Спосіб оцінки токсичності бактерицидних засобів з використанням первинних та перещеплювальних культур клітин

Спосіб оцінки токсичності бактерицидних засобів з використанням первинних та перещеплювальних культур клітин, що включає підтверджен 3 речовин: пошкодження клітинних мембран, порушення процесів метаболізму, порушення регуляції іонного складу і ділення клітин. Таким чином, використання перещеплювальних культур клітин в дослідженнях на токсичність є перспективним напрямком, особливо при розробці хімічних препаратів. Метод не вимагає дефіцитних дорогих реактивів і устаткування, дає зіставні результати з дослідженнями на вищих тваринах, а також дозволяє дати оцінку в тих випадках, коли їх неможливо вивчити на вищих тваринах. Найбільш близьким за технічною суттю до заявляємого способу є визначення інфекційної активності вірусу на культурах клітин по ступеню прояву цитопатичної дії вірусу ЦПД. Визначення інфекційної активності вірусу на культурах клітин здійснюють наступним чином: 1. Принцип методу: за певний проміжок часу після контакту клітини і вірусу взятого в двох, або 10-ти разових розведеннях спостерігають дегенерацію або повну загибель клітин в розведеннях вірусу в підтримуючому середовищі. Порівнюючи стан інфікованих вірусом клітин з неінфікованими клітинами контролю визначають ступінь інфекційної активності досліджуваного вірусу. 2. Матеріали і реактиви. 2.1 Первиннотрипсинізована або перещеплю вальна культура клітин. 2.2 Середовище живильне для культур клітин. 2.3 Мікропланшети для культур клітин, та для отримання розведень 24 - 96 лункові або пробірки. 2.4 СО2 - інкубатор в разі культивування культури на мікропланшеті. 2.5 Термостат при використанні для культивування пробірок. 2.6 Розчини версену і трипсину для відокремлення культури клітин від поверхні носія. 2.7 Досліджуваний матеріал (вірусна суспензія). 5. Хід визначення. 5.1 На культуральний мікропланшет висівають первиннотрипсинізовану або перещеплювальну культуру клітин відокремивши її від попереднього носія версен-трипсиновою сумішшю. 5.2 Проби вірусвмістної рідини розводять з двох або 10-ти кратним кроком в підтримуючим середовищем в лунках мікропланшету для титрування або пробірках. 5.3 Отримані розведення вірусу переносять з титрувального мікропланшету в мікропланшет з первиннотрипсинізованою або перещеплю вальною культурою клітин. 5.4 Залишають 4-8 лунок з підтримуючим середовищем без контакту з вірусом в якості негативного контролю. 5.5 На мікропланшеті ретельно розписують вид матеріалу і ступінь розведення в відповідності до виконання. 5.6 Ведуть спостереження за станом моношару культури клітин в кожній лунці мікропланшету в порівнянні з контрольними лунками (неінфікованими). 61200 4 5.7 Спостереження проводять до моменту дегенеративних змін в моно шарі культури клітин контролюю. 5.8 Отримані результати записують підраховують титр інфекційної активності і обробляють статистично. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Приготування розведень досліджуваного засобу. В стерильний гідрофобний мікро планшет(флакон) стерильно вносять підтримуюче середовище в об'ємах: 100 мкл/1 лунку планшету, 3 або 4 см в кожен флакон відповідно. Для достовірності дослідження кількість лунок планшету взятого для одного розведення дезінфікуючого засобу повинна бути не менше чотирьох. Розведення отримують шляхом послідовного перенесення одного розведення досліджуваного деззасобу в наступну лунку планшету (флакону). Таким чином при змішуванні однакових об'ємів засобу і підтримуючого середовища одержуємо двократні розведення досліджуємого засобу. Ступінь розведення досліджуваного препарату повинна відповідати заявленим параметрам активної дії в інструкції чи настанові або встановлюватись дослідником самостійно в випадку дослідження нового засобу чи вивчальної цілі досліджень. Нанесення отриманих розведень досліджуваного засобу на моношар клітин. Дослідними культурами є будь-які первиннотрипсинізовані або перещеплювальні клітинні культури. Первиннотрипсинізовані клітинні культури можуть бути отримані з будь-якої тканини тваринного походження, птахів, риб чи комах. Перещеплювальні клітинні культури отримують з кріобанків клітинних культур (під час тривалого зберігання), а також самостійно за спеціальними методиками. Незалежно від виду клітинної культури взятої в дослід по виявленню токсичної дії дезінфектантів, існує ряд вимог котрі є обов'язкові, до виконання, для отримання достовірних результатів: 1. Культура клітин повинна мати характерний для неї вигляд (без зміни геометричної структури клітини і моношару в цілому). 2. Під час, та не менше трьох пасажів до початку досліджень не можна змінювати будь-які з компонентів, що входять до складу ростових поживних середовищ. 3. Всі дослідження необхідно проводити на культурі клітин отриманій з одного і того ж самого носія (матрасу, флакону, тощо). 4. Недопустимим є перевірка одночасно двох перемінних в одному досліді. 5. При використанні перещеплювальних ліній клітинних культур безпосередньо з кріобанку в дослідження беруть клітини не раніше третього пасажу після їх розморозки, враховуючи факт стабільності клітинної культури протягом всіх попередніх пасажів. Методика висіву культур клітин на носії (матраси, флакони, пробірки, планшети) для використання в дослідах. 5 Для вирощування культур клітин використовують поживні середовища індивідуально для окремо взятої культури. До складу ростового поживного середовища входить сироватка крові тварин. Частіше в практиці використовують сироватку ВРХ, та може підійти будь-якої тварини з задовільними характеристиками. Сироватка крові повинна бути відібрана від клінічно здорових тварин, не бути токсичною для культур клітин і бути стерильною. Перед її використанням для культур клітин будь-яку сироватку обов'язково прогрівають на водяній бані при 56 °С - 30 хвилин. Зазвичай перещеплювальні клітинні культури вже адаптовані до стандартних середовищ. Первиннотрипсинізовані клітинні культури як правило на початкових пасажах використання не потребують конкретно описаних поживних середовищ і є мало вибагливими до насиченості їх складовими. Та слід враховувати, що хоча більшість перещеплювальних культур клітин є здатними до адаптації до простіших за складом (амінокислотному набору) речовин середовищ, адаптація все ж змінює характеристики кожної культури. Тому після пере адаптування культури необхідним є відстеження можливих змін в процесі культивування такої культури. Оптимальним є використання в експериментах культур клітин які культивували на середовищах і сироватках однієї серії протягом не менше 5-ти послідовних пасажів. Для проведення випробувань, визначення ступеню токсичності бактерицидних засобів (дезінфектантів) на первинних та перещеплювальних культурах клітин на лункових мікропланшетах або інших носіях необхідно: 1. Первиннотрипсинізована або перещеплювальна культура клітин з повністю сформованим моношаром. 1.1. При використанні культури вирощеної на мікропланшеті достатньо одного мікропланшету з кількістю лунок 24 та більше. В варіанті використання пробірок або культуральних матрасів їх кількість не менш 22-24 (рекомендовано для вищої достовірності). 2. Для інкубування культури в мікропланшетах, чашках Петрі та аналогічних носіях обовязковим є СО2 інкубатор (або аналог пристосована камера). 3. Термостат з режимом підтримання температури 37 °С. 4. Поживні середовища для вирощування культур клітин в відповідності (до кожної культури індивідуально для перещеплювальних культур клітин). 5. Сироватка ВРХ або інших тварин не токсична по відношенню до культури клітин з відомими ростовими властивостями на обраній культурі клітин. 6. Розчини трипсину, версену - стандартні. 7. Лабораторний простерилізований посуд: піпетки, чашки Петрі, мірні склянки. Методика визначення ступеню токсичності бактерицидних засобів на культурах клітин. 1. Висів культури клітин на носій: матрас чашку Петрі, мікропланшет та ін. 2. Інкубування культури клітин до стадії повного формування моношару. 61200 6 3. Розведення бактерицидного засобу (дезінфектанту) до зазначених в настанові по його використанню концентраціях та концентраціях які в 2-3 рази нижчі та вищі від рекомендованих. 4. Наприклад: в інструкції по використанню вказана концентрація для використання дезрозчину 4 %, це означає, що для дослідження токсичності будемо досліджувати концентрації 1%, 2 %, 4 %, 8 %, 16 %. 5. Отримані розведення вносять безпосередньо на культуру клітин в не менше як 4-разовій повторності (4-лунки мікроплпншету, або 4 матрасики під одне розведення деззасобу в кількості що повністю покриє моношар). 6. Залишають не менш 4-х лунок або інших носіїв в які замість досліджуваного деззасобу вносять таку ж кількість стерильного фізрозчину або солевого буферу з рН 7-7,2 аналогічним чином. 7. Витримують культуру під розведеннями деззасобу при контакті протягом 10-15 хвилин (час зазначений в настанові по використанню за який засіб здійснює дезинфікуючу дію)при температурі (18-20) °С. 8. По завершенню контакту бактерицидного засобу з поверхнею моношару культури клітин деззасіб повністю видаляють. 9. Моношар 3-4 рази ополіскують буферним розчином або живильним середовищем без сироватки, кожен раз кількістю не меншою від 1/4 об'єму живильного середовища, яке використовували для культивування культури клітин на даному носієві. 10. В усі ємності з культурою клітин після повного відмивання вносять живильне середовище з 2 % сироватки крові тварин, тієї ж серії яку використовували для вирощування взятої в дослід культури клітин. 11. За культурою клітин встановлюють щодобове 2-разове спостереження методом мікроскопування. 12. Оцінювання ступеню токсичності проводять візуально або з допомогою кіновідоотехніки порівнюючи стан монашару культури клітин обробленої різними концентраціями бактерицидного засобу, з контролем клітинної культури - (культурою не обробленою бактерицидним засобом). 13. Спостереження проводять до початку дегенеративних змін в контролі клітинної культури але не більш як 5-діб. 14. Результати фіксують зручним для дослідника способом, знімають на відео, фотографують. 15. При отримані сумнівних результатів під час оцінювання якості моношару та ступеню впливу на нього засобу проводять додаткове тестування культури використаної в експерименті. Переваги методу з первинними та перещеплювальними культурами клітин перед аналогічними методами в наступному: - заміна живої істоти (тварина) на досить близьку біологічну модель - культуру клітин; - перещеплювальну культуру клітин легко можна отримати з курячого ембріону або будь-якого донорського матеріалу, а також підняти з глибокої заморозки банку культур клітин; 7 61200 - простота постановки експериментального дослідження; - порівняно дешевий для виконання досліджень з іншими методами; - значно знижена вірогідність неспецифічних проявів при врахуванні одержаних результатів пов'язана з високою однорідністю колонії клітин первинної або перещеплю вальної культури, на відміну від популяції лабораторних тварин або мікроорганізмів; - наглядність методу і його легке зчитування, яке не потребує високої кваліфікації спеціаліста виконавця. Бібліографічні дані 1. Биотехнология клеток животных в 2 т. Под ред. Спиера Р.Е., Гриффитса Дж.Б: пер. с англ. Москва: ВО «Агропромиздат», том 1, - 1989. – 368С. 2. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. Под редакцией Г.П. Пинаева: Ленинград. - "Наука". - 1988 - 320 с. 3. Методы генетики соматических клеток. Под редакцией Дж. Шея: в двух томах, - том 1. Пер. с англ. - Москва. - Мир. 1985. - 312 с. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 8 4. Сергеев В.А. Структура и биология вирусов животных. // В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянский. Москва, 1983. - С. 41-43. 5. Степанова И.П., Дмитриева Л.М., Патюков А.Г. и др. Взаимосвязь между пероксидным окислением липидов, активностью антиоксидантной системы защиты и содержанием веществ низкой и средней молекулярной массы при интоксикации животных ацетальдегидом // С.-х. биология, 2004, № 6. - С. 16-19. 6. Способ диагностики эндогенной интоксикации / А.А.Тогайбаев, А.В. Кургузкин, И.В. Рикун, P.M. Карибджанова / Лаб. дело. - № 9, 1988. -С. 22-24. 2. Цикуниб А.Д. Определение эндогенной интоксикации по токсикоурии с использованием Tetrachimena pyriformis / Клин. лаб. диагн. 2001.№ 6.- С. 50-52. Использование инфузории тетрахимены пириформис как тест-объекта при биологических исследованиях в сельском хозяйстве. Игнатьев А. Д. Шаблий В.Я. ВАСХНИЛ.- М.,1978. 52 с. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601