Спосіб отримання сесквітерпенових лактонів із листків saussurea discolor (willd.) dc

Реферат: Спосіб отримання сесквітерпенових лактонів із листків Saussurea discolor (Willd.) DC включає екстракцію суми сесквілактонів (смолки), очищення її за допомогою адсорбційної хроматографії на колонці та препаративну тонкошарову хроматографію. Екстрагування суми лактонів із листків S. discolor здійснюють хлороформом. Елювіюють сесквілактони при адсорбційній хроматографії на колонці сумішшю петролейний ефіретилацетат. Препаративну хроматографію проводять висхідним способом у системі розчинників петролейний ефіретилацетат. Як проявник використовують ванілін, а вилучення індивідуальних компонентів із носія здійснюють бензолом. UA 69107 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ СЕСКВІТЕРПЕНОВИХ ЛАКТОНІВ ІЗ ЛИСТКІВ SAUSSUREA DISCOLOR (WILLD.) DC UA 69107 U UA 69107 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана для отримання очищеної суми та індивідуальних компонентів сесквітерпенових лактонів - перспективних фармакологічних сполук, що мають виражену антимікробну, протизапальну та протипухлинну дію. Відомий спосіб отримання сесквітерпенових лактонів із листків рослин, що ґрунтується на їх поступовій екстракції водою та хлороформом з подальшим очищенням отриманої смолки (суми сесквілактонів) за допомогою адсорбційної хроматографії на колонці (Рыбалко К. С. Природные сесквитерпеновые лактоны. - М.: Медицина, 1978. - 320 с). Однак недоліком даного способу є обробка рослинної сировини органічними розчинниками при високій температурі, що призводить до значної втрати сесквілактонів за рахунок летючості їх сполук. Найбільш близьким є спосіб отримання алантолактону із коренів і кореневищ оману високого (Беляков К. В., Попов Д. М. Получение алантолактона стандартного образца // Фармация. - 2004. - № 1. - С. 37-39), відповідно до якого виділення суми сесквілактонів проводили на колонці і елювіювали сумішшю петролейний ефіретилацетат (91), виділення компонентів сесквілактонів проводили методом препаративної тонкошарової хроматографії (ТШХ) на силуфолових пластинках в системі розчинників бензол-етилацетат-метанол (9430,5), індивідуальні компоненти детектували при нагріванні 20 % H2SO4, a екстракцію отриманих фракцій проводили сумішшю петролейний ефіретилацетат (91). Недоліком даного способу є використання як розчинників високотоксичних сполук та значне пошкодження хроматографічних пластинок при проявлянні їх сірчаною кислотою. Технічний результат полягає в підвищенні виходу суми сесквітерпенових лактонів, очищенні її від супутніх речовин та розробці ефективної методики отримання індивідуальних компонентів. Суть корисної моделі полягає в тому, що спосіб отримання сесквітерпенових лактонів виду S. discolor включає екстракцію суми сесквілактонів (смолки), очищення її за допомогою адсорбційної хроматографії на колонці та препаративну ТШХ, екстрагування суми лактонів із листків S. discolor здійснювали хлороформом при кімнатній температурі 21±1 °С протягом 5-ти діб, очищення смолки проводили за допомогою адсорбційної хроматографії на колонці, де як елювіат використовували суміш петролейний ефіретилацетат (91), препаративну хроматографію проводили висхідним способом у системі розчинників петролейний ефіретилацетат (91), проявляння хроматограм проводили 1 % ваніліном у 20 % H2SO4 при нагріванні до 120±5 °С, а вилучення індивідуальних компонентів із носія проводили бензолом. Від типу розчинника, що застосовується для екстракції, залежить не тільки повнота вилучення досліджуваних сполук, але і їх якісний склад. Сесквітерпенові лактони належать до сполук, здатних змінювати структуру у процесі нагрівання, що проявляється у їх хімічних перетвореннях та руйнуванні лактонного кільця. Тому нами розроблені умови екстракції сесквілактонів листків S. discolor, що включали тривалу (близько 5 діб) хлороформну екстракцію при температурі 21±1 °С. Застосування системи розчинників петролейний ефіретилацетат у співвідношенні 91 дозволяє вичерпно вимивати сесквітерпенові лактони із носія при адсорбційній хроматографії. Використання як проявника 1 % ваніліну у 20 % H2SO4 при нагріванні до 120±5 °С дозволяє якісно детектувати сесквітерпенові лактони на хроматограмах та зберегти цілість носія хроматографічних пластинок. Як екстрагент при вилученні індивідуальних компонентів із носія доцільно використовувати бензол, що дозволяє провести вичерпну екстракцію індивідуальних сесквітерпенових лактонів. Спосіб дозволяє підвищити вихід суми сесквілактонів (смолки) та провести якісний розподіл їх індивідуальних компонентів. На фіг. 1 приведено ТШХ листків дикорослих рослин S. discolor за умов воднохлороформної екстракції. На фіг. 2 приведено ТШХ листків дикорослих рослин S. discolor за умов хлороформної екстракції. Спосіб здійснюють наступним чином. Аналітичну пробу надземної вегетативної частини рослинної сировини (листків) подрібнюють до розмірів частинок, що проходять через сито з діаметром отворів 0,5 мм. Наважку сухої подрібненої речовини переносять в колбу з притертим корком, заливають хлороформом у співвідношенні 110 і настоюють протягом 5 днів. Отриманий екстракт фільтрують і випарюють досуха у випарювальній чашці. Осад повторно розчиняють, додаючи 0,5-1 мл хлороформу. Отримують в'язкий темно-зелений осад - смолку, яка є сумішшю екстрагованих хлороформом сесквітерпенових лактонів. Для очищення отриманих смолок залучають адсорбційну хроматографію на колонці. Як сорбент використовують силікагель. Колонка для адсорбційної хроматографії являє собою скляну трубку з відтягнутим нижнім кінцем або бюретку, завдовжки 15 см та діаметром 8-12 мм. Колонка 1 UA 69107 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заповнюється дрібним сухим порошком адсорбенту або його суспензією в тому розчиннику, який буде використаний для хроматографії. Після заповнення колонки розчинником на нерухому фазу наноситься невеликий об’єм зразка з таким розрахунком, щоб він пройшов у верхній шар (завантаження колонки). Рухомою фазою виступає суміш петролейний ефіретилацетат (91). Елювіат з колонки збирають порціями по 5 мл. Присутність у фракціях сесквітерпенових лактонів перевіряють на СФ при 214 нм. Порції, у яких присутні сесквілактони, об'єднують, залишки розчинника відганяють під вакуумом. Отримані концентровані витяжки аналізують методом хроматографії в тонкому шарі сорбенту (ТШХ) на пластинках "Silufol - UV254" (Чехія) в системі розчинників висхідним способом. Як розчинник використовують суміш петролейний ефіретилацетат (91). Стінки хроматографічної камери вистилають фільтрувальним папером та насичують камеру рухомою фазою протягом 1 год. при температурі 20-25 °C. Хроматографічні пластинки попередньо активують у термостаті протягом 1 год. при температурі 105 °С. Об'єм розчину досліджуваної витяжки наносять невеликими порціями, одержуючи суцільні смуги. Після випаровування розчинників з нанесеної проби пластинку поміщають у насичену розчинниками хроматографічну камеру, якомога більш вертикально, стежачи за тим, щоб лінія старту знаходилась вище поверхні рухомої фази. Камеру закривають, залишають її при температурі від 20 до 25 °С у захищеному від прямих сонячних променів місці. Після того, як рухома фаза пройде відстань у 10-15 см, пластинку виймають, відмічають положення фронту розчинника, сушать. Надалі від хроматографічної пластинки відрізають смужку шириною 0,5 см вздовж напряму проходження розчинника, обприскують 1 % ваніліном у 20 % H2SO4 та проводять візуалізацію. Забарвлену смужку прикладають до хроматографічної пластинки і відмічають місцезнаходження проявлених речовин. Зони, що відповідають індивідуальним сполукам, зішкрібають із носія та екстрагують бензолом. Сесквітерпенові лактони - кисневмісні похідні сесквітерпеноїдів, різноманітність у межах одного типу яких залежить від ступеня насиченості кілець, розташування подвійних зв'язків і наявності різних функціональних груп. Така різноякісність значно ускладнює процес виділення та ідентифікації сесквілактонів і вимагає індивідуального підбору методів та умов виділення досліджуваних сполук. У зв'язку з цим, нами були апробовані різні шляхи екстракції, що відрізнялися як за екстрагуючою речовиною, так і за температурним режимом. При апробації двох схем екстракції нами встановлені відмінності у частці виходу смолок. Так, за воднохлороформної екстракції рослинної сировини вихід смолки сесквілактонів становив 1,33±0,13 % (при відстоюванні збільшувався до 3,32±0,33 %), тоді як за умов тривалої хлороформної екстракції (близько 5 діб) - 7,89±0,43 %. Отримані після екстракції смолки (сума сесквілактонів) надалі очищували на колонці, заповненій силікагелем з використанням системи розчинників, за основу приготування яких взятий петролейний ефір. Були апробовані системи розчинників на основі петролейного ефіру та етилацетату у співвідношеннях 9,5:0,5, 9:1, 8,5:1,5, 8:2 і так далі. Проби аналізували на предмет наявності поглинання, характерного для сесквітерпенових лактонів, при довжині хвилі 214 нм. Було з'ясовано, що вже при використанні першої системи розчинників 9:1 із носія вимиваються майже всі сполуки лактонної природи. На основі спектрального аналізу елювіатів встановлено, що їх вилучення відбувається у два етапи. При використанні наступної системи розчинників із носія вимивається решта компонентів, що становить незначну частку досліджуваного зразка. Слід зауважити, що спектральна активність цих елювіатів була значно нижчою, у порівнянні із такими ж у попередніх фракціях. При використанні як рухомої фази системи розчинників у співвідношенні 8:2 та всіх інших наступних розведень сполуки, що мають спектральну активність при 214 нм, з колонки не вимивалися. Після об'єднання, концентрування всіх елювіатів, що мали спектральну активність, зразки аналізували за допомогою ТШХ. Як рухому фазу при ТШХ використовували суміш петролейний ефіретилацетат (91) та бензолетилацетатметанол (9430,5) (найближчий аналог). Нами була визначена суміш петролейного ефіруетилацетату як оптимальний розчинник для смолок S. discolor. В результаті тонкошарової хроматографії смолки експлантатів S. discolor, отриманої шляхом водної екстракції при 70 °С і з наступною обробкою хлороформом, було ідентифіковано чотири компоненти, що за специфічним забарвленням можна віднести до сполук лактонної природи (фіг. 1). При застосуванні такої схеми екстракції не враховується втрата лактонів за рахунок летючості їхніх сполук та руйнування лактонного кільця під час нагрівання. Тому паралельно проводили екстракцію із залученням методу, що виключає використання підвищеної температури. Співвідношення рослинної сировини та екстрагенту змінювали від 15 до 110 у зв'язку із сильною опушеністю рослинного матеріалу, що перешкоджало його якісному змочуванню екстрагуючою речовиною. 2 UA 69107 U 5 10 Як показали отримані результати, у випадку уникнення при екстракції сесквілактонів етапу обробки при підвищених температурах спектр речовин, що виявляються на хроматограмах, є набагато різноманітнішим (фіг. 2). Відомо, що сесквітерпенові лактони мають здатність набувати фіолетового та рожевофіолетового забарвлення, за дії специфічних речовин (20 % H2SO4 (найближчий аналог), концентрована H2SO4, 1 % розчин ваніліну у концентрованій H2SO4, a також KМnО4, який має здатність взаємодіяти ще й з кумаринами). В зв'язку з цим, нами були апробовані всі схеми, в основі яких лежить використання H2SO4. Нами також був застосований 20 % розчин H2SO4, що містив 1 % ванілін. Як виявилось, саме при використанні останнього на хроматографах проявлялася максимальна кількість смуг з відповідним забарвленням, а також зберігалась цілісність носія хроматографічних пластинок. Отже, на основі проведених досліджень було підібрано умови для проведення хроматографічного розподілу сесквітерпенових лактонів для листків S. discolor (табл. 1). Таблиця 1 Схема отримання сесквітерпенових лактонів S. discolor Етап Екстракція ТШХ Ідентифікація Реагент Хлороформ Петролейний ефіретилацетат, 91 1 % ванілін у 20 % H2SO4 Умови обробки П'ять днів при температурі 21±2 °С 21±2 °С Витримування при 120 °С, 5 хв. 15 Розроблена схема надалі була використана для аналізу суми лактонів різних зразків S. discolor. Так, у природному зразку (листки) S. discolor виявили 9 сполук (табл. 2), що відрізнялися за коефіцієнтом рухливості та характеризувалися відмінною інтенсивністю забарвлення. 20 Таблиця 2 Коефіцієнти рухливості компонентів сесквітерпенових лактонів листків S. discolor Матеріал 2 Дикорослі рослини 25 1 0,14 3 0,26 0,36 Коефіцієнт рухливості 4 5 6 0,43 0,53 0,65 7 8 0,75 0,90 9 0,95 Кількість сесквілактонів в сумарному препараті з листків S. discolor складає 4,57 мг/г сухої сировини. Максимальним забарвленням на хроматограмах характеризуються компоненти з коефіцієнтом рухливості 0,36 та 0,95. Для них встановлено найвищий вміст речовини у фракціях - 1,17±0,032 та 0,98±0,017 відповідно. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб отримання сесквітерпенових лактонів із листків Saussurea discolor (Willd.) DC, що включає екстракцію суми сесквілактонів (смолки), очищення її за допомогою адсорбційної хроматографії на колонці та препаративну тонкошарову хроматографію (ТШХ), який відрізняється тим, що екстрагування суми лактонів із листків S. discolor здійснюють хлороформом при кімнатній температурі 21±1 °С протягом 5-ти діб, елювіюють сесквілактони при адсорбційній хроматографії на колонці сумішшю петролейний ефір етилацетат (91), препаративну хроматографію проводять висхідним способом у системі розчинників петролейний ефіретилацетат (91), як проявник використовують 1 % ванілін у 20 % H2SO4 при нагріванні до 120±5 °С, а вилучення індивідуальних компонентів із носія здійснюють бензолом. 3 UA 69107 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4