Спосіб діагностики генетичних маркерів у дітей з брохіальною астмою

Реферат: UA 73570 U UA 73570 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до дитячої алергології і може бути використана для визначення генетичних маркерів у дітей з бронхіальною астмою як в процесі діагностики, так і для оцінки ефективності лікування та при диспансерному спостереженні, при визначенні прогнозу, розробки реабілітаційних програм. Ідентифікація специфічних генів і екзогенних факторів, які, взаємодіючи між собою, формують стійкість людини до середовища проживання, представляє значний інтерес для клінічної медицини. Однак, вочевидь, спектр реакцій різних індивідуумів на однотипні зовнішньосередовищні впливи достатньо варіабельний і коливається від збереження упродовж певного періоду здоров'я у одних, до розвитку тяжких захворювань у інших. Якщо однакові впливи призводять до різних реакцій організму, то обов'язково постає питання про причинні фактори такої вибірковості. Відомо, що діти є найбільш сприйнятливою групою населення до шкідливих впливів зовнішніх факторів внаслідок недосконалого розвитку всіх функціональних систем організму. Тому в умовах несприятливої екологічної ситуації особливої актуальності набирають проблеми вивчення вкладу генетичних і зовнішньосередовищних чинників у патогенез хронічних захворювань систем, які безпосередньо контактують із факторами зовнішнього середовища (дихальна, шлунково-кишковий тракт і т.д.). Бронхіальна астма (БА) займає провідне місце у структурі бронхолегеневих захворювань, що викликаються впливом пневмотропних забруднювачів. Доведено, що у 2-15 % пацієнтів основною причиною бронхіальної обструкції є безпосередній вплив органічних і неорганічних хімічних сполук. В той же час, дослідження останніх років показали, що клінічні прояви і перебіг БА у дітей, що проживають в однакових умовах, визначаються не стільки характером, складом і тривалістю впливу несприятливих факторів зовнішнього середовища, скільки індивідуальними особливостями організму. Тому актуальним є вивчення тих систем організму, які визначають тип та ступінь його реакцій у відповідь на середовищні впливи. Важливу роль у захисті легень від токсичних продуктів відіграють ферменти системи біотрансформації ксенобіотиків (ДТК). Дисбаланс між здатністю організму знешкоджувати ксенобіотики і їх надходженням в організм може призвести до небажаних наслідків, таких як порушення гомеостазу та накопичення токсичних речовин. Система захисту від ксенобіотиків представлена триетапним процесом, що включає фази активації, нейтралізації і виведення ксенобіотиків із організму та забезпечується системою ферментів ДТК. В кожній групі ферментів, що приймають участь у детоксикації, можуть виявлятись мутантні ізоформи, функція яких порушена у порівнянні із нормальними алелями. На сьогодні відомо, що функціонально неповноцінні алелі значно частіше зустрічаються у осіб із захворюваннями, в етіології яких важливу роль відіграють несприятливі екзогенні фактори. Поза тим, процес ДТК регулюється відповідними генами, що контролюють кожну із фаз детоксикації. До таких генів належать: гени цитохромів Ρ 450, цитоплазматичної та мікросомальної ЕРНХ1, родини GST-GSTNT1, GSTM1, GSTP1, гени ацетилування ксенобіотиків - ΝΑΤ1, ΝΑΤ2, VDR і ін. На відміну від моногенних хвороб, для виникнення яких достатньо наявності мутацій в структурному гені, БА належить до групи мультифакторних захворювань, в розвитку яких задіяні як генетичні, так і екзогенні фактори. Одним із генів, що може бути причетним до розвитку БА, є ген ЕРНХ1, локалізований на хромосомі 1 в локусі lq 42.1, а зростання активності ферментів, що кодуються mEPHX1, індукує накопичення активних інтермедіатів, сприяє виникненню оксидативного стресу, і, як наслідок, розвитку захворювання. Відомий спосіб визначення молекулярно-генетичних особливостей формування і перебігу професійного бронхіту у працівників промислових підприємств республіки Башкортостан, які піддаються впливу промислових аерозолів складної структури для розробки системи профілактичних заходів [Мингазова С.Р. Клинико-генетические особенности профессионального бронхита у работников промышленных предприятий / Мингазова С.Р. // Автореф. канд. мед. наук. - М.: - 2011]. Проте, цей спосіб не може бути використаний у дітей з бронхіальною астмою, оскільки не відображає впливу саме бронхіальної астми на якість життя хворої дитини, не застосовувався в принципі для діагностики та оцінки тяжкості перебігу даного захворювання у дітей, а запропонований як генетичні особливості професійного бронхіту у дорослих. Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, є спосіб оцінки ролі поліморфізму генів ферментів метаболізму ксенобіотиків у розвитку бронхіальної астми і туберкульозу, який полягає в тому, що дозволяє вивчити поширеність частот поліморфних варіантів генів ферментів метаболізму ксенобіотиків у вибірці здорових індивідів, а також оцінити зв'язок поліморфізму досліджуваних генів з атопічною бронхіальною астмою та туберкульозом легень у дорослій популяції [Брагина Е.Ю. Сравнительный анализ наследственной компоненты 1 UA 73570 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 подверженности к бронхиальной астме и туберкулезу по генам ферментов метаболизма ксенобиотиков - / Е.Ю. Брагина // Автореф. канд. биолог. наук. - Томск, 2005]. Проте, дана методика належить виключно до галузі дорослої пульмонології та алергології і була запропонована для вивчення лише на конкретній популяційній вибірці, що не може бути однозначно використано для порівняння результатів генетичних досліджень між різними популяціями людей, що проживають на різних, в плані екології, територіях. Крім того, ці способи діагностики бронхіальної астми у дітей не враховують важливості впливу генетичної компоненти на розвиток даної недуги, як мультифакторіального захворювання та, у зв'язку з цим, не оцінюють можливих шкідливих впливів факторів навколишнього середовища на тяжкість перебігу астми у дітей. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу винайти маркери шляхом генетичних досліджень, які б дозволили забезпечити можливість молекулярно-генетичної діагностики бронхіальної астми у дітей, враховуючи детоксикацію ксенобіотиків в популяції здорових та дітей із БА. Поставлена задача вирішується тим, що за способом діагностики генетичних маркерів у дітей з різним ступенем контрольованості бронхіальної астми, що включає визначення генів ферментів детоксикації ксенобіотиків І фази генетичних дослідженнь ДНК, виділеної із лейкоцитів периферійної крові пацієнтів, виділення та очистку ДНК за допомогою комерційних наборів DIAtom™ DNA Prep200, GenePak DNA PCR test, подальше дослідження ампліфікації послідовностей ДНК in vitro методом полімеразної ланцюгової реакції в автоматичному режимі на термоциклері "Терцик" з використанням олігонуклеотидних праймерів набору реагентів для ампліфікації GenePak® PCR Core, визначення специфічності ПЛР-продуктів послідовністю специфічних праймерів, температурою відпалу та складом реакційної суміші генотипування поліморфних локусів досліджуваних генів на основі програм проведення полімеразної ланцюгової реакції та кількості циклів, згідно з запропонованою корисною моделлю, поліморфні варіанти гена mEPHX1 визначають за допомогою мультилокусної ПЛР, далі проводять комплексний аналіз поліморфізму гена mEPHX1, визначають у локусі Т337С частоту гомозиготних мутантних делецій СС, нормального гомозиготного алелю ТТ у дітей із різними фенотипами бронхіальної астми, а у локусі A415G гомозиготний варіант GG активності ферментів, що кодуються mEPHX1, за якими оцінюють індукування накопичення активних інтермедіатів, виникнення оксидативного стресу і розвиток захворювання, при цьому маркерами взаємозв'язку спадкових і середовищних факторів у детермінації бронхіальної астми та розвитку ступеня тяжкості захворювання використовують гомозиготні варіанти АА та СС і гетерозиготний варіант AG генетичних досліджень. Таким чином, опираючись на відомі дані, що у носіїв мутантного генотипу СС швидкість ДТК знижується до 50,0 %, оскільки поліморфізм гена mЕРНХ 1 чітко корелює з рівнем ферментативної активності білка [Zusterzeel et al., 2001] і, проаналізувавши фенотипові прояви БА та спираючись на те, що фермент може знаходитись у декількох функціонально різних станах - "повільному", "швидкому", "нормальному", обумовлених мутаціями в 3-му і 4-му екзонах, відповідно, виділили 3 фенотипи:"швидкий"- має 1 або 2 мутації в екзоні 4-му і не має мутацій в екзоні 3 (TT-GG або AG); "повільний" - 2 мутації в 3 екзоні і відсутні в 4-му (СС-АА); "нормальний" або "проміжний" - не має мутації в гені mEPHX1 або є гетерозиготним по мутаціях в 3 і 4 екзонах (ТТ-АА або TC-AG) і на основі отриманих нами даних доведено, що наявність "повільного" генотипу у дітей з неконтрольованою бронхіальною астмою (НКБА) у 1,5 разу перевищує такий у дітей з частково контрольованою бронхіальною астмою (ЧКБА). Висока активність ферменту спостерігається у дітей з НКБА достовірно частіше. При цьому у дітей із БА незалежно від фенотипу найбільш поширеними є комбінації алелей АА-ТТ та AG-TT, які відповідають "швидкому" метаболізму ферментів детоксикації ксенобіотиків (ДТК) в організмі, тобто спостерігається тенденція до накопичення мутантного генотипу, що при недостатній активності ферментів II фази ДТК призводить до накопичення активних інтермедіатів. Аналіз поширеності частот генотипів поліморфізму TC-AG, що відповідає "проміжному" рівню ферментативної активності, підтверджує статистично достовірну різницю частот у пацієнтів із ЧКБА. Найчастіше у пацієнтів із БА має місце "швидкий" функціональний стан ферментів, що кодуються геном mEPHX1, спостерігається і "повільний" функціональний стан гена mEPHX1, що відповідає варіантам гомо- та гетерозигот по мутантних алелях: СС-АА та ТС-АА. Крім того, аналіз поширеності частот даних генотипів між пацієнтами із НКБА та ЧКБА, засвідчує, що зареєстровані показники є більшими у дітей із тяжчим перебігом захворювання. Поширеність алелей поліморфних варіантів гена mEPHX1, що відповідають "проміжному" рівню ферментативної активності, є меншою у обох групах пацієнтів. 2 UA 73570 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тенденція до збільшення частоти мутантного генотипу у пацієнтів із БА та її пряма залежність від ступеня тяжкості захворювання вказує на те, що розвиток і прогресування БА у дітей пов'язаний із накопиченням проміжних електрофільних метаболітів, що сприяє виникненню оксидативного стресу. Отримані результати підтверджують, що комбінація різних поліморфних варіантів гена mEPHX1 та наявність "швидких" і "повільних" його варіантів є доволі вагомим прогностичним фактором щодо розвитку та тяжкості перебігу БА, а на реалізацію БА, як екодетермінованої патології, впливають індивідуальні варіанти метаболічної активності генів детоксикації ксенобіотиків. Отже, генетичний поліморфізм генів ферментів біотрансформації ксенобіотиків приводить до відмінностей в їх активності, а притаманні ферментам індуцибельність і генетичні відмінності лежать в основі широкої міжіндивідуальної варіабельності в метаболізмі чужорідних сполук, створюючи можливість дисбалансу процесів детоксикації і токсифікації, тобто, запропоновані згідно з корисною моделлю маркери дозволять забезпечити можливість молекулярногенетичної діагностики бронхіальної астми у дітей, враховуючи детоксикацію ксенобіотиків в популяції здорових та дітей із БА. Таким чином, сукупність запропонованих і відомих суттєвих ознак і їх причинно-наслідковим зв'язком отримують технічний результат, достатній для вирішення поставленої задачі корисної моделі. Спосіб діагностики генетичних маркерів у дітей з бронхіальною астмою здійснюють так: із лейкоцитів периферичної крові пацієнта проводять виділення та очистку ДНК, ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro методом ланцюгової полімеразної реакції в автоматичному режимі на термоциклері "Терцик", використовуючи олігонуклеотидні праймери; специфічність ПЛРпродуктів визначають послідовністю специфічних праймерів, температурою відпалу та складом реакційної суміші; генотипування поліморфних локусів досліджуваних генів проводять з використанням різних програм проведення полімеразної ланцюгової реакції та різної кількості циклів; поліморфні варіанти гена mEPHX1 визначають за допомогою мультилокусної ПЛР та проводять комплексний аналіз поліморфізму гена mEPHX1. Приклад. Обстежено запропонованим способом 94 дітей віком від 6 до 18 років, хворих на БА, які лікувалися в алергологічному відділенні ОДКЛ м. Івано-Франківська в 2009-2010 pp. та групу контролю, яку склали діти, відібрані методом випадкової вибірки, що проживають в різних районах Івано-Франківської області (157 осіб). Діагноз БА верифікували згідно із Протоколом діагностики і лікуванням БА у дітей. Щодо рівня контрольованості БА, діти були розподілені наступним чином: 44 (46,8 %) - із частково контрольованою астмою (ЧКБА), 50 (53,2 %) - із неконтрольованою астмою (НБКА). Аналіз частоти комбінацій генотипів mEPHX1 генів детоксикації ксенобіотиків у дітей з різним ступенем контрольованості БА показав, що фенотипічний варіант БА значною мірою визначається станом генотипу. Зокрема, гомозиготна мутантна делеція СС (His113His) мала місце у 20,5 % обстежених із НКБА та у 12,0 % пацієнтів із ЧКБА (р0,05). Порівняння частот аллелей і генотипів ТС (Tyr113His) у дітей з різним ступенем контролю БА виявило, що у дітей з НКБА гетероносії склали 31,8 % проти 46,0 % у дітей з ЧКБА (р