Спосіб визначення доксазозину у біологічному матеріалі

Реферат: UA 73425 U UA 73425 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до аналітичної хімії, а саме до способів визначення доксазозину у біологічному матеріалі при застосуванні екстракції ацетонітрилом, і може застосовуватися для визначення зазначеної речовини у фармацевтичному аналізі та при хіміко-токсикологічних дослідженнях. Доксазозин-1-(4-аміно-6,7-диметокси-2-хіназолініл)-4-[(1,4-бензоді-оксан-2-іл)-карбоніл] піперазину мезилат, 1-адреноблокатор, широко застосовується у медичній практиці при лікуванні артеріальної гіпертензії та гіпертрофії простати; при передозуванні вражає серцевосудинну систему, порушує функції нирок [1, 2]. При досліджуванні біологічного матеріалу на наявність доксазозину важливими є етапи ізолювання отрути та очищення одержаних витяжок. Тому для підвищення надійності та відтворюваності отриманих результатів актуальною є розробка ефективних і експресних методик виділення речовин. Найбільш широко розповсюджені методи екстракційного виділення отрут, які можна розділити на загальноприйняті методи та методи, розроблені з урахуванням індивідуальних властивостей речовин або окремих груп речовин [3-6]. Використання гідрофільних, амфіфільних та ліпофільних розчинників обумовлено фізикохімічними властивостями досліджуваних речовин, що має значення при утворенні сольватних оболонок молекул отрут та здатності розчинника до взаємодії з біологічним матеріалом на клітинному рівні. Широке розповсюдження у хіміко-токсикологічному аналізі отрут набули різні методики екстракції речовин амфіфільним розчинником ацетонітрилом. Відомий спосіб визначення етацизину при екстрагуванні ацетонітрилом. Для чого біологічний матеріал (проба 100,0 г) підкислюють 10 % розчином кислоти щавлевої до рН 2,0; екстракцію отрути проводять триразово 100,0, 80,0 та 80,0 мл при ретельному перемішуванні кожної проби протягом 2, 1 та 1 год. відповідно. Як висолювач застосовують 25 % розчин амонію сульфату; для реекстрагування етацизину хлороформом водну фазу підлуговують до рН 8,0 [7]. Спосіб визначення має певні недоліки, обумовлені використанням підкислюючого агента (10 % розчином кислоти щавлевої, недостатньо активно руйнуючої зв'язки речовини з білками), зміни у об'ємах ацетонітрилу (триразово 100,0, 80,0 та 80,0 мл, причому екстрагується значно більше біогенних домішок), використання певного висолювача (25 % розчин амонію сульфату, який гідролізується із зміною рН середовища); очищення обмежено застосуванням лише екстракційного методу. Існує спосіб визначення органічних сполук (антибіотиків лінкоміцину та віргиніаміцину) у тканинах м'язів, печінки та нирок при екстрагуванні гомогенізованих біологічних об'єктів ацетонітрилом з наступним очищенням витяжок від ліпідів екстракцією н-гексаном [8]. Відомий також спосіб визначення дилтіазему при екстрагуванні ацетонітрилом з біологічного матеріалу (проби 5,0 г), що передбачає використовувати нейтральний ацетонітрил з наступним очищенням витяжок центрифугуванням та екстракцією домішок етером [9]. Обидва способи мають недоліки, обумовлені відсутністю підкислюючого агента (недостатньо активно руйнуються зв'язки речовини з білками), відсутністю використання висолювача (значно збільшується вміст домішок у екстрактах); очищення обмежено застосуванням лише екстракційного методу. Існує спосіб визначення органічних сполук (антибіотиків тазобактаму та піперациліну) у жировій тканині при екстрагуванні ацетонітрилом. Профільтровані ацетонітрильні екстракти з жирової тканини аналізують без додаткового очищення ВЕРХ-методом при застосуванні автоматизованої методики з переключенням колонок, сорбент однієї з яких модифікований аміно-групами, що надає можливості при використанні рухомої фази - ацетонітрил-вода (1:20) сконцентрувати отрути з наступним переключенням на аналітичну колонку [10]. Спосіб визначення має певні недоліки, обумовлені використанням різноманітних умов екстрагування та очищення витяжок, які враховують індивідуальні властивості лише досліджуваних речовин з групи антибіотиків. За прототип вибрано спосіб визначення азотовмісних лікарських речовин, до яких належить доксазозин (похідних фенотіазіну та фентанілу) у біологічному матеріалі (проба 50,0 г) при екстрагуванні ацетонітрилом, який складається з основних етапів: підкислення проб 10 % розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-3,0; триразова екстракція порціями 100,0, 50,0 та 50,0 мл ацетонітрилу при настоюванні проб протягом 30, 15 та 15 хв. відповідно. Очищення витяжок здійснюється методом висолювання у 2,5 % розчині натрію сульфату, центрифугуванням та екстракцією домішок діетиловим етером. Отрути реекстрагуються етером після підлуговування водної фази 40 % розчином натрію гідроксиду до рН 12,0-13,0; очищення обмежене застосуванням лише екстракційного методу [11, 12]. 1 UA 73425 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб визначення має певні недоліки, обумовлені використанням різноманітних умов екстрагування та очищення витяжок, які не враховують індивідуальні властивості доксазозину. Задача корисної моделі полягає у створенні нового способу визначення доксазозину у біологічному матеріалі при застосуванні екстракції ацетонітрилом, який шляхом вибору оптимальних умов екстрагування та очищення витяжок при врахуванні властивостей доксазозину забезпечує максимальне виділення доксазозину з біологічного матеріалу при мінімальному екстрагуванні біогенних домішок, а також ефективного очищення витяжок від домішок з наступним достовірним та точним визначенням доксазозину у пробі методом УФспектрофотометрії. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі визначення доксазозину у біологічному матеріалі, що включає екстрагування ацетонітрилом проби біологічного матеріалу, підкисленої 10 % розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-2,5, очищення одержаної витяжки шляхом висолювання 2,5 % розчином натрію сульфату з подальшою реекстракцією доксазозину органічним розчинником після підлуговування водно-органічної фази, згідно з корисною моделлю, на відміну від прототипу пробу тканини печінки масою 10,0 г двічі екстрагують по 10 хвилин відповідно 25,0 мл і 10,0 мл ацетонітрилу, а доксазозин реекстрагують хлороформом двічі по 10,0 мл, водно-органічну фазу підлуговують 25,0 % розчином амонію гідроксиду до рН 9,0-10,0 з повторною екстракцією хлороформом двічі по 10,0 мл, витяжки об'єднують, випарюють до сухого залишку і послідовно очищують шляхом розчинення у кислоті хлористоводневій, екстракції домішок гексаном, проведення тонкошарової хроматографії з подальшим кількісним визначенням доксазозину методом УФспектрофотометрії. Корисною моделлю передбачено, що тонкошарову хроматографію проводять у системі рухомих розчинників хлороформ-ацетон 80:20. Дослідним шляхом визначене наступне. Мінімізація маси проби біологічного матеріалу (10,0 г) та об'єму екстрагента ацетонітрилу (25,0 і 10,0 мл) при здійсненні заявленого способу обумовлює зменшення кількості екстрагованих домішок. Підлуговування водно-органічної фази слабшим за прототип лугом - 25 % розчином амонію гідроксиду до рН 9,0-10,0 забезпечує необхідні умови виділення саме доксазозину і є економічно доцільним. Проведені авторами дослідження з вибору оптимальних умов екстрагування доксазозину з біологічного матеріалу довели оптимальність використання хлороформних витяжок з водноацетонітрильних фаз при рН 2,0-2,5, тому що доксазозин - слабка основа, солі якої у кислому середовищі гідролізуються, тому можлива втрата речовини. Дослідження з вибору оптимальних умов очищення отриманих витяжок від домішок довели також оптимальність використання гексану для екстрагування домішок, тому що доксазозин не екстрагується гексаном з хлористоводневої кислоти. Всі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом, а їх сукупність є новою, невідомою з джерел інформації. Дослідами доведено, що при застосуванні заявленого способу можливо екстрагувати з біологічного матеріалу 89,7±4,8 % доксазозину. Заявлений спосіб може бути використаний для визначення як для речовин основного, так і кислотного характеру. Заявлений спосіб здійснюють шляхом екстрагування тканин печінки трупа (проба 10,0 г) ацетонітрилом двічі об'ємами розчиннику - 25,0 та 10,0 мл протягом 10 хвилин для кожної екстракції при підкислюванні проби 10 % розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-2,5. Очищення ацетонітрильних витяжок здійснюється за допомогою висолювача - 2,5 % розчину натрію сульфату. Екстрагування доксазозину проводять хлороформом двічі по 10,0 мл з водноорганічної фази (рН 2,0-2,5) та двічі по 10,0 мл хлороформом - після підлуговування водноорганічної фази 25 % розчином амонію гідроксиду до рН 9,0-10,0. Для очищення руйнують водно-хлороформні емульсії центрифугуванням. Отримані хлороформні екстракти випаровують до сухого залишку, який додатково очищують при розчиненні у 20,0 мл 0,1 Μ кислоти хлористоводневої та екстракції домішок гексаном тричі по 5,0 мл. Гексанові екстракти відкидають. Очищені хлористоводневі розчини випаровують на водяній бані до сухого залишку, який розчиняють у 5,0 мл етанолу та очищують методом тонкошарової хроматографії. Вміст доксазозину в етанольних розчинах визначають методом УФ-спектрофотометрії при 250 нм при товщині шару 10 мм, розчин порівняння - етанольний розчин, отриманий з контрольної проби за наведеною вище методикою. 2 UA 73425 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вміст доксазозину розраховують за рівнянням градуювального графіка С = 0,001+8,99 А, де С - концентрація доксазозину у стандартному розчині, мкг/мл, А - оптична густина. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Ефективність заявленого способу було досліджено на моделі отруєння проби печінки тварин доксазозином. 0,2 мг доксазозину вносили у проби тканини печінки тварин без ознак гниття по 10,0 г. Проби з доксазозином та контрольні проби залишали на добу при кімнатній температурі Доксазозин екстрагували ацетонітрилом двічі об'ємами розчиннику - 25,0 та 10,0 мл протягом 10 хвилин для кожної екстракції при підкислюванні проби 10 % розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,02,5. Очищення ацетонітрильних витяжок здійснювали за допомогою висолювача - 2,5 % розчину натрію сульфату. Екстрагування доксазозину проводили хлороформом двічі по 10,0 мл з водно-органічної фази (рН 2,0-2,5) та двічі по 10,0 мл хлороформом - після підлуговування водно-органічної фази 25 % розчином амонію гідроксиду (рН 9,0-10,0). Для очищення руйнували водно-хлороформні емульсії центрифугуванням 6000 об/хв. протягом 10 хвилин. Отримані хлороформні екстракти випаровували до сухого залишку, який додатково очищували при розчиненні у 20,0 мл 0,1 Μ кислоти хлористоводневої та екстракції домішок гексаном тричі по 5,0 мл. Гексанові екстракти відкидали, очищені хлористоводневі розчини випаровували при кімнатній температурі до сухого залишку, який розчиняли у 5,0 мл етанолу та очищували методом тонкошарової хроматографії. Оптимальні умови хроматографування: система рухомих розчинників - хлороформ-ацетон (80:20); хроматографічні пластини Сорбфіл ПСТХ-АФ-А; проявник - реактив Драгендорфа за Муньє, (чутливість проявнику -1-3 мкг речовин у пробі); Rf доксазозину = 0,54-0,56, домішки - на лінії старту або на лінії фінішу. Для кількісного визначення доксазозину в екстрактах застосовували УФспектрофотометричний метод при використанні спектрофотометра СФ-46, кювети товщиною 10 мм; max 250±1 нм; розчину порівняння, який отримано з контрольної проби. Вміст доксазозину розраховували за рівнянням градуювального графіка С = 0,001+8,99 А, де С - концентрація доксазозину у стандартному розчині, мкг/мл, А - оптична густина. Встановлено, що інтервал лінійності градуювального графіка складав у діапазоні концентрацій (1,0-8,0 мкг/мл); нижня межа визначення - (0,9 мкг/мл). Отримані дані свідчать про відтворюваність результатів визначення доксазозину за заявленим способом визначення у біологічному матеріалі при застосуванні екстракції ацетонітрилом - до 89,7 %, що підтверджується метрологічними характеристиками доксазозину (відносна невизначеність не перевищує - + 4,8 %). Таким чином, заявлений спосіб визначення доксазозину у біологічному матеріалі при застосуванні екстракції ацетонітрилом характеризується надійністю та відтворюваністю результатів, отриманих за розробленими умовами. Спосіб може бути запропонованим для впровадження в практику роботи бюро судовомедичної експертизи, токсикологічних та наркологічних центрів, клінічних лабораторій по вивченню лікарських речовин у біологічних об'єктах. Джерела інформації: 1. Машковский М. Д. Лекарственные средства - Μ.: ΟΟΟ "Изд-во "Новая волна", 2010-1216 с. 2. Топчій I. I. Роль доксазозину в лікуванні хворих на діабетичну нефропатію з артеріальною гіпертензію / Топчій І. І., Денисенко В. П., Несен А. О.// Врач. практ.-2006. - № 2. - С. 45-49. 3. Liu K. Enantioselective determination ofdoxazosin in human plasma by liquid chromatography-t andem mass spectrometry using ovomucoid chiral stationary phase. / Liu K, Zhong D, Chen X.// J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci-2010. - Vol. 878, № 26. - P. 2415-2420. 4. Bhavesh D. Determination of DOXAZOSIN in human plasma by reversed phase ion-pair HPLC with fluorescence Detection/ D. Bhavesh, S.Pinal, V.Saroj, Shivprakash.// Indian Journal of Pharmaceutical science-2002. - Vol. 64, № 4. - P. 354-356. 5. Randall C. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man Chemical Toxicology InstituteFoster City, 2000-918 p. 6. Clarke E.J.C. Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals, Body Fluids and Postmortem Material London: The Pharm. Press, electronic version, 2005. 7. Кубрак З. В. Определение этацизина в трупном материале / З. В. Кубрак, В. И. Попова // Судебно-мед. экспертиза.-1994. - № 2. - С. 24-25. 3 UA 73425 U 5 10 8. Simultaneous determination of lincomycin and virginiamycin Μ1 in swine muscle, liver and kidney by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry / W.M. Sin Delia, C. Ho, Y.C.Wong et al. // Anal. chim. acta.-2004. - Vol.517, № 1-2. - С. 39-45. 9. Медведева Ю. П. Дослідження ефективності методів ізолюваня дилтіазему з біологічного матеріалу / Ю. П. Медведева, B. C. Бондар // Мед. хімія.-2004. - № 2. - C. 97-100. 10. New andrapid fully automated method for determination of tazobactam and piperacillin in fatty tissue and serum by column switching liquid chromatography / R. Frittler, M. Ehrlich, Τ J.Galla et al. // J. Chromatogr.B-2002.- Vol. 780, № 2. - P. 127-132. 11. Саломатин E. M. Экспресс-метод изолирования производных фенотиазина из трупного материала // Судебно-мед. экспертиза.-1989. - № 1. - С. 39-40. 12. Виділення фентанілу з органів трупа при застосуванні ацетонітрилу та ацетону / Е. І. Стадніченко, В. В. Болотов, B. C. Бондар, О. О. Маміна // Фармац. журн.-1993. - № 4. - С. 66-68. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 1. Спосіб визначення доксазозину у біологічному матеріалі, що включає екстрагування ацетонітрилом проби біологічного матеріалу, підкисленої 10 % розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-2,5, очищення одержаної витяжки шляхом висолювання 2,5 % розчином натрію сульфату з подальшою реекстракцією доксазозину органічним розчинником після підлуговування водно-органічної фази, який відрізняється тим, що пробу тканини печінки масою 10,0 г двічі екстрагують по 10 хвилин відповідно 25,0 мл і 10,0 мл ацетонітрилу, а доксазозин реекстрагують хлороформом двічі по 10,0 мл, водно-органічну фазу підлуговують 25,0 % розчином амонію гідроксиду до рН 9,0-10,0 з повторною екстракцією хлороформом двічі по 10,0 мл, витяжки об'єднують, випарюють до сухого залишку і послідовно очищують шляхом розчинення у кислоті хлористоводневій, екстракції домішок гексаном, проведення тонкошарової хроматографії з подальшим кількісним визначенням доксазозину методом УФспектрофотометрії. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що тонкошарову-хроматографію проводять у системі рухомих розчинників хлороформ-ацетон 80:20. 30 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4