Спосіб детектування вільних радикалів

Реферат: Спосіб детектування вільних радикалів шляхом флуоресцентного визначення інтенсивності індукованого перекісного окислення ліпідів в тканинних екстрактах та суспензіях мембран. Як індикатор присутності вільнорадикальних реакцій використовують сквараїновий барвник SQ-1, а детектування вільних радикалів проводять за порівнянням кінетичних профілів гасіння флуоресценції барвника у відсутності та присутності прооксидантів. UA 80912 U (54) СПОСІБ ДЕТЕКТУВАННЯ ВІЛЬНИХ РАДИКАЛІВ UA 80912 U UA 80912 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біомедицини і може бути використана для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в екстрактах тканин та клітинних мембранах методом флуоресцентної спектроскопії. Біологічні мембрани є одним з ключових структурних елементів клітин, який обумовлює коректне функціонування організму. Порушення структури біомембран є не тільки результатом, але й у багатьох випадках першоосновою патологічних змін у клітині, тканині та організмі в цілому. Визначальну роль у модифікації фізико-хімічних властивостей мембран, що призводять до патології, відіграють процеси перекисного окислення ліпідів - окислювальна деградація ліпідів, яка супроводжується появою вільних радикалів. Саме в утворенні вільних радикалів або активних форм кисню (АФК), які пошкоджують молекули білків, ліпідів та нуклеїнових кислот, полягає головна причина виникнення клітинних дефектів [1]. Загальновизнаною є ідея про те, що ПОЛ призводить до порушення молекулярної організації ліпідного бішару, що викликає ушкодження мембранозв'язаних білків. Зокрема, було показано, що ПОЛ викликає інактивацію мембранних рецепторів та таких ферментів, як, наприклад, глюкозо-6-фосфатаза та Na/KАТФаза, яка приймає безпосередню участь у підтримці іонного гомеостазу клітини. Окрім цього, наслідком ушкодження ліпідного матриксу під дією ПОЛ є втрата енергетичного потенціалу мембрани, зміни її електричних властивостей та бар'єрної функції, тощо [2]. Усе це врешті решт призводить до патологічних процесів, що можуть спричиняти загибель клітин. З перекисним окисненням ліпідів безпосередньо пов'язане й окислення білків та утворення білкових агрегатів у кришталику ока, яке закінчується його помутнінням та розвитком катаракти. Зважаючи на визначну роль ПОЛ у патології клітин, своєчасна детекція цього процесу є запорукою його попередження та успішної ліквідації наслідків вільнорадикальних реакцій. Для ідентифікації продуктів перекисного окислення ліпідів використовується низка біохімічних та біофізичних методів. Відомий спосіб визначення активності ПОЛ, заснований на використанні антиоксидантного ферменту супероксиддисмутази (СОД), що каталізує дисмутацію супероксиду в кисень та перекис водню [3]. Недоліком цього методу є можливість розвитку алергічних реакцій при застосуванні СОД in vivo внаслідок білкової природи ферменту. Відомий спосіб детекції ПОЛ, що базується на аналізі реакції досліджуваної системи з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [4]. Зразок нагрівають з ТБА при кислому рН та вимірюють спектроскопічні параметри (поглинання або інтенсивність флуоресценції) продукту цієї реакції малонового альдегіду. Недоліком цього способу є той факт, що він дає хибнопозитивні оцінки при дослідженні in vivo внаслідок його неспецифічності. Відомий прямий спосіб детекції АФК з використанням електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) [5]. Аналіз амплітуди та форми спектрів ЕПР дозволяє отримати докази існування неспарених електронів у досліджуваній системі, визначати їх концентрацію, а іноді й встановити хімічну структуру радикалів. Однак цьому методу бракує чутливості та часового розділення. До того ж, поглинання води суттєво спотворює спектри ЕПР. Відомий також спосіб дослідження вільних радикалів на основі реєстрації спонтанної хемілюмінесценції [6]. В його основі лежить ефект випромінювання квантів світла в результаті взаємодії радикалів. Інтенсивність випромінювання пропорційна швидкості реакції, у якій радикали беруть участь, що дозволяє визначити їх концентрацію. Недоліком цього методу є неможливість детектування великих концентрацій аналіту та високий фоновий сигнал. Відомий також спосіб ідентифікації АФК за допомогою флуоресцентних зондів, до числа яких належать, зокрема, похідні флуоресцеїну та родаміну [7], координаційні комплекси європію [8] та флуорофори на основі фосфіну [9]. Хоча використання цих молекул-репортерів є доволі успішним при дослідженні різнихтипів вільних радикалів, усі вони мають один суттєвий недолік - ці зонди поглинають та випромінюють на довжині хвилі