Спосіб визначення катаболічної активності мікроорганізмів

Реферат: Спосіб визначення катаболічної активності мікроорганізмів включає введення мікроорганізмів у вигляді суспензії добової культури, катаболічну активність яких визначають. Потім визначають у досліджуваній і контрольній пробах концентрації глюкози глюкозооксидазним методом. Після цього визначають катаболічну активность мікроорганізмів за зміною стану середовища. UA 74763 U (12) UA 74763 U UA 74763 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до способів дослідження мікроорганізмів, які утилізують глюкозу, і може бути використана в мікробіологічних (бактеріологічних) лабораторіях науково-дослідних інститутів, санітарно-епідеміологічних станцій, лікувально-профілактичних установ та біотехнологічних виробництв. Відомий спосіб визначення цукролітичної активності мікроорганізмів кондуктометричним методом [1]. Згідно з відомим способом мікроорганізми вносять у рідке поживне середовище, що містить вуглеводи. При цьому мікроорганізми розщеплюють вуглеводи поживного середовища, утворюючи різні іонізовані продукти розпаду (кислоти), завдяки чому змінюється електропровідність середовища, що реєструється кондуктометрично на діаграмній стрічці за допомогою приладу "ФЕРМЕНТ-1". Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі катаболічну активність мікроорганізмів визначають шляхом внесення мікроорганізмів, катаболічну активність яких потрібно визначити, у рідке поживне середовище, що містить вуглеводи, і реєстрації кількості спожитої глюкози, на базі чого визначають катаболічну активність мікроорганізмів. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є незадовільна точність отриманих результатів, зумовлена необхідністю вимірювання незначних змін електропровідності, які майже дорівнюють похибці приладу. Відомий глюкозооксидазний метод визначення глюкози у біологічних рідинах - сироватці, плазмі крові, сечі [2]. Його здійснюють таким чином: змішують калібрувальний або аналізований, фізіологічний, буферний розчини і ензими. Суміш витримують 20 хвилин при кімнатній температурі 18-25 °С або 12 хвилин при температурі 37 °C. Після цього вимірюють щільність калібрувальної (Екал) та досліджуваної проб (Едосл) проти холостої проби фотометром при довжині хвилі 500-550 нм та довжині оптичного шляху 5-10 мм. Розрахунок концентрації глюкози проводять за формулою С=10×К×Едосл/Екал (ммоль/л), (1) де С - концентрація глюкози в досліджуваній пробі; 10 - концентрація глюкози в калібрувальному розчині ммоль/л; Едосл - оптична щільність досліджуваної проби, опт. одиниць щільності; Екал - оптична щільність калібрувальної проби, опт. одиниць щільності; К - коефіцієнт розведення (при необхідності). Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі до досліджуваної і контрольної проб додають фізіологічний, буферний розчини й ензими, вимірюють оптичну щільність проб фотометром та визначають концентрацію глюкози згідно з формулою (1). Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є неможливість визначення відомим способом катаболічної активності мікроорганізмів, обумовлена тим, що як матеріал для дослідження використовують біологічні рідини, які містять глюкозу з невизначеними параметрами. Найближчий аналог вибраний відомий спосіб визначення катаболічної активності мікроорганізмів за допомогою строкатих середовищ Гісса ("строкатий ряд") [3]. Згідно із відомим способом вводять мікроорганізми, катаболічну активність яких потрібно визначити, у поживне середовище, створене таким чином: до 100 мл дистильованої води додають 1 г пептону і 0,5 г хлориду натрію. Пептон і хлорид натрію розчиняють у воді, нагрівають, фільтрують, встановлюють рН 7,0-7,4 і додають 0,5-1,0 г одного з вуглеводів (глюкоза, сахароза, лактоза і т.і.) та 1,0 % індикатору Андреде. Розчин розливають у пробірки, стерилізують при 120 °C упродовж 30 хвилин. При розщепленні бактеріями вуглеводу, в даному випадку глюкози, поживне середовище змінює свій колір. Спостерігаючи за зміною кольору середовища, якісно визначають катаболічну активність мікроорганізмів. Як і в запропонованій корисній моделі, у відомому способі катаболічну активність мікроорганізмів визначають шляхом введення мікроорганізмів, катаболічну активність яких визначають, у рідке поживне середовище, створене попередньо на основі поживного середовища Гісса, що містить глюкозу і визначення катаболічної активності мікроорганізмів за зміною стану середовища. Причиною, що перешкоджає отриманню технічного результату, є незадовільна точність визначення катаболічної активності мікроорганізмів, зумовлена виключно якісною оцінкою. Задачею, на вирішення якої спрямована запропонована корисна модель, є створення способу визначення катаболічної активності мікроорганізмів. 1 UA 74763 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Технічний результат, який може бути одержаний при використанні запропонованої корисної моделі, полягає в збільшенні точності визначення катаболічної активності мікроорганізмов за кількістю окисленої ними глюкози. Суть запропонованої корисної моделі полягає в тому, що катаболічну активність мікроорганізмів визначають шляхом введення мікроорганізмів, катаболічну активність яких визначають, у рідке поживне середовище, створене попередньо на основі поживного середовища Гісса, що містить певну кількість глюкози, і визначення катаболічної активності мікроорганізмів за кількістю окисленої глюкози, при цьому мікроорганізми вводять в поживне середовище у вигляді суспензії добової культури з оптичною щільністю 1,0 за McFarland, через визначені проміжки часу визначають концентрацію глюкози у досліджуваній і контрольній пробах глюкозооксидазним методом і за їх різницею роблять висновок про кількість спожитої глюкози, що дає змогу судити про рівень катаболічної активності мікроорганізмів. Поставлена задача досягається тим, що мікроорганізми вводять у поживне середовище у вигляді суспензії добової культури з оптичною щільністю 1,0 за McFarland, через визначені відрізки часу визначають концентрацію глюкози у досліджуваній і контрольній пробах глюкозооксидазним методом і за їх різницею роблять висновок про рівень катаболічної активності мікроорганізмів. Введення у поживне середовище на основі поживного середовища Гісса, що містить глюкозу, мікроорганізмів у вигляді суспензії добової культури з оптичною щільністю 1,0 за McFarland дає можливість зафіксувати вихідні параметри мікроорганізмів і глюкози, а визначення концентрації глюкози через певні проміжки часу у досліджуваній і контрольній пробах глюкозооксидазним методом дає можливість встановити кількість спожитої мікроорганізмами глюкози після додавання мікробної суспензії до субстрату і зробити висновок про метаболічну активність мікроорганізмів, активацію або пригнічення катаболічних процесів. Можливість одержання технічного результату доведена експериментально. Дані, отримані під час експерименту про концентрацію глюкози в контрольній і дослідній пробі на початку і наприкінці досліду та про кількість спожитої глюкози наведені в Таблиці 1. Дані про швидкість метаболізму для кожного використаного у експерименті штаму мікроорганізмів наведені в Таблиці 2. Індивідуальні графіки швидкості метаболізму для кожного взятого у досліді штаму наведені на графіку. Для здійснення статистичної обробки даних досліди проводять в 3-5 повторюваннях. Запропонований спосіб здійснюється таким чином. Готують субстрат, який містить усі необхідні для метаболізму елементи: дистильована вода 1000 мл пептон ферментативний 20 г натрій хлорид 8,5 г глюкоза 10 г (1%). Отриманий субстрат фільтрують через ватно-марлевий фільтр та стерилізують при температурі 120 °C впродовж 30 хвилин. Суспензію мікроорганізмів (добова культура) готують з оптичною щільністю 1,0 за McFarland. До 0,9 мл субстрату додають 0,1 мл суспензії мікроорганізмів (добова культура) з оптичною щільністю 1,0 одиниць за McFarland або 0,1 мл фізіологічного розчину (контрольна проба), витримують впродовж 18-20 годин при температурі 37 °C, центрифугують 10-15 хвилин при 3000 об/хв. та додають до супернатанту ензими. Суміш витримують 20 хвилин при кімнатній температурі (18-25)°С або 12 хвилин при температурі 37 °C. Після чого вимірюють оптичну щільність калібрувальної Екал та досліджуваної Елосл проб проти холостої проби фотометром при довжині хвилі 500-550 нм та довжині оптичного шляху 5-10 мм. Розрахунок концентрації глюкози здійснюють за формулою (1). Кількість розщепленої мікроорганізмами глюкози визначають за різницею між концентрацією глюкози в контрольній та досліджуваній пробах. За отриманими результатами роблять висновок про метаболічну активність мікроорганізмів, активацію чи пригнічення катаболічних процесів у кожному з використаних штамів (Таблиця 2). Статистична обробка даних здійснювалась згідно із правилами рядової і альтернативної варіаційної статистики [4-6]. Достовірність розбіжностей визначали за допомогою критерію t-Стьюдента, з обчисленням середньої величини М, середньоквадратичного відхилення S, середньої похибки величини m, значення достовірності р. Для аналізу одержаного матеріалу проводилось його групування за атрибутивними і варіаційними ознаками. Результати обробляли за допомогою персонального комп'ютера із застосуванням комп'ютерних програм Statistika-6, Microsoft Office Excel 2003. 2 UA 74763 U 5 10 15 20 Згідно з Таблицею 1, бактерії, які знаходились у дослідній пробі, утилізують 3,85 ммоль/л глюкози. Також можна визначити не тільки спожиту мікроорганізмами глюкозу (Таблиця 2) за певний проміжок часу та побудувати індивідуальні графіки швидкості метаболізму для кожного взятого у дослід штаму. Для можливості статистичної обробки даних досліди проводять в 3-5 повторюваннях. Результати досліджень доводять, що запропонований спосіб придатний не тільки в якості кількісного способу визначення спожитої тими чи іншими мікроорганізмами глюкози, але й для визначення швидкості катаболічних процесів. Джерела інформації: 1. Никитин В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов [Текст] / В. М. Никитин. - Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1986. - 296 с. - 3000 экз. - ИБ № 3459. 2. Інструкція для визначення глюкози у біологічних рідинах глюкозооксидазним методом. ТУ У 24.4-24607793-020-2003 с. 1-4. 3. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований [Текст] / под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной [учебное пособие]. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005. - 600 с.: ил. - ISBN 5-225-04666-5. 4. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel [Текст] / С. Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич. - К.: Морион, 2000. -320 с. ISBN 966-7632-16-4. 5. Боровиков В.П. Statistica. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows [Текст] / В.П. Боровиков, И.П. Боровиков. - М.: Филинъ, 1998.-592 с. 6. Прикладная медицинская статистика [Текст] / [под ред. В.М. Зайцева, В.Г. Лифляндского]. - СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2000. - 299 с. Таблиця 1 Проба Концентрація глюкози (ммоль/л) на початку досліду наприкінці досліду Контрольн а Дослідна Кількість спожитої глюкози 35,9 35,9 0 35,9 32,05 3,85 25 Таблиця 2 Штам мікроорганізмів 1 S. aureus ATCC 25923 S. aureus № 1 E. coli ATCC 25922 E. coli № 4 Calbicans ATCC885-653 C. albicans № 9 C. diphtheriae gravis tox-№ 1 С. diphtheriae gravis tox-№ 108-109 С. diphtheriae mitis tox-№ 2 С. diphtheriae mitis tox-№ 9-10 Кількість спожитої глюкози (ммоль/л), (M±m), через 3 год. 6 год. 9 год. 24 год. 2 3 4 5 1,06±0,03 1,88±0,02 2,02±0,04 2,28±0,03 2,26±0,03 3,52±0,04 4,22±0,03 5,41±0,06 2,74±0,03 5,04±0,01 5,46±0,01 5,81±0,01 0,52±0,005 0,94±0,006 1,28±0,06 1,81±0,007 1,26±0,03 3,44±0,07 9,67±0,09 33,18±0,12 2,38±0,02 5,86±0,08 11,21±0,1 25,65±0,12 2,56±0,03 5,04±0,02 5,48±0,03 6,19±0,03 2,28±0,08 4,95±0,05 5,22±0,07 5,83±0,06 18,29±0,11 32,58±0,12 32,96±0,11 33,22±0,08 1,99±0,01 4,98±0,02 5,13±0,07 5,82±0,03 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб визначення катаболічної активності мікроорганізмів, що включає введення мікроорганізмів, катаболічну активність яких визначають, у рідке поживне середовище, створене попередньо на основі поживного середовища Гісса, що містить глюкозу, і визначення катаболічної активності мікроорганізмів за зміною стану середовища, який відрізняється тим, що мікроорганізми вводять у поживне середовище у вигляді суспензії добової культури з оптичною щільністю 1,0 за McFarland, визначають у досліджуваній і контрольній пробах через певні проміжки часу концентрації глюкози глюкозооксидазним методом, і за їх різницею роблять висновок про рівень катаболічної активності мікроорганізмів. 3 UA 74763 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4