Спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі

1. Спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі, що включає одержання проб з вмістом сумішей зазначених речовин шляхом екстрагування хлороформом подрібнених тканин печінки трупа після попередньої зміни рН середовища та додавання безводного натрію сульфату, послідовне очищення одержаних хлороформних витяжок гексаном, хлороформом та методом тонкошарової хроматографії з використанням відповідних систем розчинників, який відрізняється тим, що з ідентичних порцій одного біологічного матеріалу паралельно одержують дві проби для окремого визначення у суміші речовин основного характеру та речовин кислотного характеру, причому зміну рН середовища для ізолювання речовин основного характеру здійснюють шляхом підлуговування, а U 2 (19) 1 3 35843 ся у медичній практиці, але характеризуються наркотичними та токсичними ефектами. В літературі описані чисельні випадки важких та летальних отруєнь внаслідок перевищення доз таких препаратів при самолікуванні, сумісного їх застосування з іншими препаратами, а також у випадках суїциду. Існують способи визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі за допомогою різних методів виділення, які включають методи ізолювання речовин та очищення витяжок від біогенних домішок. Відомий, наприклад, спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі полягає у ізолюванні речовин з біологічних об'єктів водою або спиртом, підкисленими щавлевою кислотою, та базується на розділенні речовин шляхом реекстрагування їх хлороформом при зміні рН водних або водноспиртових витяжок. Очищення витяжок проводиться при застосуванні різноманітних методів - фільтрації, проціджування, осаджування білків [1]. До недоліків способу можна віднести його низьку ефективність (вихід досліджуваних речовин складає до 30-40%), довготривалість та багатостадійність (виділення та очищення витяжок триває від 1 до 5 діб). Відомий також спосіб визначення лікарських речовин основного характеру у біологічному матеріалі базується на ізолюванні речовин водою, підкисленою сірчаною кислотою, з наступним їх реекстрагуванням хлороформом з водних витяжок після очищення методами висолювання та екстракції домішок етером [1]. Такий спосіб має свої недоліки - низьку ефективність, багатостадійність очищення витяжок, крім того спосіб обмежений у застосуванні, бо придатний лише для аналізу окремої групи речовин основного характеру. Відомий спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі при застосуванні ацетону для екстрагування речовин з тканин органів труп у. Спосіб дозволяє розділити речовини в результаті реекстрагування їх хлороформом при зміні рН водноацетонових витяжок. Очищення витяжок проводиться при використанні висолювання та екстракції домішок етером або гексаном [2]. До недоліків способу можна віднести довготривалість та багатостадійність очищення витяжок, що обумовлює значні втрати досліджуваних речовин. Відомий також спосіб визначення барбітуратів у біологічному матеріалі при використанні води, підкисленої сірчаною кислотою для їх ізолювання з біологічного матеріалу з наступним реекстрагуванням їх хлороформом з водної фази після очищення витяжок методом гель-хроматографії [3]. До недоліків способу можна віднести довготривалість очищення при застосуванні гельхроматографії та використання дорогокоштуючих гелей сефадексів, крім того спосіб придатний лише для аналізу окремої групи речовин кислотного характеру. Відомі способи визначення індивідуальних ре 4 човин (кофеїну, метоклопраміду, трамадолу, бромгексину і амброксолу) та окремих груп речовин (похідних фенотіазину) у біологічному матеріалі при екстракції речовин хлороформом безпосередньо з біологічних об'єктів без зміни рН середовища, які базуються на ізолюванні їх хлороформом у колонці з безводним натрію сульфатом та очищенні витяжок екстракцією домішок етером і методом тонкошарової хроматографії [4-8]. До недоліків зазначених способів можна віднести їх придатність для аналізу лише індивідуальних речовин та окремих груп речовин без урахування можливості дослідження сумішей отрут основного та кислотного характеру при комбінованих отруєннях. Відсутні уніфіковані умови очищення витяжок, тобто методики очищення розроблені з урахуванням індивідуальних властивостей речовин. Відомі способи визначення окремих групалкалоїдів та синтетичних речовин основного або кислотного характеру, зокрема похідних кислоти барбітурової, які базуються на зміні рН середовища біологічного матеріалу при додаванні різних агентів - розчинів різних кислот та лугів з наступним ізолюванням речовин хлороформом у колонці та очищенням хлороформних витяжок при застосуванні екстракції домішок за методиками, розробленими з урахуванням властивостей окремих гр уп речовин або індивідуальних отрут [9, 10]. Такі способи можуть використовува тися для визначення окремих груп речовин або індивідуальних отрут, але вони розроблені без урахування можливості дослідження сумішей різних за фізикохімічними властивостями отрут та характеризуються відсутністю уніфікованих умов екстрагування сумішей речовин хлороформом та очищення хлороформних витяжок. В якості прототипу вибрано спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру, згідно з яким до 5,0г тканини печінки трупу додають 0,5мл агентів для зміни рН середовища (25% розчин амонію гідроксиду або 0,1М розчин натрію гідроксиду; 10% розчин кислоти щавлевої або 0,01М розчин кислоти сірчаної або 0,1М розчин кислоти хлористоводневої), 15-20г безводного натрію сульфату та розтирають у ступці до утворення сипкої маси, переносять до скляної колонки 25см х 1см та проводять елюювання речовин хлороформом об'ємом 100мл зі швидкістю 6080крап/хв. Після випарювання хлороформних витяжок та розчинення залишку у 0,1 М розчині кислоти хлористоводневої здійснюють очищення витяжок екстракцією жирів і ліпідів гексаном та білкових сполук хлороформом з наступним застосуванням методу тонкошарової хроматографії. Кількісне визначення речовин проводять методами ультрафіолетової спектрофотометрії і екстракційної фотометрії [11]. Проте відомий спосіб, хоча і призначений для аналізу речовин основного або кислотного характеру, не враховує можливості аналізу комбінованих отр уєнь. Завдання корисної моделі полягає у створенні способу визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі 5 35843 шляхом паралельного аналізу двох ідентичних проб, одержаних з печінки трупу на наявність у суміші окремо речовин основного та речовин кислотного характеру з використанням тонкошарової хроматографії у заданій системі розчинників, що забезпечує е фективність, експресність та економічність способу і надає можливість використовувати заявлений спосіб як уніфікований для визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру, як у сумішах, так і індивідуально. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у біологічному матеріалі, який включає одержання проб з вмістом сумішей зазначених речовин шляхом екстрагування хлороформом подрібнених тканин печінки трупа після попередньої зміни рН середовища та додавання безводного натрію сульфату, послідовне очищення одержаних хлороформних витяжок гексаном, хлороформом та методом тонкошарової хроматографії з використанням відповідних систем розчинників, корисною моделлю передбачено, що з ідентичних порцій одного біологічного матеріалу паралельно одержують дві проби для окремого визначення у суміші речовин основного характеру та речовин кислотного характеру, причому зміну рН середовища для ізолювання речовин основного характеру здійснюють шляхом підлуговування, а речовин кислотного характеру - шляхом підкислення. Згідно з корисною моделлю тонкошарову хроматографію при визначенні речовин основного характеру здійснюють у системі розчинників хлороформ-метанол (9:1), а речовин кислотного характеру - у системі розчинників хлороформізопропанол-25% розчин амоніаку (4,5:4,5:0,5), причому в якості проявників у першому випадку використовують реактив Драгендорфа у модифікації за Муньє з утворенням плям оранжевого кольору, а у др угому послідовно використовують 2% розчин ртуті (II) сульфату та 0,2% розчин дифенілкарбазону у хлороформі з утворенням плям фіолетового кольору. У відповідності з корисною моделлю кількісне визначення як лікарських речовин основного характеру, так і речовин кислотного характеру, здійснюють після тонкошарової хроматографії методом високоефективної рідинної хроматографії або газорідинної хроматографії, або ультрафіолетової спектрофотометрії, або екстракційної фотометрії, або похідної спектрофотометрії, або будь-яким іншим придатним методом. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Відбирають дві середні проби масою по 10,0г підрібненої тканини печінки трупу. Для зміни рН середовища до проби для визначення речовин основного характеру додають 0,5мл 25% розчину амонію гідроксиду, а до проби для визначення речовин кислотного характеру додають 0,5мл 0,1М розчину кислоти хлористоводневої. Проби розтирають окремо у ступках з 25-30г безводного натрію сульфату до стану сипкої маси, потім переносять у дві скляні колонки діаметром 17-20мм (відповідно - для ізолювання речовин основного та кислотного характеру). 6 Після елюювання речовин хлороформом (по 100мл) з колонок проводять екстракційне очищення витяжок з біологічного матеріалу, яке складається з двох е тапів: екстракція домішок гексаном та екстракційне очищення витяжок при застосуванні хлороформу. Для речовин основного характеру очищення проводиться наступним чином: отримані хлороформні витяжки упарюють до сухого залишку, який розчиняють в 0,1М розчину кислоти хлористоводневої. Домішки екстрагують гексаном, а основи речовин ізолюють хлороформом з водної фази після підлуговування 25% розчином амонію гідроксиду до рН 9-10. Для очищення речовин кислотного характеру отримані хлороформні витяжки упарюють до сухого залишку, який розчиняють в 0,1М розчину натрію гідроксиду. Домішки екстрагують гексаном, а кислотні форми речовин ізолюють хлороформом з водної фази після підкислювання 0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2-3. Очищення витяжок методом тонкошарової хроматографії також проводять за уніфікованими умовами, застосовуючи хроматографічні пластинки Сорбфіл. Для речовин основного характеру використовують систему органічних розчинників - хлороформ-метанол (9:1); проявник - реактив Драгендорфу у модифікації за Муньє (плями оранжевого кольору); для речовин кислотного характеру - систему органічних розчинників - хлороформізопропанол-25% розчин амоніаку (4,5:4,5:0,5); проявник - послідовна обробка 2% розчином ртуті (II) сульфа ту та 0,2% розчином дифенілкарбазону в хлороформі (плями фіолетового кольору). Кількісне визначення речовин в витяжках проводять за методами високоефективної рідинної хроматографії, газорідинної хроматографії, УФспектрофотометрії, екстракційної фотометрії, похідної спектрофотометрії або будь-яким іншим придатним способом. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Експериментальним шляхом вивчено можливість застосування заявленого способу при визначенні речовин основного та кислотного характеру в тканині печінки трупу. 100,0г тканини печінки без ознак гниття подрібнювали ножицями до розміру часток 0,3-0,5см, ретельно перемішували, а потім відбирали середні проби об'єкту масою по 10,0г. До 10,0г подрібненої тканини печінки для визначення речовин основного характеру з метою зміни рН додавали 0,5мл 25% розчину амонію гідроксиду, а до іншої проби для визначення речовин кислотного характеру - 0,5мл 0,1М розчину кислоти хлористоводневої. До обох проб додавали 2030г безводного натрію сульфату і розтирали у ступках до утворення сипкої маси (при необхідності масу підсушували при кімнатній температурі). У дві скляні колонки діаметром 17-20мм, у вузьку нижню частину їх поміщали марлеві тампони, засипали отримані сипкі маси. Над колонками поміщали ділильні лійки з 100мл хлороформу та пропускали хлороформ крізь колонки зі швидкістю 60крап/хв, утримуючи "дзеркало" над біологічним 7 35843 матеріалом. Об'єм кожної з хлороформних витяжок становив біля 90мл. Для екстракційного очищення отримані хлороформні витяжки, які містять речовини основного характеру, фільтр ували через фільтр з 1,0г безводного натрію сульфату, упарювали на водяному огрівнику при температурі 40°С до сухого залишку, який розчиняли в 20мл 0,1М розчину кислоти хлористоводневої, домішки тричі екстрагували гексаном по 15мл, гексанову фазу відкидали, а водну фазу підлуговували 25% розчином амонію гідроксиду до рН 9,0-10,0 та двічі екстрагували хлороформом (порціями по 15 і 10мл); емульсії руйнували центрифугуванням протягом 7-10хв зі швидкістю 3000об/хв. Для екстракційного очищення отримані хлороформні витяжки, які містять речовини кислотного характеру, фільтрували через фільтр з 1,0г безводного натрію сульфату, упарювали на водяному огрівнику при температурі 40°С до сухого залишку, який розчиняли в 20мл 0,1М розчину натрію гідроксиду, домішки тричі екстрагували гексаном по 15мл, гексанову фазу відкидали, а водну фазу подкислювали 0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-3,0 і двічі екстрагували хлороформом (порціями по 15 и 10мл), емульсії руйнували центрифугуванням протягом 7-10хв зі швидкістю 3000об/хв. Для очищення одержаних витяжок методом тонкошарової хроматографії в уніфікованих умовах отримані після екстракційного очищення хлороформні витяжки по 25мл, упарювали до об'єму 5-7мл, фільтрували через фільтр с 0,4-0,5г безводного натрію сульфату у мірні колби місткістю 10мл та доводили об'єми до мітки хлороформом. Об'єм хлороформної витяжки - 2-4мл упарювали до 0,3-0,5мл та наносили у вигляді смуги довжиною 2см на лінію старту хроматографічних пластинок Сорбфіл (тип сорбенту - силікагель ПСТХ - 1А, зернення - 5-17мкм, товщина шару 110мкм, зв'язуючий агент - силіказоль, тип основи - ПЕТФ-Є (поліетилен та тефлон). Одночасно на пластинку наносили декілька свідків (у кожну точку по 20-50мкг) на відстані 1,5-2см від смуги, використовуючи стандартні 0,01% хлороформні або спиртові розчини досліджуваних речовин. Хроматографування проводили в камерах об'ємом 500см 3, в які вносили по 50мл відповідної системи розчинників з наступним насиченням камери парами розчинників не менше 30хв; довжина пробігу фронту рухомої фази - 8см. Після чого хроматографічні пластинки висушували при кімнатній температурі. Частини пластинок, де знаходились свідки, обробляли проявником. Домішки були розташовані на лініях старту та фінішу. При визначенні речовин основного характеру застосовували систему органічних розчинників хлороформ-метанол (9:1), а речовин кислотного характеру - хлороформ-ізопропанол-25% розчин амоніаку (4,5:4,5:0,5), причому у якості проявників у першому випадку використовували реактив Драгендорфу у модифікації за Муньє з утворенням плям оранжевого кольору, а у другому - послідовно застосовували 2% розчин ртуті (II) сульфату та 0,2% розчин дифенілкарбазону в хлороформі з 8 утворенням плям фіолетового кольору. Встановлено, що в умовах аналізу значення Rf для досліджуваних речовин становили: для отрут основного характеру - лідокаїну (0,75±0,02), кокаїну (0,49±0,02), аміназину (0,53±0,02), дипразину (0,37±0,03), тизерцину (0,41±0,02), клофеліну (0,33±0,03), циклодолу (0,63±0,03), промедолу (0,43±0,03), димедролу (0,33±0,02), фентанілу (0,76±0,03) та для отрут кислотного характеру барбіталу (0,49±0,02), барбамілу (0,70±0,02), етаміналу (0,75±0,03). На рівні знаходження плями стандартного розчину досліджуваної речовини з частини пластинки, яка не була оброблена проявником, знімали шар сорбенту площею 4-5см 2, переносили на фільтр та тричі елювали речовину хлороформом по 5мл. Отриманий розчин упарювали на водяному огрівнику при температурі 40°С та залишок розчиняли у відповідному розчиннику. Встановлено, що при здійсненні заявленого способу шляхом ізолювання речовин хлороформом з тканини печінки трупу, очищення витяжок екстракційним і ТШХметодами та кількісного визначення речовин хроматографічними та спектральними методами можливо визначити у тканині печінки трупу - до 70,7±5,9% лідокаїну, до 82,5±4,2% кокаїну, до 79,9±5,4% аміназину, до 75,2±4,4% дипразину, до 74,2±3,9% тизерцину, до 78,7±5,7% клофеліну, до 43,9±4,3% циклодолу, до 40,1±4,0% промедолу, до 73,9±4,3% димедролу, до 56,3±6,7% фентанілу, до 34,8±4,8% барбіталу, до 78,2±5,6% барбамілу, до 74,3±3,3% етаміналу. Таким чином, заявлений спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру в біологічному матеріалі характеризується ефективністю, експресністю, економічністю, а також надійністю та відтворюваністю отриманих результатів. Спосіб може бути застосований у роботі контрольно-аналітичних та хіміко-токсикологічних лабораторій. Джерела інформації: 1. Информационное письмо главного судебномедицинского эксперта по количественному определению органических соединений, выделенных из внутренних органов трупа человека методами Стаса-Отто, Васильевой А.А. и Крамаренко В.Ф. М., 1991. - 19 с. 2. Карташов В.А. Изучение вопросов экстракции лекарственных веществ из биологического материала: Автореф. дис.... д-ра. фармац. наук. Барнаул, 1990. - 41 с. 3. Попова В.И. Выделение и очистка барбитуратов методом гель-хроматографии в химикотоксикологическом анализе: Автореф. дис.... д-ра. фармац. наук. - Львов, 1977. - 44 с. 4. Маміна О.О. Розробка схеми спрямованого аналізу печінки трупа на кофеїн.// Вісник фармації. - 2001. - №3. - С.35. 5. Болотов В.В. Порівняльна оцінка методів виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу/ В.В. Болотов, В.П. Мороз, М.А. Зареченський // Вісник фармації. - 1999. - №1. - С.45-48. 6. Болотов В.В. Порівняльна оцінка методів виділення трамалу з біологічного матеріалу / В.В. Болотов, Е.Ю. Ахмедов // Вісник фармації. - 2001. 9 35843 №1. - С. 16-19. 7. Болотов В.В. Порівняльна оцінка методів виділення бромгексину та амброксолу з біологічного матеріалу / В.В. Болотов, С.М. Полуян // Вісник фармації. - 2003. - №1. - С.21-25. 8. Маміна О.О. Застосування хлороформу для ізолювання похідних фенотіазину з тканини печінки трупу/ О.О. Маміна, В.В. Болотов // Фармац.журн - 2004. - №1. - С.85-88. 9. Мамина Е.А. Разработка схемы направленного анализа производных барбитуровой кислоты в биологическом объекте / Е.А. Мамина, В.В. Бо Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 10 лотов // Хим.-фармац. журн. - 2004. - №10. - С.5356. 10. Маміна О.О. Порівняльна оцінка методів ізолювання «лікарських» отрут основного характеру з біологічних об'єктів.// Фармацевт. журн. - 2001. - №5. - С.70-74. 11. Маміна О.О. Пробопідготовка при ізолюванні отрут основного та кислотного характеру з тканини печінки трупа хлороформом / О.О. Маміна, В.В. Болотов // Запорожский мед. журн. -2006. №5. - С.38-41. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601