Спосіб санітарної оцінки токсичності морської рибної продукції з використанням біотест-об’єктів

Реферат: Спосіб санітарної оцінки токсичності морської рибної продукції з використанням біотест-об′єктів включає проведення токсикологічного дослідження шляхом оцінки впливу випробовуваної рибної продукції на індивідуальні лінії лабораторної культури гідробіонтів. Як біотест-об'єкт використовують молодь солонуватоводних галобіонтного рачка Artemia salina (L) і коловертки Brachionus plicatilus Muller. UA 77529 U (12) UA 77529 U UA 77529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до досліджень в галузях ветеринарної медицини, санітарної гігієни, біології, екології і може бути використана для проведення моніторингових досліджень для визначення якості морської рибної продукції. При моніторингових дослідженнях слід розглядати показники кожного компонента або сукупні взаємини, але можуть бути застосовані і альтернативні варіанти, хоч в співтоваристві дослідних робіт виділяють частіше той або ключовий компонент (біомоніторів, видбіоіндикаторів, тест-об'єктів), який доступний для досліджень і за станом якого можна стежити за середовищем проживання [7, 10]. Дослідження в вибраному форматі можуть служити основою для розробки систем управління раннього неблагополуччя (earlu warning system) морських об'єктів і своєчасного попередження існуючої небезпеки для людини [6, 9]. Відомий спосіб токсико-біологічної оцінки рибної продукції та визначення забруднюючих речовин. Для попередньої експрес-санітарнобіологічної оцінки гідробіонтів і визначення їх нешкідливості як тест організму використовують інфузорії Tetrahimena periformis. Метод заснований на посіві лабораторної культури вищеназваної інфузорії у флаконі і досліджуваними пробами м'яса риб і інших водних організмів. Середовищем розведення даного матеріалу служить 0,5 % розчин аптечної морської солі. Токсичність досліджуваних зразків визначають за наявності загиблих інфузорій, змінених форм, характеру їх. руху, пригнічення росту і розмноження, в порівнянні з контролем. Відсутність загибелі інфузорій та інших їх патологічних змін протягом 24 годин свідчать про відсутність токсичності м'яса риб [3]. Відомий спосіб визначення токсичних речовин у водних розчинах з використанням бактерій, що світяться для біотестування. Рівень біолюмінесценції в in vivo відображає загальну метаболічну активність клітини і залежить від їх чисельності. Велике число фізичних, хімічних і біологічних факторів, що впливають на зростання і дихання клітини, синтез білків і ліпідів, функціонування клітинних мембран і генів родини Luch впливають на бактеріальну біолюмінесценцію і можуть бути виміряні за допомогою її реєстрації. Рівень гострої токсичності виражається у вигляді концентрації речовини (для розчинів індивідуальних речовин) або розведення (для розчинів невідомого складу), які варіюють від 20 %, 50 % або 80 % зниження інтенсивності бактеріального світіння відносно до контролю [5]. Відомий спосіб визначення забруднюючих речовин у стічних водах методом біотестування. В основу дослідження покладено методику з проведення вищеназваного методу, в якому гостра токсичність води визначається за різницею між кількістю загиблих дафній в тестованій воді (досвід) і в воді, яка не містить токсичних речовин (контроль). Критерієм гострої токсичної або порогової токсичності є загибель 50 % і більше відсотків дафній у досліді порівняно з контролем протягом 96 годин [7]. Даний спосіб взятий як найближчий аналог. Відомий метод оцінки токсичного забруднення вод, водостоків і водойм різної солоності, а також зон змішування річкових і морських вод методом біотестування. Метод заснований на оцінці впливу випробовуваної природної води, відібраної з водойм і водостоків, на індивідуальні лінії лабораторних культур гідробіонтів. Як тест-об'єкт використовують молодь солоноватоводної коловертки Brachionus plicatilus Muller і галобіонтного рачка Artemia salina (L), отриманих з кладки яєць. Вплив випробовуваної проби оцінюють по зміні (у порівнянні з контролем) показника загибелі молоді гідробіонтів при різній експозиції в випробуваній пробі. Показником елімінації молоді служить кількість гідробіонтів, які загинули в випробуваній воді. Гостру, підгостру і хронічну токсичну дію випробовуваної проби встановлюють в ході одного експерименту. Гостру токсичну дію визначають за час експозиції - 24 години, підгостру - за 48-72 години, хронічну - 96 годин. Критерієм токсичності є збільшення загибелі молоді гідробіонтів на 25 % і більше відсотків у порівнянні з контролем. Задачею корисної моделі є розробка способу санітарної оцінки токсичності морської рибної продукції з використанням біотестів. Поставлена задача вирішується шляхом впливу випробовуваної морської продукції у водному середовищі на індивідуальні лінії лабораторної культури гідробіонтів молоді солоноватоводної коловертки Brachionus plicatilus Muller і галобіонтного рачка Artemia salina (L), отриманих з кладки яєць. Критерієм токсичності є загибель молоді гідробіонтів. Виділяють наступні стадії токсичності: гостра (через 24 години), напівгостра (48-72 години) і хронічна (96 годин). [4] Запропонований спосіб здійснюють наступним чином: Метод біотестування якості морської рибної продукції заснований на виявленні рівня загибелі лабораторних культур гідробіонтів. Як біотест-об'єктів використовують молодь 1 UA 77529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 солоноватоводної коловертки Brachionus plicatilis Muller і галобіонтного рачка Artemia salina (L), отриманих з кладки яєць [1, 2]. Вплив випробуваної проби рибної продукції у водному середовищі виявляє відмінності реакції молоді біотестів гідробіонтів. Гостру, підгостру і хронічну токсичну дію випробовуваної проби встановлюють в ході одного експерименту. Гостру токсичну дію визначають за час експозиції 24 години, підгостру - 48-72 години, хронічну - 96 годин. Критерієм токсичності є збільшення загибелі гідробіонтів на 25 % і більше порівняно з контролем. Середовище для розведення досліджуваного матеріалу: Для розведення досліджуваного матеріалу застосовують 0,5 % розчин аптечної морської солі рН 7-7,5. Приготований розчин розливають в колби по 150-200 мл і стерилізують в автоклаві при 0,5 атм. в межах 30 хвилин. Підготовка проб морської рибної продукції для дослідження: Відбір проб здійснюють з кожної партії риб. Для аналізу використовують в середньому по 10 примірників. Дослідженням піддають м'які тканини риб (150-200 г середньої проби) при цьому, відбирають по 15-20 г м'язової тканини. Взятий зразок кожного виду риб ретельно перемелюють на м'ясорубці, перемішують і гомогенізують. Потім відважують 5-10 г гомогенату в порцеляновій ступці і ретельно розтирають. Поміщають в холодильник і зберігають при температурі мінус (1015) °С до двох місяців. Аналогічним засобом проводять підготовку проб у інших гідробіонтів. При цьому від кожної досліджуваної партії відбирають, приблизно, 30 примірників крабів, рапанів, 50 примірників мідій, устриць і т.д. Методика проведення токсикологічних досліджень Токсикологічним дослідженням піддають як рибу, так і інші гідробіонти. В обов'язковому порядку проводять токсикологічні дослідження як в лабораторіях, так і на переробних підприємствах. При цьому з підготовлених проб рибної продукції беруть невеликі наважки по 50, 100 і 200 мг, які поміщають у флакони з 5 % розчином аптечної солі. Для молоді коловерток (вирощених в лабораторних умовах) додають 2-3 см розчину, а для молоді артемії, відповідно 10-20 см. Контролем для аналізу служать флакони, що містять тільки 5 % розчин кухонної солі і проби, наповнені нетоксичною рибною продукцією. Для проведення біотестування піпеткою відбирають коловерток і артемій по одній в кожний флакон. Випробування проводять в 4 повторах, тобто сорок гідробіонтів розташовують у 40 флаконах на кожну серію (дослід і контроль). Флакони залишають в приміщенні при природному освітленні, уникаючи прямих сонячних променів. На другу добу молодь годують, додаючи по краплі суспензії протокококових водоростей або розчин пекарських дріжджів. Реєстрація показника загибелі молоді гідробіонтів Облік показника загибелі молоді коловерток або молоді артемій проводять протягом 4 діб за допомогою мікроскопа, використовуючи збільшення кратне 10×10. Спостереження за загибеллю в першу добу проводять з інтервалом - 1, 3, 5, 24 годин, а в наступну добу 2 рази на день. Показником загибелі молоді є збереження нерухомості тест-об'єктів після барботування середовища бульбашками повітря капілярною піпеткою. Обробка результатів, розрахунки та оцінка токсичного забруднення Оцінку токсичного забруднення випробовуваної проби морської рибної продукції проводять за показником загибелі молоді. У випробовуваній пробі досліду і контролю результат розраховують за формулою: X=Nм/Nікc × 100 (1), де, X - показник загибелі молоді коловерток або артемій, % Nм - кількість молоді, що загинула в серії, екз. Nікс - вихідна кількість молоді в серії, екз. Збільшення загибелі молоді у дослідній серії в порівнянні з контролем розраховують за формулою: А=Xо-Xк (2) де, А - збільшення загибелі молоді, % Xo - показник загибелі молоді в досвіді, % Хк - показник загибелі молоді в контролі, % Збільшення показника загибелі молоді гідробіонтів в експериментальній серії в порівнянні з контролем на 25 % і більше свідчить про наявність токсичної дії випробовуваної рибної продукції. 2 UA 77529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оцінку токсичного забруднення проби рибної продукції проводять за характером токсичної дії (гостра, підгостра, хронічна) випробовуваної проби, що впливає на біотести і викликає відповідно загибель молоді в залежності від експозиції: - збільшення загибелі молоді гідробіонтів в порівнянні з контролем на 50 % і більше відсотків через 24 години після впливу, свідчить про гостру токсичну дію; - збільшення загибелі молоді гідробіонтів в порівнянні з контролем на 50 % і більше через 72 години після впливу, свідчить про підгостру токсичну дію випробовуваної проби рибної продукції; - збільшення загибелі взятої в експеримент молоді гідробіонтів на 50 % і більше через 96 годин після впливу, свідчить про хронічну дію випробовуваної проби рибної продукції. Якщо проба надає гостротоксичну дію в даній концентрації, то для цього проводять біотестування на серії розбавлень, при яких знижують токсичність в 2, 10, 50 і 100 разів. Метрологічна характеристика методу Діапазон збільшення загибелі молоді солоноватоводної коловертки Brachionus plicatilus Muller і молоді галобіонтного рачка Artemia salina (L) складає від 1 % до 100 %. Внутрішньолабораторна прецизійність - 25 %. Перевага способу санітарної оцінки токсичного забруднення морської рибної продукції з використанням біотестів солоноватоводної коловертки Brachionus plicatilus Muller і галобіонтного рачка Artemia salina (L), перед аналогічними методами з використанням вищих тварин полягає в наступному: - через більш високу інтенсивність обміну речовин коловертки і артемії швидше реагують, на шкідливі включення; - можлива одночасна постановка великої кількості проб; - простота, низька собівартість, компактність, професійна нешкідливість способу, можливість його використовувати там, де відсутні умови для проведення експерименту на вищих тваринах; Використання проведених експериментальних даних дає можливість протягом 12-24 годин зробити попередній висновок про наявність у м'ясі риб токсинів хімічного і біологічного походження. Вид і кількість виявлених токсичних речовин уточнюють за існуючими методиками. Спосіб з використанням біотестів дозволяє протягом трьох діб визначити біологічну цінність риби та інших гідробіонтів, що в сім разів швидше, ніж проведення досвіду на білих щурах. Таким чином, використання солоноватоводної коловертки і галобіонтного рачка артемії в токсико-біологічних дослідженнях є перспективним напрямком, особливо в рибній галузі сільського господарства, де найчастіше доводиться оперативно приймати рішення з питання про якість продукції та шляхи її реалізації, що дозволяє уникати існуючої небезпеки для здоров'я людини. Літературні джерела: 1. Бакаева, Е.Н. Экологобиологические основы жизнедеятельности коловраток /Е.Н. Бакаева, Е.Н. Макаров, Ростов-на-Дону: СКНЦ ВШ, - 1999. - 285 с. 2. Вехов Н.В. Особенности жизненного цикла Artemia Salinna (L) в мелких пересыхающих озерах (Черноморский заповедник и его окрестности Украина) /Н.В. Вехов, Т.П. Вехова // Экология. - 1994. - № 6. -Сс. 53-61. 3. Методика визначення гострої токсичності води та ракоподібних Daphnia magna straus // Зб. « Біотестування у природоохоронній практиці. - К.: Мінекобезпеки України, 1997. – С1 - 20. 4. Оценка токсического загрязнения вод водотоков и водоѐмов различной солѐности и зон смешания речных и морских вод методами биотестирования / Росгидрометр, Ростов-на-Дону, 2006. – 23 с. (Нормативный документ Росгидрометр. Рекомендации). 5. Пат. 24287 UA, МПК G01N 38/187 Кацев A.M., Абдуроманов Е.Р., Стародуб М.Ф. Заявитель и патентообладатель Крымский медицинский университет им. Георгиевского. - 2007 01375; Заявл. 09.02.2007; Опубл. 2,6.06.2007, Бюл. № 9 - 4 с. 6. Розанцев Э.Г. Биотестирование или биологическая оценка безопасности /Э.Г. Розанцев, Е.Г. Черемных // Экология и промышленность России. - 2003. - № 10. - С. 44-46. 7. Руднева И.И. Применение биомаркеров рыб для экотоксикологической диагностики водной среды / И.И. Руднева // Рыб. хоз-во. Укр. 2006. - № 1 - С. 20-30. 8. Токсико-биологическая оценка рыбы и других гидробионтов: методические рекомендации (микрометод) / Госагропром СССР – Белая церковь. 1987 - 20 с.- (Нормативные документы Госагропрома СССР. Методика). 9. Galloway Т. Biomarkers in environmental and human health risk assessment // Mar.Pollute. Bull. - 2006. - 53. - P. 579-590. 10. Bowen R.E., Depledge M.N. Rapid Assessment of Marine Pollution (RAMP) // Mar. Pollute. Bull. - 2006. - 53. - P. 631-639. 3 UA 77529 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб санітарної оцінки токсичності морської рибної продукції з використанням біотест-об′єктів, згідно з яким проводять токсикологічне дослідження шляхом оцінки впливу випробовуваної рибної продукції на індивідуальні лінії лабораторної культури гідробіонтів, який відрізняється тим, що як біотест-об'єкт використовують молодь солонуватоводних галобіонтного рачка Artemia salina (L) і коловертки Brachionus plicatilus Muller, отриманих з кладки яєць, а критерієм токсичності проби рибної продукції є загибель гідробіонтів з урахуванням тимчасового чинника в порівнянні з контролем, при цьому виділяють наступні стадії токсичності: гостра (через 24 години), напівгостра (48-72 години) і хронічна (96 годин), що відображають швидкість реакції біотестів на зовнішній вплив. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4