Спосіб оцінки токсичності дезінфікуючого препарату з використанням інфузорії тетрахімени піріформіс

Спосіб оцінки токсичності дезінфікуючого препарату з використанням інфузорії тетрахімени пі 3 вивчити на вищих тваринах. Тривалість дослідження складає 1 година. Найбільш близьким за технічною суттю до заявляемого способу є визначення токсичності води за допомогою інфузорії. Визначення токсичності води проводиться наступним чином [7,8]: 1. Принцип методу: за певний проміжок часу проходить гибель інфузорій в розчинах дезінфектанту, за рахунок чого можна визначити його токсичність. 2. Реактиви. 2.1. Пептон бактеріологічний. 2.2. Екстракт дрожей. 2.3. Вода дистильована. 2.4. Глюкоза (порошок). 3. Устаткування і апаратура. 3.1. Термостат. 3.2. Центрифуга лабораторна. 3.3. Автоклав. 3.4. Терези аналітичні. 3.5. Пробірки хімічні та центрифужні. 3.6. Колби. 3.7. Піпетки вимірювальні. 3.8. Пастерівські піпетки. 4. Матеріал для дослідження. Матеріалом для дослідження є розчини дезінфектанту. 5. Хід визначення. 5.1.Відібрані проби розливають по 2мл у флакони, потім додають в кожен по 0,04мл (одну краплю) 3-добової культури інфузорій, вирощених на лептонному середовищі. Кожну пробу води досліджують в трьох повторностях. Контролем при аналізі служать наступні флакони: - що містять тільки 0,56%-ный розчин аптечної морської солі; - що містять відстояну водопровідну воду; 5.2. Флакони ретельно струшують і поміщають в термостат при температурі +25°С, або залишають при кімнатній температурі (+18-25°С) на 24 години. Протягом доби флакони 3-4 рази струшують з метою аерації середовища. 5.3. Через 1, 4, 6, 24 години пастерівською піпеткою беруть краплю культури інфузорій і переглядають під мікроскопом. 5.4. Після попередній оцінки досліджуваної води проводять підрахунок кількість інфузорій в дослідних та контрольних пробах. Показником живильної цінності служить число (виражене у відсотках) інфузорій, що виросли за 3 дні, на дослідному зразку по відношенню до числа клітин, що виросли в контролі. Після попередньої оцінки зразків приступають до підрахунку кількості інфузорій в дослідних і контрольних пробах. Отримані результати порівнюють. Обчислюють відсоток росту, що визначає живильну цінність в порівнянні з контролем. Недоліком відомого способу є те, що він потребує досить значного часу для постановки реакції та аналізу отриманих результатів. Метою корисної моделі є розробка універсального та швидкого способу оцінки наявності чи відсутності токсичного впливу дезінфікуючих пре 51142 4 паратів на інфузорію та встановлення максимально допустимого рівня робочих розчинів дезінфектантів за показниками їх життєдіяльності. Поставлена задача вирішується тим, що після використання дезінфікуючого засобу контроль за рівнем токсичності на інфузорію здійснюється за допомогою процентної кількості їх виживших. Метод визначення токсичності заснований на встановленні відмінностей між кількістю інфузорій в дослідженій пробі та контрольній пробі. Критеріями токсичності є показники статистичне достовірного зниження росту чисельності інфузорій в досліді в порівнянні з контролем за 1 год. (гостра токсичність), а також швидкість ділення, фагоцитоз і поведінкові реакції (хемотаксис і фототаксис). Оцінка токсичності проводиться шляхом визначення функціональної активності і підрахунку простих в динаміці за допомогою оптичної техніки. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Як тест-об'єкт використовують лабораторну культуру інфузорію-тетрахімена піріформіс. Температурний оптимум 24-28°С, рН6,5-7,5. Температура приміщення 13-18°С. Для підтримки стандартних умов культивування користуються культурою в стаціонарній фазі росту. Для цього пересадку інфузорій і зміну середовища проводять при температурі 24°С один раз в тиждень, при 12°С і нижче - один раз в два тижні. При пересадці культури 1-2мл культурального середовища з великою кількістю інфузорій з верхньої частини пробірки переносять в нову пробірку, зі свіжим живильним середовищем (до 5 мл). Контролем служить рідка фаза (розчинник) в якій вноситься дезінфектант. Умова: нетоксичність рідкої фази. Культивують інфузорію в лептонному середовищі наступного складу, г: пептон - 2,0, глюкоза 0,5, дріжджовий екстракт - 0,1, хлористий натрій 3 0,1, вода - до 100см (рН7). Середовище розлива3 ли по 5см в пробірки скляні місткістю 25см3 з ватяно-марлевими корками, стерилізують при 0,5атм 30хв, охолоджували. У пробірки з підготовленим середовищем засівають по 0,1см3 суспензії культури з обов'язковим її бактеріологічним контролем на стерильність шляхом посіву на мясо-пептонний агар або бульйон. Після цього пересіяну культуру зберігають при кімнатній температурі в затіненому місці [8, 9, 10, 11] У дослідах використовують інфузорії 3-5 добової культури Tetrahymena pyriformis, які найбільш стійкі до дезінфектантів. Проведення дослідження Для швидкого визначення летальних концентрацій дезінфектанта краплю густої культури інфузорій (із заздалегідь певним середнім числом клітин) вносять до розчину дезінфектанта - вода живильне середовище (відповідно 200 міліграм 0,9мл - 0,9мл). Використовують 3-4 розведення. Визначають концентрацію, в якій за 0,01-1год. загинуло більше 50% інфузорій. Для гострого досліду в пробірках на 5мл готують ряд концетраций дезінфектанта що відрізняються на порядок (5-6) в трьох повторностях. До кожної з досліджених і ко 5 51142 нтрольних систем вносять капіляром по 20 інфузорій. Для цього весь об'єм рідкої фази (РФ) переносять на скло за допомогою капіляра (краплями) і прораховують в них число інфузорій. Потім з кожного флакона пастерівської піпеткою беруть по одній краплі культури на скло і переглядають під малим збільшенням мікроскопа. При цьому визначають наявність мертвих інфузорій, форму, величину, рухливість, густину росту. За наявності мертвих і деформованих інфузорій флакони бракують і дослідження повторюють. Реєстрацію тест-організмів виконують візуально мікроскопом, які повністю входили в поле зору мікроскопа при збільшені 2Х8. Кожні 5 хвилин ведуть рахунок інфузорій з постійною реєстрацією. Через 30-60хв. експозиції ведуть процентний підрахунок за формулою: n2 100 n n1 де: n2 - загальна кількість початкових інфузорій n1 - загальна кількість через 60хв. Ступінь токсичності Нетоксичний Слаботоксичний Токсичний Виживаємість інфузорій у % після посадки через 60хв. досліду (п) 100-81 80-50 49-50 Переваги методу з тест-организмом тетрахимена пириформис перед аналогічними методами та з використанням біотварин полягають в наступному: на тварину впливає лише той продукт, який їм спожитий; на тетрахімену - додаткове і надмірне її потребам кількість продукту, що впливає на інфузорію ззовні; із-за вищої інтенсивності обміну речовин тетрахімена швидше реагує на шкідливі включення; можлива одночасна постановка великої кількості проб; простота, низька вартість, компактність, професійна нешкідливість методу, можливість його використання там, де відсутні умови для проведення експерименту на біотваринах. Спосіб, який пропонуємо, забезпечує, в порівнянні з прототипом, скорочення часу на тестування, значне спрощення методичної та матеріальної бази аналізів. Крім того, використання даного показника розширило можливості застосування способу, оскільки динаміка показника інфузорії, який визначено в будь-якій хімічній рідині, може бути екстрапольована на всі клітини організму. Комп’ютерна верстка О. Рябко 6 Спосіб технологічно нескладний, вимагає обладнання вітчизняного виробництва і може бути використаний в роботі наукових і виробничих лабораторій ветеринарної медицини. Джерела інформації: 1. Беленький Н.Г. и др. Методические рекомендации по биологической оценке продуктов животноводства и кормов с использованием тесторганизма тетрахимена пириформис. М., 1977. 2. Рецкий М.И., Бузлама B.C., Шахов А.Г.. Значение антиоксидантного статуса в адаптивной гетерогенности и иммунологвческой резистентности животных /Мат.международной научно-практ. конф. Актуальные вопросы болезней молодняка в современных условиях 23-25 сент.2002 г.Воронеж. - С.33-36. 3. Степанова И.П., Дмитриева Л.М., Патюков А.Г. и др. Взаимосвязь между пероксидным окислением липидов, активностью антиоксидантной системы защиты и содержанием веществ низкой и средней молекулярной массы при интоксикации животных ацетальдегидом // С.-х. биология, 2004, №6. - С.16-19. 4. Способ диагностики эндогенной интоксикации / А.А. Тогайбаев, А.В. Кургузкин, И.В. Рикун, P.M. Карибджанова / Лаб. дело. - №9, 1988. - С.2224. 2. Цикуниб А.Д. Определение эндогенной интоксикации по токсикоурии с использованием Tetrachimena pyriformis / Клин. лаб. диагн. - 2001.№6. - С.50-52. Использование инфузории тетрахимены пириформис как тест-объекта при биологических исследованиях в сельском хозяйстве. Игнатьев А.Д., Шаблий В.Я. ВАСХНИЛ.- М.,1978. 52с. 5. Everhart L.P. Methods with Tetrahymena. In Methods in cell physiology, 1972, v.5, p.219-288. 6. Reynolds Н.. Wragg J. B. Effect of type of carbohydrate on growth and nitrogen utilization in cultures of Tetrahymena pyriformis. -Bacteriological proceedings, 1960, v.60, N40, p.A39. 7. Методические рекомендации. Микрометод токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов / П.В. Микитюк. Б.Ц. БЦСХИ им.Погребняка., К.-1987. 20с. 8. ТіngIе L.F. DavIat W.А. Сameron I.V. Sublethal cytotoxic effect of mercurie chloride on the ciliate Tetrahymena pyriformis.-Joumal protozoology, 1973. v.20, N2, p.301-304. 9. Hamana Koei, Koichi Iwai. Effects of steroid hormones on the growth of Tetrahymena. -Journal biochemistry (Tokjo), 1974, v.69, N3, p.463-469. 10. Виноходов Д.О. Токсикологическое исследование кормов с использованием инфузорий. Спб, 1995, 80с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601