Спосіб оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo

Реферат: Спосіб оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo включає спектрофотометричну реєстрацію утворення відновленої форми нікотинаміддинуклеотиду в інкубаційнійному середовищі. Потім проводять паралельне визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1). UA 75758 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ РІВНЯ ЕНЕРГЕТИЧНОГО МЕТАБОЛІЗМУ МІОКАРДА ШЛЯХОМ ДОСЛІДЖЕННЯ БІОХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТКАНИНИ МІОКАРДА IN VIVO UA 75758 U UA 75758 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до діагностики, наприклад до визначення вимірювань чи реєстрації, дослідження чи аналізу матеріалів шляхом визначення їх біохімічних властивостей, та може бути використаною в кардіології. Відомий спосіб дослідження метаболізму міокарда [1], оснований на інфузії серця тварин субстратом з наступним вимірюванням його концентрації в артеріальній і венозній крові. Недолік технічного рішення цього способу зумовлений трудомісткістю і тривалістю терміну проведення, а також обмеженою інформативністю і точністю, зумовлених тим, що в ході одного експерименту досліджується тільки один із численних біохімічних показників метаболізму міокарда. Відомий спосіб визначення складу креатиніну, креатіну і саркозину в біологічних рідинах [2], що включає інкубацію проби з реагентом, який містить буферні речовини і інші інгредієнти, з наступним вимірюванням інтенсивності фарбування отриманої суміші з стандартним взірцем при довжині хвилі 546 нм. Недоліком об'єкта також є низька точність кінцевого результату, що зумовлене неможливістю вивчення біологічних тканин і органів, а також значними витратами біологічних рідин (3-5 мл). В основі способу визначення активності дегідрогеназ пентозофосфатного шляху [3] покладене фракціонування гомогенату досліджуваного зразка (шматочка тканини масою 1-5 г) методом диференціального центрифугування у соляному буфері, який містить 0,15 Μ KCL і 0,02 Μ KНСО3 і отриманні цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій. Визначення ферментативної активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49) і 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44) в отриманих фракціях проводять в інкубаційному середовищі (обсягом 3,0 мл), що містить 5 мкМ трис HCL буфер, 50 мкMgCL2, 5 мкМ субстрату (глюкозо-6-фосфат (натрієва сіль) або 6-фосфоглюконат (натрієва сіль). В кювету спектрофотометра додають 3 мл інкубаційного середовища, 0,1 мл гомогенату і починають реакцію шляхом додавання 0,1 мл 5 мкм розчину НАДФ. Вивчення оптичної щільності розчину в ході дегідрогенізованої реакції реєструють шляхом спектрофотометрії протягом 5 хв з інтервалом 1 хв. Розрахунок активності ферментів проводять за формулою: А=3000ΔΕ/6,22 а, де а - вміст білка в досліджуваній пробі, мг; ΔΕ - зміна оптичної щільності розчину в середньому за 1 хв. Вміст білка визначають за методом Bradford [4]. Для цього 0,1 мл мітохондріальної або плазматичної фракцій зразка вносять в 5 мл 0,01 % розчину Кумассі G250, який містить 4,7 % етанолу і 8,5 % ортофосфорної кислоти. Через 2 хв вимірюють оптичну щільність розчину за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 595 нм. Вміст білка визначають по калібрувальній кривій, отриманій при використанні відомих концентрацій альбуміну. Як і вищезазначене сімейство аналогів, цей спосіб теж характеризується замалою точністю, внаслідок неможливості одночасного визначення активності фермента і відповідного субстрата в одному взірці (ділянці тканини), значними витратами біологічного матеріалу, що не дозволяє проводити визначення ферментативної активності в обсязі тканини масою менше 1 г, а також замалою інформативністю дослідження, зумовленою неможливістю паралельного визначення і співставлення активності деяких ферментів із різних циклів енергетичного метаболізму. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити такий спосіб оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo, який шляхом спектрофотометричної реєстрації утворення відновленої форми нікотинаміддинуклеотиду в інкубаційному середовищі, в якому за рахунок паралельного визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій різних ферментів енергетичного метаболізму забезпечується можливість проведення кількісного співставлення інтенсивності різних метаболічних циклів в одному взірці міокарда, у тому числі на обмеженій кількості тканини (біопсійний матеріал при діагностичних операціях в клініці; малі лабораторні тварини, ембріональне серце), забезпечує підвищення точності та зниження тривалості дослідження при використанні. Поставлена задача, вирішується тим, що у відомому способі оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo, що включає спектрофотометричну реєстрацію утворення відновленої форми нікотинаміддинуклеотиду в інкубаційнійному середовищі, у відповідності з корисною моделлю, додатково після гомогенізації зразка проводять паралельне визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6 1 UA 75758 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6-фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій, пірувату і малату, і за величиною показників активності ферментів оцінюють рівень метаболізму міокарда. За умов відтворення способу, саме паралельне визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій, пірувату і малату, компенсують наслідки низької точності, зумовленої неможливістю одночасного визначення активності фермента і відповідного субстрату в одному взірці (ділянці тканини), значними витратами біологічного матеріалу, що не дозволяє проводити визначення ферментативної активності в обсязі тканини масою менше 1 г, а також замалої інформативності дослідження, зумовленої неможливістю паралельного визначення і співставлення активності деяких ферментів із різних циклів енергетичного метаболізму, а від того, забезпечують покращення точності оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo. Відомості, які підтверджують можливість відтворення способу оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo, з досягненням вищезазначеного технічного результату полягають у наступному. Із 150 мг тканини міокарда біопсійного матеріалу отримують 5 % тканинний гомогенат. Із 3 мл приготованого на холоді гомогенату відбирають 1,6 мл для визначення концентрації лактату, малату, пірувату, а решту частини 1,4 мл підпорядковують диференціальному центрифугуванню для визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальних фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій за методом Bradford [4]. Пропонований спосіб оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo забезпечує підвищення точності діагностики на 20 % та скорочує тривалість останньої у 1,5 рази у порівнянні з прототипом, переважно за рахунок паралельного визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій, пірувату і малату. Приклад. Під час проведення хірургічного втручання з приводу атеросклеротичної серцевосудинної хвороби серця у хворого чоловіка 43 років були вилучені два шматочки біопсійного матеріалу із лівого шлуночка: один із зони ішемії, другий - із патологічно не зміненої зони. Із 150 мг тканини міокарда біопсійного матеріалу відповідно кожного зразка отримали 5 % тканинний гомогенат. Із 3 мл приготованого на холоді гомогенату відбирали 1,6 мл для визначення концентрації лактату, малату, пірувату, а решту частини 1,4 мл підпорядковували диференціальному центрифугуванню для визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальних фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій за методом Bradford [4]. Результати вимірювань змін біохімічних показників визначили відмінність рівня енергетичного метаболізму міокарда в патологічно не зміненій зоні ділянки міокарда лівого шлуночка і в зоні ішемії ділянки міокарда лівого шлуночка хворого, що наведене в таблиці. 2 UA 75758 U Таблиця Показники концентрації біохімічних ферментів в патологічно не зміненій зоні ділянки міокарда лівого шлуночка і в зоні його ішемії ділянки у хворого Біохімічні ферменти та їх № з/п активність 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5 10 15 Лактат Піруват Малат Білок в мітохондріальній фракції Білок в цитоплазматичній фракції Активність ЛДГ в мітохондріальній фракції Активність ЛДГ в цитоплазматичній фракції Активність ПДГ в мітохондріальній фракції Активність ПДГ в цитоплазматичній фракції Активність НАД-МДГ в мітохондріальній фракції Активність НАД-МДГ в цитоплазматичній фракції Активність трансамінази АлАТ Активність трансамінази АсАТ Активність Г6ФДГ в мітохондріальній фракції Активність Г6ФДГ в цитоплазматичній фракції Активність 6ФГДГ в мітохондріальній фракції Активність 6ФГДГ в цитоплазматичній фракції Активність СДГ Концентрація ферментів в патологічно не зміненій зоні ділянки міокарда лівого шлуночка 2,04 мкмоль/г 0,14 мкмоль/г 0,36 Концентрація ферментів в зоні ішемії ділянки міокарда лівого шлуночка 0,23 мкмоль/г 0,01 мкмоль/г 0,02 53,6 мг/г 23,3 мг/г 18,3 мг/г 08,1 мг/г 0,39 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 1,68 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 23,8 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 12,3 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 1,24 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 2,11 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,346 мкмоль пірувату/г тканини за год. 0,633 мкмоль пірувату/г тканини за год. 6,14 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 2,43 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 3,87 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 1,22 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 12,4 нмоль сукцинату/хв на 1 мг білка 0,02 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,52 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 8,97 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 3,64 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,15 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,08 мкмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,063 мкмоль пірувату/г тканини за год. 0,137 мкмоль пірувату/г тканини за год. 1,53 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,23 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 0, 78 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 0,11 нмоль НАД/хв на 1 мг білка 2,21 нмоль сукцинату/хв на 1 мг білка Таким чином, як видно із прикладу конкретного випадку, пропонований спосіб дозволяє провести кількісне співставлення інтенсивності різних метаболічних циклів по одному взірцю біопсійного матеріалу (за рахунок паралельного визначення активності ферментів циклу трикарбонових кислот, окислювального фосфорилування, трансамінування, пентозофосфатного шунта), тобто - визначити рівень енергетичного метаболізму в патологічно зміненій зоні ділянки міокарда, що дозволяє підвищити точність дослідження, обмежити обсяг хірургічного втручання. Джерела інформації: 1. А.с. 1347016 СССР. МКИ G 01 N 33/49. Способ исследования метаболизма миокарда/М.Т. Парашко (СССР).-5 с. 2. А.с. 1582993 СССР. G 01 N 33/68. Способ определения содержания креатинина, креатина и саркозина в биологических жидкостях/Л.М. Чебышев (СССР).-6 с. 3. Путилина Ф.Е., Зоидзе С.Д. Определение активности дегидрогеназ пентозофосфатного пути //Методы биохимических исследований (Липидный и энергетический обмен). - Учебное пособие /Под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - С. 168-172. 3 UA 75758 U 4. Bradford М.М. A rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Micrigram Quantities of Protein-Dye Binding// Analitical Biochemistry.-1976. - N 2. - P. 248-254. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб оцінки рівня енергетичного метаболізму міокарда шляхом дослідження біохімічних властивостей тканини міокарда in vivo, що включає спектрофотометричну реєстрацію утворення відновленої форми нікотинаміддинуклеотиду в інкубаційнійному середовищі, який відрізняється тим, що після гомогенізації зразка проводять паралельне визначення активності цитоплазматичної і мітохондріальної фракцій лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27), піруватдегідрогенази (КФ 1.2.4.1), НАД-залежної малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37), аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1), глюкозо-6фосфатдегідрогенази (КФ 1.1.1.49), 6-фосфоглюконатдегідрогенази (КФ 1.1.1.44), сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1), концентрації загального білка цитоплазми і мітохондрій, пірувату і малату, і за величиною показників активності ферментів оцінюють рівень метаболізму міокарда. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4