Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: UA 73796 U UA 73796 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 12 Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока умовна концентрація поверхнево-активних речовин. В основу корисної моделі покладено задачу створення нового способу одержання поверхнево-активних речовин, який підвищує умовну концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 і Acineto-bacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення. Згідно з корисною моделлю як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю та енергії гліцеринової фракції (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка), дає змогу підвищити у 1,4-1,5 разу умовну концентрацію ПАР (до 7,1). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3 1,3; MgSO4 × 7H2O0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4 × 7H2O-0,001; pH 6,8-7,0. A. calcoaceticus 1MB В7241 вирощують на середовищі наведеного вище складу, в якому нітрат натрію замінено на (NH2)2CO-0,35 г/л. Як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцеринової фракції Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 1,4-1,5 разу умовну концентрацію ПАР. Приклад 1. Синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на очищеному гліцерині Культивування штаму 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO4 × 7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4 × 7H2O0,001; pH 6,8-7,0. A. calcoaceticus 1MB В-7241 вирощують на середовищі наведеного вище складу, в якому нітрат натрію замінено на (NH 2)2CO-0,35 г/л. Як джерело вуглецю та енергії використовують очищений гліцерин (ступінь очищення 98 %) у концентрації 0,5 і 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Поверхневий натяг (σs) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності σ s від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої 1 UA 73796 U 5 10 відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою бензином. Біомасу визначають ваговим методом. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР R. erythropolis EK-1 A. calcoaceticus 1MB В-7241 на середовищі з очищеним гліцерином. Таблиця 1 Ріст і синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 та A. calcoaceticus 1MB В-7241 на гліцерині Концентрація гліцерину, % 0,5 A. calcoaceticus 1MB В-7241 1,0 0,5 R. erythropolis 1MB Ас-5017 1,0 Штам 15 20 25 30 35 40 Біомаса, г/л 0,5±0,02 0,8±0,04 1,2±0,06 1,5±0,07 ПАР* 1,5±0,07 2,4±0,12 2,0±0,10 2,5^,12 Е24, % 39±3 36±4 37±2 47±2 Дані, наведені у табл. 1, свідчать, що штами здатні асимілювати гліцерин і синтезувати метаболіти з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями, хоча показники синтезу є невисокими. Приклад 2. Синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на "неочищеному" гліцерині Гліцеринова фракція, що утворюється в процесі виробництва біодизеля, містить 60-80 % гліцерину. Серед інших складових цього відходу можна назвати воду, солі та інші органічні матеріали, причому вміст кожного компонента коливається в широких межах в залежності від типу використовуваної сировини. Головним завданням на сьогодні є отримання мікроорганізмів, стійких до інгібіторів, що присутні в неочищеному гліцерині, особливу увагу серед яких необхідно приділяти решткам метанолу, а також натрієвим або калієвим солям, оскільки відомо, що вони здатні до пригнічення росту клітин. У зв'язку з цим, на наступному етапі досліджували можливість використання неочищеного гліцерину як субстрату для отримання поверхневоактивних речовин A. calcoaceticus ІMB В-7241 і R. erythropolis ІMB Ас-5017. Для цього моделювали середній склад гліцеринової фракції за кількістю залишкових спиртів (метанолу або етанолу) та солей натрію або калію (у вигляді хлоридів). Такий субстрат називатимемо "неочищений" гліцерин. Культивування штамів ІMB Ас-5017 і 1MB В-7241 здійснювали на середовищах, склад яких наведено у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовували "неочищений" гліцерин (в очищений гліцерин добавляли у різних комбінаціях етанол або метанол - 0,3 %, об'ємна частка, хлориди калію або натрію масовою часткою 2,5 %). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищах наведеного складу, що містило 0,5 % (об'ємна частка) очищеного гліцерину як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначали як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР на "неочищеному гліцерині" наведено у табл. 2. 2 UA 73796 U Таблиця 2 Синтез поверхнево-активних речовин штамами ІMB Ас-5017 і 1MB В-7241 на "неочищенному" гліцерині Джерело вуглецю, Вміст хлоридів, % % КСl, 2,5 Гліцерин, 1,0 NaCl, 2,5 R. КСl, 2,5 Гліцерин, 1,0 erythropolis 1MB + метанол, 0,3 NaCl, 2,5 Ас-5017 КСl, 2,5 Гліцерин, 1,0 + етанол, 0,3 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 Гліцерин, 1,0 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 А. calcoaceticus Гліцерин, 1,0 1MB В-7241 + метанол, 0,3 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 Гліцерин, 1,0 + етанол, 0,3 NaCl, 2,5 Штам ПАР* ПАР*, % від контролю 3,l±0,16 3,5±0,18 2,9±0,15 3,3±0,17 3,9±0,20 4,6±0,23 2,5±0,13 2,8±0,14 2,9±0,15 3,2±0,16 3,5±0,17 3,6±0,18 119±6,0 135±6,7 112±5,6 128±6,1 150±7,5 177±8,9 104±5,2 117±5,9 121±6,0 133±6,7 146±7,3 150±7,5 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ПАР на середовищі з 1 % гліцерину. 5 10 15 20 25 Як видно з табл. 2., внесення у середовище культивування обох штамів КСl або NaCl у концентрації 2,5 % приводило до підвищення показників синтезу ПАР на 4-35 %. Наявність цих солей навіть у кількості 5-10 % не спричиняла значного інгібування процесів утворення ПАР (дані не наведено). Така закономірність може бути пояснена стимулюючим впливом катіонів цих металів на активність ферментів анаплеротичних реакцій та біосинтезу поверхнево-активних речовин досліджуваних штамів. Приклад 3. Утворення ПАР за умов росту штамів ІMB В-7241 і ІMB Ас-5017 на відходах виробництва біодизеля (технічний гліцерин, гліцеринова фракція). Культивування штамів ІMB Ас-5017 і ІMB В-7241 здійснювали на середовищах, склад яких наведено у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують гліцеринову фракцію - побічний продукт виробництва біодизеля (м. Запоріжжя), що містить 50-70 % гліцерину, жирні кислоти, катіони калію та залишки метанолу. Концентрація гліцеринової фракції становить 1,5-2,5 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищах наведеного складу, що містило 0,5 % (об'ємна частка) гліцеринової фракції як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначали як описано у прикладі 1. Дані щодо можливості використання гліцеринової фракції як субстрату для синтезу ПАР наведено у табл. 3. Як видно з наведених у табл. 3 даних, у разі підвищення концентрації гліцеринової фракції у середовищі культивування обох штамів з 1,5 до 2,1 % спостерігається збільшення показника умовної концентрації ПАР до 7,1. Подальше підвищення концентрації гліцеринової фракції супроводжується зниженням показника ПАР*. Проте для всіх досліджуваних концентрацій гліцеринової фракції значення ПАР* є суттєво вищим порівняно з використанням як субстрату очищеного гліцерину. Крім того, за умов росту обох штамів на середовищі з гліцериновою фракцією показники синтезу ПАР вищі, ніж наведені у прототипі. 3 UA 73796 U Таблиця 3 Синтез ПАР штамами 1MB Ас-5017 і ІMB В-7241 на відходах виробництва біодизеля (гліцеринова фракція) Концентрація гліцеринової фракції (%, об'ємна частка) 1,5 1,7 1,9 2,0 R. eiythropolis 1MB Ас-5017 2,1 2,3 2,5 Пересмажена олія (прототип) 1,5 1,7 1,9 A. calcoaceticus 1MB В-7241 2,0 2,1 2,3 2,5 ПАР* ПАР*, % від контролю 4,9±0,24 5,3±0,26 7,1±0,35 7,0±0,35 7,0±0,35 5,3±0,26 4,6±0,23 196±9,8 212±10,6 284±14,2 280±14,0 280±14,0 212±10,6 184±9,2 4,9±0,24 6,0±0,30 6,5±0,32 7,1±0,35 7,1±0,35 7,0±0,35 4,8±0,24 4,3±0,21 250±12,5 271±13,6 296±14,8 296±14,8 292±14,6 200±10,0 179±9,0 Штам Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ПАР на середовищі з 1 % очищеногогліцерину. 5 10 15 Концентрація 1 % очищеного гліцерину приблизно еквімолярна за вуглецем 2 % гліцеринової фракції. Таким чином, культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на середовищі, що містить як джерело вуглецю гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка) дає змогу підвищити в 1,4-1,5 разу умовну концентрацію ПАР (до 7,1) порівняно з прототипом. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 і Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4