Спосіб одержання моделі хронічного тонзиліту

Реферат: Спосіб одержання моделі хронічного тонзиліту включає ін'єкційне інфікування парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів лабораторних тварин штамом Staphylococcus aureus та подальше спостереження за тваринами впродовж визначеного строку. Лабораторним тваринам попередньо, одноразово підшкірно вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад нагріванням до температури 80 °С впродовж 1 години, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р). Наступне інфікування здійснюють стандартизованою зависсю живих добових клітин вищевказаного референс-штаму двічі: перший раз дозою 1 одиниця щільності за шкалою McFarland і другий раз через 10 діб дозою 3 одиниці щільності за шкалою McFarland, при цьому строк спостереження визначають 28-30 діб. UA 70957 U (12) UA 70957 U UA 70957 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до експериментальної оториноларингології, і може бути використана для дослідження закономірностей формування хронічного тонзиліту та оцінки потенційної ефективності способів корекції цих порушень. Хронічним тонзилітам (XT) належить одне з провідних місць в структурі загальної ЛОРзахворюваності. В Україні на XT хворіє від 2 до 15 % населення. За даними статистики впродовж останніх 8-10 років кількість таких хворих збільшилась майже удвічі. Приблизно 75 % дітей, що хворіли на XT, у дорослому віці продовжують хворіти на це захворювання. Ускладнення, що виникають з боку різних органів і систем в умовах зростаючої захворюваності, небезпека ранньої інвалідизації працездатного населення зумовлюють велику актуальність і соціальну значущість тонзилярної проблеми, що привертає увагу не тільки оториноларингологів, а й інфекціоністів, педіатрів, терапевтів, імунологів і ревматологів [1]. Труднощі в лікуванні XT зумовлені різноманіттям етіопатогенетичних механізмів їх розвитку, тому одним з актуальних питань оториноларингології є тестування різноманітних способів та засобів лікування XT в експериментальних умовах, що потребує адекватної та відтворюваної моделі даної патології. Відомий спосіб отримання моделі XT у лабораторних тварин, що включає попереднє зниження місцевого і системного імунітету шляхом гіперімунізації тварин антигеном, виготовленим з тканин мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт з наступним внутрішньотонзилярним зараженням тварин гіповірулентними штамами гноєрідних коків [2]. Відтворення хронічного тонзиліту здійснювали на кролях та собаках шляхом попереднього багаторазового підшкірного введення антигену з тканин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт у визначених дозах з інтервалом 5-7 днів до появи в сироватці крові специфічних антитіл, після чого вводили гіповірулентний варіант штаму стрептококу Даше чи стафілококу № 209 в дозі 10-20 мільйонів мікробних тіл. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі модель XT створюють шляхом попереднього зниження місцевого та системного імунітету з наступним внутрішньотонзилярним інфікуванням тварин гіповірулентним штамом гноєрідних коків і подальшим спостереженням за тваринами до підтвердження відповідності модельованого запального процесу хронічному тонзиліту. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є складність одержання відтворюваних моделей, яка зумовлена складністю відтворення при повторенні антигену для зниження імунітету і використання нестандартних збудників інфекції (якими є стрептокок Даше чи стафілокок № 209), параметри яких можуть коливатися. Відомий спосіб отримання моделі XT, який ґрунтується на внесенні збудника інфекції в тканини мигдаликів лабораторних тварин зі зниженою імунореактивністю [3]. У відомому способі кролям ін'єкційно вводили суміш аденовірусів (1,3 типів у розведенні 1:100 при титрі вірусів log -5 10 ) та мікоплазм (М. рnеumоnіа штам Th). За тиждень відмічали розвиток місцевих процесів у тканинах мигдаликів - гіперемія, набряк, нальоти і іноді ділянки некрозу, а також появу у крові тварин специфічних антитіл до вказаних інфекцій. Як і в запропонованій корисній моделі, у вищевказаному способі модель XT у тварин створюють шляхом попереднього зниження імунітету, ін'єкційного введення збудника інфекції в тканини мигдаликів та подальшого спостереження за тваринами до підтвердження відповідності модельованого запального процесу XT. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є складність відтворення вірусно-бактеріальної моделі XT. Прототипом вибраний спосіб отримання моделі XT [4], шляхом введення у парамигдаликову клітковину та область верхнього полюсу піднебінних мигдаликів кролів штаму Staphylococcus aureus у дозі 3 мільйонів мікробних клітин. Інфікування тварин провадили одноразово під прикриттям антибіотику біцилін-3 упродовж тижня. Спостереження за тваринами експериментальної та основної груп здійснювали 21 добу, після чого тварин забивали та провадили гістологічні дослідження піднебінних мигдаликів та регіональних лімфатичних вузлів з метою виявлення патологічних змін, характерних для XT. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі модель XT створюють шляхом ін'єкційного інфікування парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів лабораторних тварин штамом Staphylococcus aureus і подальшого спостереження за тваринами впродовж визначеного строку. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є відсутність сенсибілізації організму лабораторних тварин до інфекційного агенту, що в сукупності з використанням нестандартного збудника інфекції (яким є Staphylococcus aureus) створює умови для невизначеного (неконтрольованого) впливу на організм лабораторних тварин і таким чином 1 UA 70957 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перешкоджає створенню відтворюваної і адекватної моделі XT. Крім того, строк у 21 добу є недостатнім для виявлення у лабораторних тварин характерних для XT клінічних, патоморфологічних та мікробіологічних ознак. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу отримання моделі XT. Технічний результат, який може бути отриманий при використанні запропонованої корисної моделі, полягає у збільшенні стабільності параметрів, що впливають на розвиток XT, що розширює можливості для створення стандартної відтворюваної моделі XT з характерними клінічними, патоморфологічними та мікробіологічними ознаками XT, придатної для оцінки способів лікування XT. Поставлена задача вирішується тим, що попередньо одноразово підшкірно вводять лабораторним тваринам стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад, нагріванням до температури 80 °C впродовж 1 години, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), після чого виконують ін'єкційне інфікування парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів тварин зависсю живих добових клітин вищевказаного штаму двічі: перший раз дозою 1 одиниця щільності за шкалою McFarland і другий раз через 10 діб дозою 3 одиниці щільності за шкалою McFarland, при цьому строк спостереження визначають 28-30 діб. Запропонована корисна модель відрізняється від прототипу тим, що попередньо одноразово підшкірно лабораторним тваринам вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, в якості якого використовують вбиті, наприклад нагріванням до температури 80 °C впродовж 1 години, клітини стандартизованого референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), а наступне інфікування здійснюють зависсю живих добових клітин вищевказаного штаму двічі: перший раз дозою 1 одиниця щільності за шкалою McFarland і другий раз через 10 діб дозою 3 одиниці щільності за шкалою McFarland, при цьому строк спостереження визначають 28-30 діб. Між суттєвими ознаками запропонованої корисної моделі і технічним результатом, який може бути одержаний при її використанні, існує такий причинно-наслідковий зв'язок. Попереднє одноразове підшкірне введення лабораторним тваринам стандартизованої зависі вбитих клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р) та ін'єкційне інфікування парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів тварин стандартизованою зависсю живих клітин того ж штаму дозволяють виконувати сенсибілізацію тварин до інфекційного агенту та збільшують стабільність параметрів, що впливають на розвиток хвороби, а використання інфікування двічі з інтервалом в 10 діб і спостереження за тваринами впродовж 28-30 діб - достатній строк для проявлення ознак стандартної моделі XT з характерними клінічними, патоморфологічними та мікробіологічними ознаками XT, придатної для оцінки ефектів способів та засобів лікування XT. Спосіб здійснюють таким чином. Лабораторним тваринам - кролям, собакам і т. і. - одноразово підшкірно в область стегна вводять стандартизовану завись вбитих, наприклад, нагріванням, мікробних клітин референсштаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р) та після загального наркозу і наступної фіксації тварин з використанням роторозширяючого інструменту у парамигдаликову клітковину та область верхнього полюса піднебінних мигдаликів ін'єкційно шприцом вводять стандартизовану завись референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Ρ (АТСС 6538-р). Референс-штам Staphylococcus aureus № 209Ρ (АТСС 6538-р) широко використовується у різних країнах світу для моделювання гнійно-запальних процесів, зокрема ендофтальміту, остеомієліту, ендокардиту [5, 6, 7, 8], оскільки володіє сталими біологічними властивостями та є доступним для одержання з колекцій мікроорганізмів. Термін спостереження за тваринами вибрано відповідно до задачі дослідження: 28-30 діб. Доза для інфікування та кратність введення підбирались експериментальним шляхом таким чином, щоб забезпечити у кролів нульовий показник летальності та септичного стану при мінімальному відсотку тварин, у яких хронічний тонзиліт не розвивається внаслідок локалізації процесу та виникнення гострого гнійно-запального процесу у мигдаликах. Зменшення дози інфекційного агенту призводить до підвищення відсотку тварин, у яких не розвивається хронічний тонзиліт. Збільшення дози може призвести до септичного стану та летальності серед експериментальних тварин. Зміна типу лабораторних тварин потребує індивідуального добору дози, щоб забезпечити бажаний технічний результат. Приклад: Кролям породи "Шиншила" вагою 2,5-3 кг одноразово підшкірно в область стегна вводили 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 1 години при 80 °C мікробних клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р) щільністю 3 одиниці за шкалою McFarland та після 2 UA 70957 U 5 10 15 20 загального наркозу з використанням роторозшируючого та фіксуючого інструменту для лабораторних тварин інфікували за допомогою інсулінового шприца парамигдаликову клітковину і область верхнього полюсу піднебінних мигдаликів 0,1 мл завісі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р) щільністю 1 одиниця за шкалою McFarland з наступним через 10 діб повторним інфікуванням, що відповідає 3 одиницям за шкалою McFarland. Термін спостереження визначався 28 діб. В таблиці наведені результати мікробіологічних досліджень на золотистий стафілокок поверхні мигдаликів у кролів, що були рандомізовані в одну з чотирьох груп; - І група (n=10) кролів інфікованих одноразово 0,1 мл зависі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), щільністю 1 одиниця за шкалою McFarland, - II група (n=10) кролів сенсибілізованих одноразово підшкірно 0,1 мл зависі вбитих нагріванням протягом 1 години при 80 °C клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Ρ (АТСС 6538-р), щільністю 3 одиниці за шкалою McFarland, та інфікованих одноразово 0,1 мл завісі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Ρ (АТСС 6538-р), щільністю 1 одиниця за шкалою McFarland, - ІІІ група (n=10) кролів сенсибілізованих одноразово підшкірно 0,1 мл завісі вбитих нагріванням 1 годину при 80 градусах С клітин штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), щільністю 3 одиниці за шкалою McFarland та інфікованих одноразово 0,1 мл завісі живої добової культури штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), щільністю 1 одиниця за шкалою McFarland та з наступним через 10 діб повторенням інфікування, що відповідає 3 одиницям щільності за шкалою McFarland, - IV група (n=5) інтактних кролів. Таблиця Результати мікробіологічних досліджень на золотистий стафілокок поверхні мигдаликів дослідних тварин Група тварин І група (n= 10) II група (n=10) III група (n=10) IV група (n=5) 25 30 35 40 Ступінь заселення поверхні мигдаликів дослідних тварин золотистим стафілококом (lg КУО/г) у дні спостереження (М±m) 7 діб 14 діб 21 доба 28 діб 8,2±0,1 3,0±0,5 не вилучались не вилучались 6,1±0,7 5,0±0,4 3,0±0,2 не вилучались 7,4±0,3 6,0±0,8 6,1±0,5 5,0±0,3 не вилучались не вилучались не вилучались не вилучались Дослідження довели, що у III групи тварин через 28-30 діб розвивається мікробіологічна картина хронічного інфекційного процесу стафілококової етіології, що відповідає мікробіологічним критеріям хронічного тонзиліту. В той час, як у І та II груп піддослідних тварин через 7 діб після інфікування спостерігався гострий гнійно-запальний процес у мигдаликах, який до 21 доби закінчився поступовою елімінацією збудника з поверхні мигдаликів. Результати патоморфологічних досліджень через 28 діб спостереження тварин І, II, IV груп не виявили ознак пошкодження та запалення тканин мигдаликів: лімфоїдна тканина піднебінних мигдаликів займає лише невелику частину тканини у ділянці відповідної локалізації, інша тканина - пухка сполучна тканина. При цьому виявлена лише одна крипта, вкрита багатошаровим епітелієм з частковим руйнуванням поверхневого шару. Лімфоїдні фолікули піднебінних мигдаликів багатоклітинні, великі. Тимус та селезінка без патологічних змін. У кролів III групи спостерігалась проліферація лакунарного епітелію, інфільтрація його нейтрофілами, макрофагами, лімфоцитами з формуванням лакунарної пробки. Місцями у субепітеліальному просторі є інволюція лімфоїдних фолікулів та розростання сполучної тканини. У селезінці спостерігається гістологічна картина активації білої пульпи, у тимусі початкова стадія антигенної трансформації. Вищевказані ознаки мали місце у 100 % тварин, що свідчить про відтворюваність і адекватність процесу розвитку хронічного тонзиліту. Джерела інформації: 3 UA 70957 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1. Мітін Ю. В. Хронічний тонзиліт: сучасний стан проблеми та шляхи її вирішення [Електронний ресурс] / Ю. В. Мітін, Ю. В. Шевчук // Клиническая иммунология. Аллергология. Инфектология. - 2007. - №3 - Режим доступу до журн.: http://immuno.health-ua.com/article/98.html. 2. Яковенко В. Д. Новый способ моделирования хронического тонзиллита / В. Д. Яковенко, И. Л. Дикий, Е. М. Дикая, З. И. Кашеварова // Новые методы диагностики и лечения больных с заболеваниями уха, горла и носа. Сб. научных трудов Харьковского медицинского института. Харьков - ХМИ, 1987. - С. 33-36. 3. Киселев Р. И. Значение вирусно-микробной (микоплазменной) ассоциации в этиопатогенезе хронического тонзиллита. Сообщение 2: К вопросу создания модели экспериментального хронического тонзиллита / Р. И Киселев, Н. И. Гладкий, Е. Ф. ТесленкоПономаренко // Актуальные вопросы лечения, профилактики, диагностики ревматизма и гипертонической болезни. Сб. статей Украинского института усовершенствования врачей. Харьков, 1971. - С. 60-63. 4. Патент 2180973 RU, МПК G09B 23/28/ Cпocoб моделирования хронического тонзиллита. Заявитель: Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН. Авторы: Головнев А. В.; Дергачев В. С.; Головнев В. Α.; Горчаков В. Н. Патентообладатель: Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфология СО РАМН. Номер заявки: 2000118386/14. Дата подачи заявки: 10.07.2000. Дата публикации 27.03.2002. 5. Kane, A. Penetration of Ocular Tissues and Fluids by Moxalactam in Rabbits with Staphylococcal Endophthalmitis [Electronic resource] / A. Kane, M. Barza, J. Baum. // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1981. Vol. 20, №5. P. 595-599, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 181758/pdf/aacOOO 11-0039.pdf. 6. Федуненко В. В. Экспериментальное обоснование комбинированного применения биологически активного полиморфного гидрогеля и диадинамотерапии в лечении язв роговицы / В. В. Федуненко / Автореферат дис. к. мед. н. 14.00.08 - глазные болезни. - Москва, 2007. - 24 с. 7. O'Reilly Т. Rat model of bacterial osteomyelitis of the tibia [Text] / O'Reilly Т., Mader J. T. // O. Zak, M. A. Sande (ed.) Handbook of animal models of infection, experimental model in antimicrobial chemotherapy. - Academic Press.: San Diego, Calif.Academic Press; 1st edition, 1999. - P. 560-575. 8. Andes, D. R. Pharmacodynamics of fluoroquinolones in experimental models of endocarditis [Electronic resource] / D. R. Andes, W. A. Craig // Clin Infect Dis. - 1998. - Vol.27, №1. - P. 47-50. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9675448. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання моделі хронічного тонзиліту, що включає ін'єкційне інфікування парамигдаликової клітковини та області верхнього полюсу піднебінних мигдаликів лабораторних тварин штамом Staphylococcus aureus та подальше спостереження за тваринами впродовж визначеного строку, який відрізняється тим, що лабораторним тваринам попередньо, одноразово підшкірно вводять стандартизований сенсибілізуючий агент, за який використовують завись вбитих, наприклад нагріванням до температури 80 °С впродовж 1 години, клітин референс-штаму Staphylococcus aureus № 209Р (АТСС 6538-р), а наступне інфікування здійснюють стандартизованою зависсю живих добових клітин вищевказаного референс-штаму двічі: перший раз дозою 1 одиниця щільності за шкалою McFarland і другий раз через 10 діб дозою 3 одиниці щільності за шкалою McFarland, при цьому строк спостереження визначають 28-30 діб. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4