Спосіб базується на аналізі родоводів батьківських форм, використанні молекулярних маркерів до генів Rht-Bl і Rht-Dl та тесту на чутливість до гіберелової кислоти (ГК3). Різні алелі генів короткостебловості мають не однаковий вплив на агрономічно важливі ознаки [1-6]. Множина сучасних сортів озимої м'якої пшениці в Україні у складі генотипів мають різні комплекси генів короткостебловості. Селекціонери продовжують створення короткостеблових сортів, проте контроль переносу визначених алелів генів короткостебловості ускладнюється тим, що за морфологічними ознаками неможливо однозначно визначити який саме алель або комплекс алелів переноситься. За думкою селекціонерів [2, 7, 8] алель Rht-Ble не сприяє урожайності та якості зерна м'якої пшениці. Альтернативний метод, який використовується в селекційно-генетичних дослідженнях для вивчення передачі генів від батьків до нащадків, є гібридологічний аналіз - дуже трудомісткий та тривалий за часом. За даними літератури для визначення алелів генів короткостебловості Rht8c, Rht-Bla/b, Rht-Dla/b запропоновано використання молекулярних маркерів [9, 10], але до алелю Rht-Ble молекулярні маркери на сьогодні не розроблені та не опубліковано даних про послідовність нуклеотидів цього алелю, тому спосіб детекції Rht-Ble алелю в селекційному матеріалі на цей час не запропонований. Гібридологічний аналіз вибрано як прототип. Для його проведення необхідно: підібрати гомозиготний за геном Rht-Ble рослинний матеріал (сорти тестери), отримати гібриди першого покоління (F1) та популяцію F2, що розщеплюється, провести вимірювання висоти кожної рослини з популяції F2 та виконати розрахунки гібридологічного аналізу згідно з Лобашовим (1967). До недоліків прототипу належать: необхідність схрещування аналізованих форм з Одеською напівкарликовою (ми рекомендуємо саме цей генотип - носій гену Rht-Ble, тому що оригінальний генотип Краснодарський карлик 1, який містив алель Rht-Ble, за нашими дослідженнями втрачено); також до недоліків можливо віднести тривалість за часом, наявність алелю можливо виявити лише через два роки після початку експерименту; можливість визначення алелю Rht-Ble у невеликої кількості зразків за один експеримент, обмежується кількістю популяцій F2, які експериментатор має можливість виростити в полі протягом двох років та на яких здійснити гібридологічний аналіз; фенотипові різниці в популяції, що розщеплюється між класами рослин, що мають різні алелі генів короткостебловості та, відповідно, різну висоту в поколінні F2, можуть бути масковані впливом умов оточуючого середовища, що може вносити додаткові помилки в дослідження. Пропонується спосіб ідентифікації алелю Rht-Ble в генотипах м'якої пшениці, що базується на: 1) аналізі родоводів та відборі сортів, в родоводі яких були присутні сорти Краснодарський карлик 1 або Одеська напівкарликова, відомі носії алелю Rht-Ble (Rhl Краснодарський карлик 1) заданими [6]; 2) використанні алель-специфічних маркерів до генів Rht-Bl (4В) та Rhl Dl (4D), які розроблені Ellis et al. [10], якщо рослини мають в родоводі один з вищезазначених сортів; 3) тесті на чутливість рослин до дії гіберелової кислоти (ГК 3), який проводять у випадку, коли аналіз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) показав відсутність алелів короткостебловості Rht-Blb та Rht Dlb. Відмінними від прототипу ознаками у корисної моделі, що з'являється, є: - сам спосіб ідентифікації алелю Rht-Ble; - спосіб підготовки зразків до аналізу; - показник, за яким ідентифікують алель Rht-Ble в генотипі; - короткі строки проведення аналізу. Спосіб забезпечує високу ефективність встановлення алелю Rht-Ble в генотипах м'якої пшениці, в яких не визначено присутності Rht-Blb та Rht-Dlb алелів, проте спостерігається нечутливість до ГК3. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Виділення ДНК з фрагментів листя проводять згідно з методикою [11]: сегмент рослинної тканини розміром 2 см заливають лізуючим буфером: 1,4 М NaCl, 20 mM Na3EDTA, 100 mМ трис-НСl рН 8,0 при 25 °C, 2 % СТАВ та розтирають в мікропробірці. Лізат інкубують 60 хв при 60 °C. Після інкубації лізат обробляють рівним об'ємом суміші хлороформ: ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішують на вортексі до утворення білої емульсії. Отриману суміш протягом 5 хв центрифугують при 14000 об./хв на Centrifuge 5415 Eppendorf (Німеччина), потім верхню (водну) фазу переносять в чисті мікропробірки. До водної фази додають 500 мкл ізопропілового спирту, ретельно перемішують на вортексі. Нуклеїнові кислоти, 1 UA 69103 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які сформували осад, центрифугують при 14000 об./хв протягом 5 хв на Centrifuge 5415 Eppendorf (Німеччина). Осад тричі промивають 70 % етанолом, потім підсушують при кімнатній температурі і розчиняють у 400 мкл ТЕ (10 мМ трис-НСl рН 7,4 при 25 °C, 1 мМ EDTA). Розчин ДНК використовують для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). 2. Флюорометричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначають на флюорометрі "ТКО100 Dedicated mini Fluorometer" ("Höefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (10 mM трис-НСl, рН 7,4 при 25 °C, 0,2 М NaCl, 1 mM EDTA) у присутності флюоресцентного барвника Höechst 33258. 3. Проведення ПЛР. Реакційна суміш для проведення ПЛР-аналізу об'ємом 20 мкл містить: 2 мкл 10 х ПЛР-буферу (50 мМ КСl, 20 mM трис-НСl рН 8,4 (25 °C), 0,01 % Tween 20), 0,4 нмоль dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl2, 250 нМ лівого та правого праймеру (для детекції алелю Rht-Blb використовують пару праймерів MR1CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTA; BF-GGTAGGGAGGCGAGAGGCGAG; для детекції Rht-Bla алелю - WR1-CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTG та той самий лівий праймер BF, що вказаний вище. Для алелю Rht-Dlb - праймери MR2-CCCCATGGCCATCTCGAGCTGCTA та DFCGCGCAATTATTGGCCAGAGATAG; та для детекції алелю Rht-Dla пару праймерів - WR2GGCCATCTCGAGCTGCAC і DF2-GGCAAGCAAAAGCTTCGCG), що розроблені Ellis et al. [10], 100 нг ДНК і 1 одиниця активності Hot start Taq-полімерази. У пробірки поверх реакційної суміші додають 20 мкл мінеральної олії [11]. Умови проведення ампліфікації з праймерами MR1 та BF, WR1 та BF для локусу Rht-В1, MR2 та DF для локусу Rht-Dl: початкова денатурація - 96 °C - 15 хв; режим ампліфікації з пониженням температури відпалювання праймерів на 1 °C у кожному наступному циклі: 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 65 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 64 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 63 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 62 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 61 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 60 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 1 цикл: 95 °C - 45 сек., 59 °C - 45 сек., 72 °C - 2 хв; 35 циклів: 95 °C - 45 сек., 58 °C 45 сек., 72 °C - 2 хв; заключна елонгація - 72 °C-10 хв [згідно з 10]. Умови проведення ампліфікації з праймерами WR2 та DF2 для локусу Rht-Dl: початкова денатурація - 96 °C - 15 хв; наступні 35 циклів: денатурація - 95 °C - 30 сек., відпалювання праймерів - 58 °C - 1 хв, елонгація - 72 °C - 2 хв; заключна елонгація - 72 °C - 10 хв [згідно 10]. 4. Електрофорез продуктів ампліфікації в поліакриламідному гелі. Продукти, отримані під час реакції ампліфікації ДНК, фракціонують методом вертикального електрофорезу в 7 % неденатуруючому поліакриламідному гелі розмірами 175 × 160 × 1 мм. Для виготовлення гелю об'ємом 25 мл використовують: 1,85 г акриламиду, 0,064 г бісакриламиду, 2,75 мл 1 х ТВЕ (50 тМ трис-Н3ВО3, 2 mM EDTA рН 8,0), 18,6 мл бідистильованої Н2О, 350 мкл 10 % персульфату амонію та 35 мкл 99 % TEMED. Електрофорез проводять протягом 1 год. при напрузі 600 V в 1хТВЕ буфері. Перед нанесенням на електрофорез 10-15 мкл реакційної суміші змішують з 3 мкл буфера для нанесення (98 % формамід, 10 мМ EDTA рН 8,0, 0,2 % (w/v) бромфеноловий синій, 0,2 % (w/v) ксиленціанол) та наносять у лунки гелю. 5. Візуалізація продуктів ампліфікації в поліакриламідному гелі за допомогою фарбування AgNO3. Поліакриламідні гелі фарбують сріблом, згідно Silver sequence TM DNA Sequencing System Technical Manual (Promega) [12]. Гель протягом 5 хв обробляють 10 % етанолом. Потім етанол зливають. Гель обробляють протягом 3 хв 1 % HNO3. Кислоту зливають, гель промивають 2-3 рази дистильованою водою. Гель занурюють в 0,012 М AgNO3. Експозицію в азотнокислому сріблі проводять протягом 20 хв, після чого гель промивають тричі дистильованою водою. Заливають гель свіже приготованим відновлюючим розчином (0,28 М Nа2СО3, 0,019 % формамід). Експозицію проводять до моменту повного проявлення смуг продуктів ампліфікації ДНК. Після фарбування гель промивають дистильованою водою. На заключному етапі гель обробляють 10 % льодяною оцтовою кислотою протягом 2 хв. Після "закріплення" промивають дистильованою водою протягом 2 хв та поміщають в поліетиленову плівку. 6. Визначення довжини фрагментів ампліфікації за допомогою системи відеодокументації "Image Master VDS". Для документування результатів електрофорезу використовують систему відеодокументації "Image Master VDS Amershain Pharmacia Biotex" (Австрія) [12]. Забарвлені гелі фотографують цифровою відеокамерою. Цифрове відеозображення переносять в комп'ютер за допомогою програмного забезпечення "Liskap". Розміри ампліфікованих фрагментів обчислюють, використовуючи програму "Image Master I D Elite v 3.1.». Калібровка молекулярної маси виконується з використанням стандартів молекулярної маси pBlueScript/MspI або pUC19/MspI [13]. На гелях повинні детектуватися фрагменти ампліфікації довжиною 237 та 264 п.н. з парами праймерів WR1 та BF, WR2 та DF2, відповідно, що свідчить 2 UA 69103 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 про присутність алелів дикого типу Rht-Bla та Rht-Dla, у генотипі рослини [10]. За двома іншими парами праймерів MR1 та BF й MR2 та DF в такому випадку не повинно бути зареєстровано продуктів ампліфікації. Якщо з парами праймерів WR1 та BF, WR2 та DF2 не зареєстровано продуктів ампліфікації, а довжина фрагментів ампліфікації ДНК з праймерами MRІ та BF й MR2 та DF складає 237 та 254 п.н., то це свідчить про наявність алелів короткостебловості Rht-Blb та Rht-Dlb в генотипі досліджуваної рослини. 7. Тестування паростків на чутливість до гіберелової кислоти. У випадку, коли досліджуваний рослинний матеріал має у своєму родоводі сорти донори алелю гену короткостебловості Rht-Ble та за даними ПЛР-аналізу несе алелі генів короткостебловості RhtBla та Rht-Dla, паростки тестують на чутливість до ГК3. Для детекції чутливості/нечутливості рослин до гіберелової кислоти проводять гібереловий тест згідно з методикою [14]. Нечутливість паростків до дії гіберелової кислоти може бути обумовлена наявністю гібереліннечутливих алелів генів короткостебловості (Rht-Blb, Rht-Ble, Rht-Dlb) у генотипі рослин. Для кожного генотипу досліджують по 60 зерен, 30 з яких вирощують у присутності гіберелової кислоти (ГК3), а 30 за таких саме умов, але без ГК3 (контрольні умови). Першочергово, перед проведенням тесту на чутливість до дії ГК3, всі зерна пшениці стерилізують (30 сек.-70 % етанол, 40 хв - 100 % водний розчин гіпохлориду натрію (NaClO), 10 хв - 0,05 Н соляна кислота, тричі промивають автоклавованою дистильованою водою), розміщують на фільтровальному папері, змоченому дистильованою водою, та інкубують при 4 °C впродовж 24 год. для синхронізації пророщування. Для сортів з генетично детермінованим тривалим періодом спокою у свіже зібраному насінні такої інкубації може виявитися замало, в такому випадку необхідна додаткова обробка розчином 3 % перекису водню протягом 1-2 хв. Потім зерна пророщують при 20 °C протягом 48 год. Пророщені зерна переносять у колби на поживне середовище Мурасіге та Скуга [15], яке в дослідному варіанті вміщає 20 мг/л ГК 3, а у контрольному ГК3 відсутня. У якості контрольних зразків рослин використовують ГК3 - чутливий сорт - Кооператорка та ГК3 нечутливий - сорт Фантазія, з якими порівнюють дослідні рослини. Після 21 доби росту при штучному освітленні 2500-3000 Люкс та температурі 20 °C, коли рослини досягнуть стадії трьох листів, проводять диференціацію паростків на чутливі та нечутливі за різницею за довжиною між основою стебла та верхньою частиною пазухи другого листа [14]. Довжину паростка кожної рослини вимірюють лінійкою в мм. Для рослин кожного сорту, що виросли як у присутності ГК3, так і без неї, знаходять середнє арифметичне за довжиною паростків. Коефіцієнт чутливості рослин до ГК3 визначають як відношення середнього арифметичного довжини рослин, які вирощувалися у присутності ГК 3, до середнього арифметичного (за довжиною паростків), які вирощувалися без ГК 3. При коефіцієнті чутливості до ГК3 більше одиниці та достовірних за t-критерієм Ст'юдента відмінностях між рослинами одного сорту на дослідному (з ГК3) та контрольному (без ГК3) середовищах вважають досліджуваний генотип чутливим до ГК3. 8. Опрацювання результатів. Якщо при ПЛР-детекції алелів Rht-Bla та Rht-Dla генів, після фракціонування продуктів ПЛР за допомогою електрофорезу на доріжках гелю помітно по одній смузі, фрагмент ампліфікації розміром 237 та 264 п.н., відповідно, що свідчить про присутність алелю дикого типу Rht-Bla та Rht-Dla, у генотипі рослини [10], і якщо за двома іншими парами праймерів MR1 та BF й MR2 та DF не зареєстровано продуктів ампліфікації, тобто не виявлено Rht-Blb та Rht-Dlb алелів, в цьому випадку, проводять подальші дослідження з визначення чутливості відповідного рослинного зразка до ГК3. Якщо зразок виявився чутливим до гіберелової кислоти, то в ньому відсутній алель Rht-Ble. Дані, отримані за допомогою ПЛР-аналізу (див. п. 3, 4, 5, 6) та тестування паростків на чутливість до ГК3 (див. п. 7), узагальнюють та додають дані щодо наявності в родоводі селекційного матеріалу носіїв алелю Rht-Ble, наприклад, Краснодарський карлик 1 (Карлик 1) або Одеська напівкарликова. У разі, коли рослини досліджуваних зразків нечутливі до ГК3, та аналіз родоводів показав присутність серед батьківських форм носіїв мутантного алелю Rht-Ble (Краснодарського карлика 1), і за даними ПЛР-аналізу виявлено, що алелі короткостебловості Rht-Blb та Rht-Dlb відсутні, а присутній Rhl-Bla алель, робимо висновок про наявність Rht-Ble алелю. Прикладом встановлення алелю Rht-Ble можуть слугувати дані, представлені в роботі Чеботар та ін. [16]. Як показано в цій роботі, алель Rht-Ble встановлено у лінії Кооператорка К-70. Джерела інформації:: 1. Абакуменко А.В. Коррелятивные связи элементов структуры урожая у низкорослых озимых пшениц // Научно-техн. бюл. ВСГИ.-1987. - Вып. 1 (63). - С. 6-9. 2. Лыфенко С.Ф. Полукарликовые сорта озимой пшеницы - К.: Урожай, 1987.-191 с. 3 UA 69103 U 5 10 15 20 25 30 35 3. Flintham J.E., Borner A., Worland A.J., Gale M.D. Optimizing wheat grain yield: effects of Rht (gibberellin-insensitive) dwarfing genes // J. Agric. Sci Camb.-1997. - Vol. 128. - P. 11-25. 4. Rebetzke G.J… Richards R.A. Gibberellic acid-sensitive dwarfing genes reduce plant height to increase kernel number and grain yield of wheat // Australian journal of agricultural research.-2000. Vol. 51, № 2. - P. 235-245. 5. Tang N. et al. The effects of dwarfing genes (Rht-Blb, Rht-Dlb, and Rhl-8) with different sensitivity to GA3 on the coleoptile length and plant height of wheat // Agricultural Sciences in China.2009. - Vol. 8, Is. 9. - P. 1028-1038. 6. Чеботар Г.О., Моцний I.I., Чеботар С.В., Сиволап Ю.М. Вплив алелів генів короткостебловості та гена Ppd-D1 на агрономічні ознаки м'якої пшениці // Збірник СГІ-НЦНС2010. - Вип. 16 (56). - С. 148-160. 7. Абакуменко А.В. Результаты использования конвергентных скрещиваний в селекции озимой пшеницы // Научн.-техн. бюл. СГИ (Одесса).-1992. - № 1 (81). - С. 4-10. 8. Нефедов А.В. Прогресс селекции озимой пшеницы на Юге Украины // Научн.-техн. бюл. СГИ (Одесса).-1991. -№ 1 (78). - С. 13-15. 9. Korzun V., Röder M. S., Ganal M.W. et al. Genetic analysis of the dwarfing gene (Rht8) in wheat. Part I. Molecular mapping of Rht8 an the short arm of chromosome 2D of bread wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet.-1998. - Vol. 96. - P. 1104-1109. 10. Ellis M.H., Spielmeyer W., Gale K.R. et al. "Perfect" markers for the Rht-Blb and Rht-Dlb dwarfing genes in wheat // Theor. Appl. Genet.-2002. - Vol. 105. - P. 1038-1042. 11. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях / под ред. Ю.М. Сиволапа // Киев: Аграрна наука, 1998. - С. 8-33. 12. Promega Technical Manual. Gene Print. STR Systems. Printed in USA. Revised. - Vol. 7.1999.-52 p. 13. Ідентифікація і реєстрація генотипів м'якої пшениці (Triticum aestivum L.), ячменю (Hordeum vulgare L), кукурудзи (Zea mays L.), соняшника (Helianthus annuus L.) за допомогою аналізу мікросателітних локусів. Метод. рек-ції, Південний біотехнологічний центр у рослинництві // Одеса, 2004.-14 с. 14. Börner A., Lehmann C.O., Mettin D. Preliminary results of screening for GA3 response in wheats of the Gatersleben gene bank // Kulturpflanze.-1987. -Vol. 35. - P. 179-186. 15. Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant.-1962. - Vol. 15. - P. 473-497. 16. Чеботарь Г.А., Чеботарь С.В., Моцный И.И. и др. Молекулярно-генетический анализ линий-аналогов мягкой пшеницы, различающихся по высоте растений // Вісник ОНУ.-2009. - Т. 14, Вып. 8. - С. 61-71. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб визначення алелю короткостебловості Rht-Ble в генотипах м'якої пшениці, що включає аналіз стану Rht-Bl гену в рослинах пшениці, який відрізняється тим, що використовують комплексну систему: молекулярні маркери алелів Rht-Bl a/b і Rht-Dl a/b, біохімічний тест на чутливість до гіберелової кислоти (ГК3) та проводять аналіз родоводів батьківських форм. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4