Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, який характеризується тим, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента фумарату і цитрату, при цьому вміст мінеральних компонентів у середовищі культивування становить (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, а концентрація фумарату і цитрату UA 98258 C2 (12) UA 98258 C2 0,01-0,02 %. Спосіб дає змогу підвищити синтез поверхнево-активних речовин у 1,8-2 рази і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі. UA 98258 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 [Пат. 92819 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Тарасенко Д.О., Яцук Д.В. Опубл. 10.12.2010, Бюл. № 23], який передбачає культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для підвищення концентрації ПАР та скорочення тривалості культивування продуцента на початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом чи гексадеканом вносять 0,2-0,25 % фумарату і 0,1-0,15 % цитрату. Недоліком цього способу є високий вміст солей у середовищі культивування штаму ІMB Ас5017 (8,9 г/л) і недостатньо висока концентрація синтезованих поверхнево-активних речовин. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який знижує вміст солей у середовищі культивування і підвищує концентрацію синтезованих ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента фумарату і цитрату. Згідно з винаходом вміст мінеральних компонентів у середовищі культивування становить (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, а концентрація фумарату і цитрату - 0,01-0,02 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як продуцента ПАР штаму A. calcoaceticus ІMB В-7241 і культивування його на середовищі, що містить (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001 з внесенням на початку стаціонарної фази росту 0,01-0,02 % фумарату і цитрату дає змогу підвищити синтез поверхнево-активних речовин у 1,8-2 рази і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001 pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту у середовище одночасно вносять 0,01-0,02 % фумарату і цитрату натрію. Фумарат і цитрат вносять у середовище у вигляді 10 %-них розчинів натрієвих солей. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % етанолу. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 1,8-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі культивування. Приклад 1. Вплив фумарату і цитрату на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 і A. calcoaceticus ІMB В-7241 на етанолі. Культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 6,8; NaOH - 1,0; NH4NO3 - 0,6; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСl2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001; рН - 6,8-7,0. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001 рН - 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол і гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis ІMB Ас-5017 і A. 1 UA 98258 C2 5 10 15 20 25 30 35 calcoaceticus ІMB В-7241 з середини експоненційної фази, вирощену на рідкому середовищі з 1,0 % (об'ємна частка) етанолу чи гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять фумарат натрію у концентрації 0,2 % і цитрат натрію у концентрації 0,1 %. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Поверхневий натяг (s) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник «умовної концентрації ПАР» (ПАР*, безрозмірні одиниці). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності s від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Як видно з наведених у табл. 1 даних, ефективність від внесення у середовище культивування штаму A. calcoaceticus ІMB В-7241 фумарату і цитрату у концентрації 0,2 і 0,1 % відповідно є значно нижчою порівняно зі штамом R. erythropolis ІMB Ас-5017. Так, за присутності органічних кислот у середовищі з етанолом кількість синтезованих R. erythropolis ІMB Ас-5017 ПАР підвищується у два рази (з 0,94 до 1,9 г/л), а синтезованих A. calcoaceticus ІMB В-7241 лише в 1,3 рази. Ці дані засвідчують необхідність встановлення оптимальних для штаму ІMB В7241 концентрацій фумарату і цитрату. Таблиця 1 Синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 і A. calcoaceticus ІMB В-7241 на етанолі за присутності органічних кислот Концентрація органічних кислот, % 0 (субстрат - етанол) Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 (субстрат - етанол) R. erythropolis ІMB Ас-5017 (прототип) 0 (субстрат - гексадекан) Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 (субстрат - гексадекан) 0 A. calcoaceticus ІMB В-7241 Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 Штам ПАР* ПАР, г/л 3,4±0,17 0,94±0,04 5,1±0,25 1,90±0,09 3,4±0,17 1,5±0,07 6,6±0,30 2,5±0,12 4,0±0,20 4,3±0,21 1,7±0,08 2,2±0,11 40 45 Враховуючи, що за досліджуваних концентрацій органічних кислот показники синтезу ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 підвищуються незначно, а концентрація попередників біосинтезу (чи індукторів) зазвичай не перевищує 10 % концентрації основного джерела вуглецевого живлення, у наступних експериментах концентрацію фумарату і цитрату знижували. Приклад 2. 2 UA 98258 C2 5 10 Визначення оптимальної концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом вносять фумарат і цитрат у концентрації 0,01-0,2 %. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрації поверхнево-активних речовин, який визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл. 2, показують, що з підвищенням концентрації фумарату і цитрату показник умовної концентрації ПАР знижується. Найвищі значення ПАР* спостерігаються у разі виростання органічних кислот в концентрації 0,01-0,03 %. Таблиця 2 Вплив концентрації фумарату і цитрату на синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 Концентрація фумарату, % 0,01 0,02 0,03 0,06 0,08 0,10 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 15 20 25 Концентрація цитрату, % 0 0 0 0 0 0 0 0,01 0,02 0,03 0,06 0,08 0,10 0,12 0 ПАР* 5,3±0,26 5,9±0,29 5,0±0,25 4,8±0,24 4,7±0,23 4,2±0,21 4,2±0,21 5,2±0,.26 5,8±0,29 5,1±0,25 4,4±0,22 4,3±0,21 4,2±0,21 4,2±0,21 4,0±0,20 Приклад 3. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 за одночасного внесення у середовище з етанолом фумарату і цитрату. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом одночасно вносять фумарат і цитрат у концентрації 0,01-0,03 %. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 30 °С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Синтез ПАР оцінюють за кількістю ПАР, яку визначають ваговим методом після екстракції поверхнево-активних речовин сумішшю хлороформу з метанолом (2:1) як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, найбільша концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин досягається у разі одночасного внесення у середовище з етанолом фумарату і цитрату у концентрації 0,01-0,02 %. 3 UA 98258 C2 Таблиця 3 Синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 залежно від концентрації одночасно внесеного фумарату і цитрату Концентрація фумарату, % 0 0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 5 Концентрація цитрату, % 0 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03 0,03 ПАР, г/л 1,7±0,08 5,1±0,25 4,8±0,24 3,2±0,16 4,8±0,24 4,6±0,23 3,1±0,15 3,1±0,15 3,0±0,15 2,9±0,14 Таким чином, використання як продуцента ПАР штаму A. calcoaceticus ІMB В-7241 і внесення у середовище з етанолом на початку стаціонарної фази росту 0,01-0,02 % фумарату і цитрату дає змогу підвищити синтез поверхнево-активних речовин у 1,8-2 рази і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який характеризується тим, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту продуцента фумарату і цитрату, при цьому вміст мінеральних компонентів у середовищі культивування становить (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, а концентрація фумарату і цитрату 0,01-0,02 %. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4