Спосіб ферментативного одержання цефалоспорину с

1. Способ ферментативного получения цефалоспорина С, предусматривающий ферментацию продуцента Acremonium chrysogenium в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в аэробных условиях с последующей фильтрацией ферментационного раствора через фильтрационную систему в поперечном потоке и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что фильтрацию ферментационного раствора проводят во время ферментации с замещением количества фильтрата в ферментере. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве фильтрационной системы в поперечном потоке применяют полимерный или керамический фильтр с размером пор 4-200 нм. 3. Способ по п. 1 или 2, о т л и ч аю щ и й с я тем, что скорость перетекания через поверхность фильтра составляет 1-10 м/сек. 4. Способ по пп. 1 или 2, или 3, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что фильтрат в ферментере замещают водой или Питательным раствором. Культурапьные жидкости, содержащие антибиотики в общем случае вырабатываются после достижения максимального содержания. В большинстве случаев первым шагом является разделение клеток и твердых частиц при помощи фильтрации или центрифугирования. За этим может следовать концентрирование ценных составляющих путем экстракции или адсорбции. Как правило, затем очищенный продукт кристаллизуется и может обрабатываться для получения полусинтетических антибиотиков. Недостатком этого пошагового метода является нестабильность большого количества молекул антибиотиков, например таких как цефалоспорин С (ЦФС). ЦФС разлагается уже во время ферментации. Это происходит либо чисто химически вода воздействует на р-лактамное кольцо, либо ферментативно - например при помощи эстераз [Konecny et a!., 1973 // J. of Antib 26, 3, 135-141]. Во время ферментации также образуется ряд вторичных продуктов, таких как деацетокси (24) 11.10.99 (31) Р 4127648.5 (32)21.08.91 (33) DE (86) /ЕР 92/01811 (08.08.92) (46) 11.10.99. Бюл. № 6 (56) Kalyanpur M. et a!. Isolation of Cephalosponn C from Fermentation Broths Using Membrane Systems and HPLC // Dev. Ind. Microbiol., 1985, 26, Chap. 32, 4 5 5 470. (72) Байер Томас (DE), Шрамм Вільгельм (DE), Ратшек Вольфганг (DE) (73) Хьохст Актінгезельшафт (DE) NJ О 26549 цефалоспорин С (ДОЦФС) и деацетилцефалоспорин С (ДЦФС), которые нужно удалять из ЦФС на этапе очистки. Это приводит к значительному уменьшению выхода. Системы проточной фильтрации с использованием полимерных или керамических мембран уже использовались для обработки культуральных жидкостей, содержащих антибиотики [Harris et al. // J. Chem. Techn. Biotechnol. 1988, 42, 19-30]. Однако до сих пор не было обнаружено пониженное разложение цефалоспорина С в этих процессах. Предметом настоящего изобретения является обнаружение способа, при котором можно уменьшить разложение цефалоспорина С и образование вторичных продуктов, а также увеличить выход по отношению к используемому субстрату. Неожиданно было обнаружено, что применение узла проточной фильтрации при ферментации Acremomum chrysogenum позволяет увеличить выход ЦФС, уменьшить образование ДЦФС и увеличить время производства. Такая фильтрация и тот факт, что образуются малые количества ДЦФС, дополнительно существенно упрощают получение цефалоспорина С. Таким образом, настоящее изобретение относится к методу получения ЦФС, который заключается в фильтровании раствора ферментации через систему проточной фильтрации и возможности замены удаляемого количества фильтрата в ферментере. В методе согласно настоящего изобретения для использования подходят Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremomum), а также их мутанты и продукты селекции, поскольку они производят ЦФС-производные. Питательный раствор содержит источники углерода, такие как сахароза, кукурузный крахмал, декстроза или меласса, а также источники азота, такие как соевая мука, мука арахиса, экстракт солода или ацетат аммония. Питательный раствор также содержит такие неорганические соли, как гидрофосфат натрия, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат кальция, карбонат кальция, сульфат магния или дигидрофосфат калия. В питательную среду можно также добавить такие жиры, как метилолеат или соевое масло. Также добавляются микроэлементы, такие соли железа, меди, цинка, кобальта или других металлов» 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), предпочтительно DSM 6473 культивируется при 20-30°С, предпочтительно при 25°С, и при рН от 5 до 8, предпочтительно рН 7. Сначала оно культивируется аэробно в вибраторной колбе, а затем в ферментере с перемешиванием и аэрированием воздухом или чистым кислородом. Эти микроорганизмы культивируются в ферментерах в течение 120-240 часов, предпочтительно 130-170 ч. Используемые системы проточной. фильтрации могут быть плоскими модулями, трубчатыми модулями, капиллярными модулями, спиральными модулями или мембранными модулями с пустотелыми волокнами, изготовленными из полимеров, графита или керамики с возможностью разделения от сверхтонкой фильтрации до стерильной фильтрации. Предпочтительно использовать фильтрационные модули, имеющие размер пор от 0,2 мкм либо 4 нм. Мембрана может быть изготовлена из полисульфонов, полиамидов, ацетата целлюлозы, оксида алюминия или оксида циркония. Фильтрацию можно осуществлять непрерывно или по порциям. Ее начинают примерно через 2-3 дня после инокуляции ферментера, и продолжают до конца ферментации. Скорость потока раствора ферментации через поверхность фильтрации составляет 1-20 м/с, предпочтительно 1-Ю м/с. Фильтрат, вытягиваемый из ферментера во время ферментации, можно заменить соответствующим количеством жидкости, либо, по другой методике, этот фильтрат может снова поступать в ферментер после отделения ценного продукта, например с помощью абсорбции. С этой целью внутрь может подаваться вода, обогащенная соответствующими солями или другими компонентами питательной среды. Жидкость, не прошедшая мембрану, повторно подавалась в ферментер. Ферментер и система проточной фильтрации связаны соответствующими трубками и простерилизованы перед ферментацией. На 100 л объема ферментера требуется приблизительно 0,2 м2 фильтрационной поверхности. Можно также использовать меньшие или большие фильтрационные поверхности. П р и м е р 1. Ферментация Acremonium chrysogenum DSM 6473. Ферментация проводилась в таком питательном растворе: 26549 Предкультивационная среда, г/л: Кукурузная замочка 11,75 Ацетат аммония 4,5 Сахароза 20,0 CaSO. • 2Н„О 0,5 7К„О 0,5 MnSO4 рН 7,0 (доведено при помощи 15 вес. % NaOH) Среда ферментации, г/л: Обезжиренная мука арахиса 100,0 Ацетат аммония 6,0 Моногидрат глюкозы 5,0 • Метилолеат 5,0 D.L-Метионин 3,0 CaSO4 • 2Н2О 5,0 MnSO4 • 7Н.0 5,0 СаСО3 5,0 Противовспениватель 0,5 Раствор дозагрузки: Моногидрат глюкозы 500,0 D.L-Метионин 24,5 Для инокуляции предкультивационной среды (500 мл вибрационная колба с 4 перегородками) были использованы косячки агара. В этих колбах культивация протекала на протяжении 48 ч при 150 оборотах в минуту при 25-28°С. Эти культуры были использованы для инокуляции еще одной предкультуры (1000 мл среды, 5000 мл колбы, 25-28°С, 120 об/мин, от 5 10 15 20 25 30 58 до 60 ч). Вторая предкультура используется для инокуляции 60 л среды ферментации в ферментере с мешалкой. Ферментация проводится при 25°С. Поток газа контролировался таким образом, чтобы рО2 в питательном растворе ферментации превышало 20%. После 74 ч ферментации была начата фильтрация с использованием проточного керамического модуля (изготовленного фирмой "Мембрафлоу",