Аналоги глюкагону

Реферат: Винахід забезпечує сполуки та способи стимуляції зниження ваги або запобігання збільшенню ваги, у тому числі при лікуванні цукрового діабету, метаболічного синдрому й асоційованих захворювань. Зокрема, винахід належить до нових пептидів-аналогів глюкагону, ефективних у таких способах. UA 104605 C2 (12) UA 104605 C2 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід відноситься до аналогів глюкагону та їх застосування в медицині, наприклад при лікуванні надлишкового споживання їжі, ожиріння й зайвої ваги. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Препроглюкагон являє собою пептид-попередник із 158 амінокислот, який піддається диференціальному процесингу у тканинах з утворенням ряду структурно схожих похідних від проглюкагону пептидів, у тому числі глюкагону (Glu), глюкагон-подібного пептиду 1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), глюкагон-подібного пептиду 2 (GLP-2), і оксинтомодуліну (OXM). Ці молекули залучені в різні фізіологічні процеси, що включають підтримку гомеостазу глюкози, секрецію інсуліну, спорожнювання шлунку й ріст кишечника, а також регуляцію споживання їжі. Глюкагон являє собою пептид з 29 амінокислот, що відповідає амінокислотам 53-81 препроглюкагону, і має послідовність His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-LeuAsp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1). Оксинтомодулін (OXM) являє собою пептид з 37 амінокислот, що включає повнорозмірну послідовність глюкагону з 29 амінокислот з додатковим карбоксиконцевим октапептидом (амінокислоти 82-89 препроглюкагону, що мають послідовність Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO: 2) і відомі як «проміжний пептид 1» (intervening peptide 1, IP-1); таким чином, повнорозмірна послідовність оксинтомодуліну людини являє собою His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-TyrSer-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-ArgAsn-Asn-Ile-Ala) (SEQ ID NO: 3). Основний біологічно активний фрагмент GLP-1 утворюється у виді пептиду з 30 амінокислот, амідованого по C-кінцю, який відповідає амінокислотам 98-127 препроглюкагону. Глюкагон сприяє підтримці рівня глюкози в крові шляхом зв'язування з рецепторами глюкагону на поверхні гепатоцитів, у результаті чого в печінці за допомогою глікогенолізу вивільняється глюкоза, що запасається у формі глікогену. При виснаженні запасів глікогену, глюкагон стимулює в печінці синтез глюкози за допомогою глюконеогенезу. Глюкоза надходить у кровоток, запобігаючи розвитку гіпоглікемії. OXM викидається в кров у відповідь на прийом їжі, пропорційно калорійності їжі. Показано, що OXM придушує апетит і споживання їжі у людини (Cohen et al, Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, 4696-4701, 2003; WO 2003/022304). На додаток до таких аноректичних ефектів, аналогічним дії GLP-1, OXM також, імовірно, регулюється вага тіла за допомогою іншого механізму, оскільки пацюки, що одержували оксинтомодулін, демонстрували менше збільшення маси тіла, ніж група пацюків, яких однаково годували (Bloom, Endocrinology 2004, 145, 2687). Лікування страждаючих ожирінням гризунів за допомогою OXM також підвищує їх толерантність до глюкози (Parlevliet et al, Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E142-7, 2008) і знижує збільшення маси тіла (WO 2003/022304). OXM активує і рецептор глюкагону і рецептор GLP-1, при цьому є у два рази більш ефективним відносно рецепторів глюкагону, ніж до рецепторів GLP-1, але менш ефективним, ніж нативний глюкагон й GLP-1 відносно їх відповідних рецепторів. Глюкагон також здатний активувати обидва рецептори, хоча й з більшою перевагою до рецептора глюкагону, ніж до рецептора GLP-1. З іншого боку, GLP-1 не здатний активувати рецептор глюкагону. Механізм дії оксинтомодуліну не до кінця досліджений. Зокрема, невідомо, чи опосередковується дія цього гормону винятково через рецептор глюкагону й рецептор GLP-1, або ж через один або декілька поки ще невідомих рецепторів. Відомі інші пептиди, що зв'язуються як з рецептором глюкагону, так і з рецептором GLP-1 й такі, що активують їх (Hjort et al, Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124,1994), і сприяють зниженню збільшення ваги тіла й зменшенню споживання їжі (WO 2006 / 134340, WO 2007/100535, WO 2008/101017). Ожиріння, що являє собою глобально наростаючу проблему здоров'я людини, асоційоване з різними захворюваннями, зокрема, із серцевосудинними захворюваннями (ССЗ), цукровим діабетом 2 типу, синдромом обструктивного апное сну, деякими видами раку й остеоартритом. Як наслідок, ожиріння призводить до зниження тривалості життя. За прогнозами 2005 року від Всесвітньої організації охорони здоров'я у всьому світі 400 мільйонів дорослих (у віці старше 15 років) страждають ожирінням. У цей час у США ожиріння вважається другою після паління провідною причиною попереджуваної смертності. Поширення ожиріння викликає збільшення захворюваності діабетом, і близько 90% людей, що страждають діабетом 2 типу, можна розглядати як таких, що страждають ожирінням. У світі 246 мільйонів чоловік страждають діабетом, а до 2025 року, за оцінками, число хворих діабетом складе 380 мільйонів. У багатьох хворих є додаткові фактори ризику розвитку серцевосудинних захворювань, у тому числі високий вміст або аберантні форми ЛПНП і тригліцеридів та низький рівень ЛПВП. 1 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Люди із цукровим діабетом в 2-4 рази більш схильні до розвитку серцевосудинних захворювань, ніж люди, які не страждають діабетом, що робить їх найбільш частим ускладненням цукрового діабету. На серцевосудинні захворювання доводиться близько 50% смертності серед людей, які страждають діабетом. У молодих людей, які страждають діабетом, ішемічна хвороба серця (ІХС) розвивається в 12-40 раз частіше, ніж у молодих людей, які не страждають діабетом; поряд з високою захворюваністю й поширеністю ожиріння й цукрового діабету 2 типу, відсоток смертності й летальності, пов'язаний із цими порушеннями обміну речовин, підкреслює медичну потребу в ефективних способах їх лікування. Таким чином, існує сильно виражена медична потреба в лікуванні ожиріння й у підвищенні толерантності до глюкози. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ 1 2 У першому аспекті даний винахід забезпечує сполуку, що має формулу R -X-Z-R , де 1 2 R являє собою Н, C 1-4 алкіл, ацетил, форміл, бензоіл або трифторацетил; R являє собою ОН або NH2; X являє собою пептид, що має формулу I: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-SerLys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Ala-Ala-His-Asp-PheVal-Glu-Trp- Leu-Leu-Arg-Ala (SEQ ID NO: 4) або відрізняється від формули I не більше, ніж у чотирьох з наступних положень, при цьому, якщо є присутньою відмінність від формули I: залишок у положенні 2 обраний з: Aib, D-Ser; залишок у положенні 12 обраний з: Leu, Arg, Dpu, Dpr, Orn; залишок у положенні 16 обраний з: Arg, His, Lys, Glu, Asp; залишок у положенні 17 обраний з: Arg, Leu, Dpu, Dpr, Orn; залишок у положенні 18 обраний з: Arg, Lys, His, Ser, Tyr; залишок у положенні 20 обраний з: Gln, Lys, Arg, Glu, Asp; залишок у положенні 21 являє собою Glu; залишок у положенні 24 обраний з: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg, Asp; залишок у положенні 27 обраний з: Met, Cys, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 28 обраний з: Asn, Ser, Lys, Glu, Ala, Leu, Asp, і залишок у положенні 29 обраний з: Thr, Glu, Lys; і Z відсутній або являє собою послідовність пептиду з 1-20 амінокислотних одиниць, обрану із групи, що включає Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr й Orn; або фармацевтично прийнятну сіль зазначеної сполуки. У деяких варіантах реалізації першого аспекту даного винаходу X може відрізнятися від формули I не більше, ніж у чотирьох з наступних положень, при цьому, якщо є присутньою відмінність від формули I: залишок у положенні 2 обраний з: Aib, D-Ser; залишок у положенні 16 обраний з: Arg, His, Lys, Glu; залишок у положенні 17 обраний з: Arg, Leu; залишок у положенні 18 обраний з: Arg, Lys, His, Ser, Tyr; залишок у положенні 20 обраний з: Gln, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 24 обраний з: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg; залишок у положенні 27 обраний з: Met, Cys, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 28 обраний з: Asn, Ser, Lys, Glu, Ala, Leu, і залишок у положенні 29 обраний з: Thr, Glu, Lys. У деяких варіантах першого аспекту даного винаходу X може відрізнятися від формули I не більше, ніж у чотирьох з наступних положень, при цьому, якщо є присутньою відмінність від формули I: залишок у положенні 2 обраний з: Aib, D-Ser; залишок у положенні 16 обраний з: Arg, His, Lys, Glu, Gly; залишок у положенні 24 обраний з: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg; залишок в положенні 27 обраний з: Met, Cys, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 28 обраний з: Asn, Ser, Lys, Glu, Ala, Leu, і залишок у положенні 29 обраний з: Thr, Glu, Lys. Без протиріччя визначенням першого аспекту, викладеного вище, може бути бажано, щоб X включав одну або більше з наступних комбінацій залишків: 17-Lys, 18-Ala, 17-Leu, 18-Ala; 17-Lys, 18-Ala, 20-His; 17-Leu, 18-Ala, 20-His; 17-Lys, 18-Ala, 24-Glu; 17-Leu, 18-Ala, 24-Glu; 2 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17-Lys, 18-Ala, 27-Leu; 17-Leu, 18-Ala, 27-Leu; 17-Lys, 18-Ala, 29-Ala; 17-Leu, 18-Ala, 29-Ala 17-Lys, 18-Ala, 27-Leu, 29-Ala; 17-Leu, 18-Ala, 27-Leu, 29-Ala; 17-Lys, 18-Ala, 27-Leu, 28-Arg, 29-Ala; 17-Leu, 18-Ala, 27-Leu, 28-Arg, 29-Ala; 24-Glu, 28-Arg; 24-Glu, 28-Arg, 27-Leu; 24-Glu, Arg 28-27-Leu, 29-Ala; 27-Leu, 28-Arg, 29-Ala; 29-Ala; 20-Arg, 24-Arg, 27-Lys, 28-Leu; 17-Arg; 18-Arg; 20-Gln; 24-Gln; 27-Met, 28-Asn, 29-Thr, або 2 4-Lys та їх комбінації. Наприклад, X може мати послідовність: HSQGTFTSDYSKYLDSKAARDFVRWLKLA (SEQ ID NO: 5); HSQGTFTSDYSKYLDSRAAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 12); HSQGTFTSDYSKYLDSKRAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 13); HSQGTFTSDYSKYLDSKAAQDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 8); HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVQWLLRA (SEQ ID NO: 9); HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLMNT (SEQ ID NO: 10); HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVKWLLRA (SEQ ID NO: 11); H-DSer-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 6); H-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 7); HSQGTFTSDYSKYLDSKAAKDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 18); HSQGTFTSDYSKYLDKKAAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 19) або HSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 20). 1 2 У другому аспекті винахід забезпечує сполуку, що має формулу R -X-Z-R де 1 R являє собою Н, C 1-4 алкіл, ацетил, форміл, бензоіл або трифторацетил; 2 R являє собою ОН або NH2; X являє собою пептид, що має формулу I: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Ala-Ala-His-Asp-PheVal-Glu-Trp- Leu-Leu-Arg-Ala (SEQ ID NO: 4) або відрізняється від формули I не більше, ніж у п'ятьох з наступних положень, при цьому, якщо є присутньою відмінність від формули I: залишок у положенні 2 обраний з: Aib, D-Ser; залишок у положенні 16 обраний з: Arg, His, Lys, Glu; залишок у положенні 17, що являє собою: Arg, Leu, Dpu, Dpr, Orn; залишок у положенні 20 обраний з: Gln, Lys, Arg, Glu, Asp; залишок у положенні 21 являє собою Glu; залишок у положенні 24 обраний з: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg, Asp; залишок у положенні 27 обраний з: Met, Cys, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 28 обраний з: Asn, Ser, Lys, Glu, Ala, Leu, Asp, і залишок у положенні 29 обраний з: Thr, Glu, Lys; і Z відсутній або являє собою пептидну послідовність із 1-20 амінокислотних одиниць, обраних із групи, що включає Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr й Orn; або фармацевтично прийнятну сіль зазначеної сполуки. У деяких варіантах другого аспекту, X може відрізнятися від формули I не більше, ніж у п'ятьох з наступних положень, при цьому, якщо є присутньою відмінність від формули I: залишок у положенні 2 обраний з: Aib, D-Ser; залишок у положенні 16 обраний з: Arg, His, Lys, Glu, Gly; залишок у положенні 17 обраний з: Arg, Leu; залишок у положенні 18 обраний з: Arg, Lys, His, Ser, Tyr; залишок у положенні 20 обраний з: Gln, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 24 обраний з: Gln, Leu, Ala, Lys, Arg; залишок у положенні 27 обраний з: Met, Cys, Lys, Arg, Glu; залишок у положенні 28 обраний з: Asn, Ser, Lys, Glu, Ala, Leu, і 3 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 залишок у положенні 29 обраний з: Thr, Glu, Lys. Без протиріччя визначенню другого аспекту, викладеного вище, може бути бажано те, що X включає одну або більше з наступних комбінацій залишків: 20-Gln, 24-Gln, 27-Met, 28-Asn, 29-Thr, або 17-Leu, 20-Gln, 24-Gln, 28-Asn, 29-Thr. HSQGTFTSDYSKYLDSKAAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 15) або HSQGTFTSDYSKYLDSLAAQDFVQWLLNT (SEQ ID NO: 14). Даний винахід також забезпечує нуклеїнову кислоту (яка може являти собою ДНК або РНК), що кодує сполуку згідно із даним винаходом, експресійний вектор, що містить таку нуклеїнову кислоту, і клітину-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту або експресійний вектор. Ще в одному своєму аспекті даний винахід забезпечує композицію, що містить пептиданалог глюкагону, як визначено в даній заявці, або сіль або його похідне, нуклеїнову кислоту, що кодує такий пептид-аналог глюкагону, експресійний вектор, що містить таку нуклеїнову кислоту, або клітину-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту або експресійний вектор, у суміші з носієм. У переважних варіантах реалізації зазначена композиція являє собою фармацевтично прийнятну композицію, а зазначений носій являє собою фармацевтично прийнятний носій. Пептид-аналог глюкагону може являти собою фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль аналога глюкагону. Описані сполуки знаходять застосування для запобігання збільшенню ваги або для стимуляції зниження ваги. «Попередження» означає інгібування або зменшення набору ваги, у порівнянні з відсутністю лікування, і не обов'язково передбачається повне припинення збільшення ваги тіла. Пептиди згідно із даним винаходом можуть спричиняти зниження споживання їжі та/або збільшення витрати енергії, у результаті чого спостерігається вплив на вагу тіла. Незалежно від їх впливу на вагу тіла, сполуки згідно із даним винаходом можуть впливати на толерантність до глюкози й рівень циркулюючого холестерину, будучи здатними знижувати циркулюючі ЛПНП і підвищувати співвідношення ЛПВП/ЛПНП. Таким чином, сполуки згідно із даним винаходом можна застосовувати для прямої або непрямої терапії будь-якого патологічного стану, що викликаний або характеризується надлишковою масою тіла, наприклад, лікування та/або профілактики ожиріння, патологічного ожиріння, запального процесу, пов'язаного з ожирінням, захворювання жовчного міхура, пов'язаного з ожирінням, апное сну, індукованого ожирінням. Зазначені сполуки також можна застосовувати для лікування метаболічного синдрому, резистентності до інсуліну, порушення толерантності до глюкози, цукрового діабету 2-го типу, артеріальної гіпертензії, атерогенної дисліпідемії, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця або інсульту. Дія сполук згідно із даним винаходом при таких патологічних станах може бути результатом їх впливу або бути пов'язана з їх впливом на масу тіла, або може не залежати від нього. Таким чином, винахід передбачає застосування сполуки згідно із даним винаходом для лікування стану, як описано вище, в індивідів, які потребують такого лікування. Винахід також забезпечує сполуки згідно із даним винаходом для застосування в способі лікування, особливо для застосування в способі лікування стану, як описано вище. Винахід також забезпечує застосування сполуки згідно із даним винаходом з метою одержання лікарського засобу для лікування стану, як описано вище. Як уже було згадано, даний винахід поширюється на експресійні вектори, що містять описані вище послідовності нуклеїнових кислот, які можна комбінувати з послідовностями, що регулюють їх експресію, і клітини-хазяїни, що містять експресійні вектори. Переважно клітинихазяїни здатні експресувати і секретувати сполуки згідно із даним винаходом. У ще одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання сполук, що включає культивування зазначених клітин-хазяїнів в умовах, що підходять для експресії зазначеної сполуки, і очищення сполуки, одержаної таким чином. Винахід також забезпечує нуклеїнову кислоту згідно із даним винаходом, експресійний вектор відповідно до винаходу або клітину-хазяїна, здатну експресувати і секретувати сполуки згідно із даним винаходом, для застосування в способах лікування. Варто мати на увазі, що зазначені нуклеїнові кислоти, експресійний вектор і клітини-хазяїни можна застосовувати для лікування будь-якого з порушень, описаних у даній заявці, які можна лікувати за допомогою зазначених сполук. При згадуванні терапевтичної композиції, що містить сполуку згідно із даним винаходом, варіантів введення сполуки відповідно до винаходу або будь-якого терапевтичного застосування таких сполук також передбачається еквівалентне застосування нуклеїнових кислот, експресійного вектора або клітини-хазяїнина відповідно до винаходу, якщо з контексту не випливає інше. ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ 4 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 1. Вплив ZP2669 на толерантність до глюкози при оральному тесті у мишей db/db. У мишей Db/db, які не одержували корм протягом ночі, брали первинні зразки крові (рівень глюкози в крові натще) перед введенням (внутрічеревно) наповнювача або ZP2669 (45 нмоль/кг). Через п'ятнадцять хвилин мишам перорально вводили глюкозу (1 г/кг в 5 мл/кг), і вимірювали рівень глюкози в крові при t=30 хв, t=60 хв, t=120 хв й t=240 хв. Вимірювали різницю в порівнянні з базовим рівнем глюкози (t=0) для кожного моменту часу й визначали площу під кривою AUC0-240хв. ZP2669 значно збільшував толерантність до глюкози у мишей db/db, що страждають діабетом. Фігура 2. Вплив ZP2669 на споживання корму у мишей. Групи мишей, розділених відповідно до маси тіла, які не одержували корм протягом ночі, обробляли PYY3-36 (30 нмоль/кг) (внутрішній позитивний контроль), глюкагоном (500 нмоль/кг), ZP2669 (500 нмоль/кг) або наповнювачем. Через годину мишам давали попередньо зважений корм, і оцінювали споживання корму шляхом зважування корму, що залишився, після однієї години, і розраховували значення відносно маси тіла (мг їжі/г маси тіла). PYY (3-36) демонстрував аноректичний ефект, як й очікувалося на основі одержаних раніше результатів. ZP2669 (500 нмоль/кг) викликав значне скорочення споживання корму протягом першої години після ін'єкції пептиду. Глюкагон не впливав на споживання корму. Фігура 3. Вплив 28-денного лікування за допомогою ZP2669 на масу тіла у мишей з аліментарним ожирінням (DIO). Самців мишей C57Bl/6 утримували на дієті з високим вмістом жирів (HFD) і вводили їм (двічі на день, підшкірно) ZP2669 (500 нмоль/кг) або наповнювач. Контрольній групі мишей, що не страждають ожирінням, яких утримували на звичайному раціоні, вводили наповнювач (CHOW) відповідно до схеми, зазначеної для групи мишей DIO. Масу тіла вимірювали щодня, і з урахуванням маси тіла вводили мишам дози пептиду протягом всього дослідження. ZP2669 сповільнював додаток маси тіла на тому ж рівні, що й при утримуванні мишей на звичайному раціоні. Фігура 4. Вплив обробки подвійним агоністом GluGLP-1 мишей DIO протягом 4 тижнів (двічі на день) на концентрацію холестерину ЛПНП. Ефект OXM (р = 0,002) і ZP2669 (р = 0,0006) є статистично значимим, у порівнянні з наповнювачем. Фігура 5. Вплив обробки подвійним агоністом GluGLP-1 мишей DIO протягом 4 тижнів (двічі на день) на співвідношення ЛПВП/ЛПНП. Як наповнювач для OXM, ексендину-4 застосовували ФСБ (рН 7,4), як наповнювач для ZP2669 застосовували ацетат (рН 5,0). Ефект OXM (Р=0,2%) і ZP2669 (Р=0,05%) є статистично значимим, у порівнянні з наповнювачем. Фігура 6: Хімічна модифікація 17-Lys у сполуці ZP2872. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ У даному описі використовується стандартний однобуквений і трибуквений код для позначення природних амінокислот, а також загальноприйнятий трибуквений код для інших амінокислот, таких як Aib (α-аміноізомасляна кислота), Orn (орнітин), Dbu ( 2,4 діаміномасляна кислота) і Dpr (2,3-діаміно пропанова кислота). Термін «нативний глюкагон» відноситься до природного глюкагону людини, що має послідовність Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-ValGln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (SEQ ID NO: 1). Терміни «оксинтомодулін» й «OXM» відносяться до природного оксинтомодуліну людини, що має послідовність H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-ArgArg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO: 3). Винахід забезпечує сполуки, як визначено вище. Щоб уникнути неправильного тлумачення, у визначеннях, що приводяться у даній заявці, як правило, передбачається, що послідовність X відрізняється від формули I тільки за тими положеннями, для яких зазначено, що в них дозволені зміни. Передбачається, що амінокислоти в послідовності X пронумеровані послідовно з 1 по 29 у загальноприйнятому напрямку від N-кінця до С-кінця. При згадуванні «положення» у межах X передбачається відповідне положення в межах нативного глюкагону людини й інших молекул. Сполуки згідно із даним винаходом можуть містити один або більше внутрімолекулярний місток у пептидній послідовності X. Кожен такий місток утворюється між бічними ланцюгами двох амінокислотних залишків X, які, як правило, розділені трьома амінокислотами в лінійній послідовності X (тобто між амінокислотою A й амінокислотою A+4). Зокрема, місток може бути утворений між бічними ланцюгами залишків пари 12 й 16, 16 й 20, 17 й 21, 20 й 24, або 24 й 28. Два бічні ланцюги можуть бути з'єднані один з одним за допомогою іонних взаємодій або через ковалентні зв'язки. Таким чином, ці пари можуть 5 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 включати залишки протилежно заряджених бічних ланцюгів для формування сольового містка за допомогою іонних взаємодій. Наприклад, один із залишків може являти собою Glu або Asp, тоді як інший може являти собою Lys або Arg. Взаємодія пари Lys й Glu й Asp Lys може також реагувати на форму лактамного кільця. Крім того, Tyr й Glu або Tyr й Asp здатні утворювати лактонове кільце. Зокрема, залишки в положеннях 20 й 24 можуть формувати внутрімолекулярні містки. Приклади підходящих пар залишків у цих положеннях включають: 20-Asp, 24-Lys; 20-Glu, 24-Lys; 20-Asp, 24-Arg; 20-Glu, 24-Arg; 20-Lys, 24-Asp; 20-Arg, 24-Asp; 20-Lys, 24-Glu, а також 20-Arg, 24-Glu. Поза зв'язком з якою-небудь конкретною теорією, вважається, що такі внутрімолекулярні містки стабілізують альфа-спіральну структуру молекули й таким чином підвищують ефективність та/або селективність відносно рецепторів GLP-1 й, можливо, рецептора глюкагону. Заміна в положенні 12 (наприклад, Arg або Leu) може підвищувати ефективність та/або селективності відносно рецептора GLP-1. Наявність основних амінокислот (Arg, Lys або Его) у положенні 16 може підвищити розчинність молекули і її біодоступність. Виявлено, що залишки аргініну в положеннях 17 й 18 нативного глюкагону забезпечують значну селективність відносно рецептора глюкагону. Ряд замін в одному або більше із зазначених положень може збільшити ефективність та/або селективність відносно рецептора GLP-1 і рецептора глюкагону. Lys або Leu у положенні 17 може підвищити ефективність відносно рецептора глюкагону. Lys може бути особливо ефективним, особливо при наявності негативно зарядженого залишку (наприклад, Asp) у положенні 21, завдяки можливості утворення внутрімолекулярного містка. Гідрофобний або невеликий гідрофільний залишок (наприклад, Ala або Ser) у положенні 18 може підвищити ефективність відносно як до рецептора GLP-1, так і до рецептора глюкагону. Залишки в положеннях 27, 28 й 29 нативного глюкагону, як було показано, забезпечують значну селективність відносно рецептора глюкагону. Заміни за одним, двома або всіма трьома із цих положень у послідовності нативного глюкагону можуть збільшити ефективність та/або селективність відносно рецептора GLP-1 без істотного зниження ефективності відносно рецептора глюкагону. Конкретні приклади включають Leu у положенні 27, Arg у положенні 28 й Ala у положенні 29. 28-Arg може бути особливо переважним при наявності негативно зарядженої амінокислоти (наприклад, Glu) у положенні 24, з якою ОН може утворювати внутрімолекулярний місток, який може збільшувати вплив на ефективність відносно рецептора GLP-1. Заміна природного залишку Met у положенні 27 (наприклад, на Leu, Lys або Glu) також знижує можливість окислювання, таким чином збільшуючи хімічну стабільність сполук згідно із даним винаходом. Заміна природного залишку Asn у положенні 28 (наприклад, на Arg або Leu) також знижує ймовірність дезамідування в кислому розчині, таким чином збільшуючи хімічну стабільність сполук згідно із даним винаходом. Ефективність та/або селективність відносно рецептора GLP-1 також можна збільшити шляхом введення залишків, які можуть формувати амфіпатичну спіральну структуру, потенційно без значної втрати ефективності відносно рецептора глюкагону. Це може бути досягнуто шляхом введення заряджених залишків в одне або більше з положень 16, 20, 24 й 28. Таким чином, всі залишки в положеннях 24 й 28 можуть бути зарядженими, всі залишки в положеннях 20, 24 й 28 можуть бути зарядженими, або всі залишки в положеннях 16, 20, 24 й 28 можуть бути зарядженими. Наприклад, залишок у положенні 20 може являти собою His або Arg, зокрема His. Залишок у положенні 24 може являти собою Glu, Asp Lys або Arg, зокрема, Glu. Залишок у положенні 28 може являти собою Arg. Заміна одного або обох природних залишків Gln у положеннях 20 й 24 також знижує можливість дезамідування в кислому розчині, таким чином збільшуючи хімічну стабільність сполук згідно із даним винаходом. 6 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сполука згідно із даним винаходом може містити С-кінцеву пептидну послідовність Z з 1-20 амінокислот, наприклад, для стабілізації конформації та/або вторинної структури пептидуаналога глюкагону, та/або для забезпечення більшої стійкості до ферментативного гідролізу пептиду-аналога глюкагону, наприклад, як описано в WO99/46283. Якщо Z є присутнім, він являє собою пептидну послідовність із 1-20 амінокислотних залишків, наприклад, у діапазоні з 1-15, більш переважно в діапазоні з 1-10, зокрема, у діапазоні з 1-7 амінокислотних залишків, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 7 амінокислотних залишків, наприклад з 6 амінокислотних залишків. Кожен з амінокислотних залишків у пептидній послідовності Z може бути незалежно обраний з Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu (2,4 діаміномасляної кислоти), Dpr (2,3-діамінопропанової кислоти) і Orn (орнітину). Переважно, амінокислотні залишки обрані з Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr й Orn, більш переважно, тільки з Glu, Lys, і Cys. Вищезгадані амінокислоти можуть знаходитися або в D-, або в L-конфігурації, але переважно знаходяться в L-конфігурації. Особливо переважними послідовностями Z є послідовності із чотирьох, п'яти, шести або семи послідовних залишків лізину (тобто Lys3, Lys4, Lys5, Lys6 або Lys7), і особливо п'яти або шести послідовних залишків лізину. Інші приклади послідовностей Z наведені в WO 01/04156. Як альтернатива, С-кінцевий залишок послідовності Z може являти собою залишок Cys. Такий залишок може сприяти модифікації (наприклад, пегіліруванню) зазначеної сполуки. У таких варіантах реалізації довжина послідовність Z може, наприклад, становити тільки одну амінокислоту (тобто Z = Cys) або довжина може становити дві, три, чотири, п'ять, шість або навіть більше амінокислот. Інші амінокислоти, таким чином, служать спейсером між пептидом X і кінцевим залишком Cys. Пептидна послідовність Z має не більше 25% ідентичності по послідовності з відповідною послідовністю ділянки IP-1 OXM людини (який має послідовність Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-IleAla). «Відсоток (%) ідентичності послідовності амінокислот» даної пептидної або поліпептидної послідовності відносно іншої поліпептидної послідовності (наприклад, IP-1) розраховують як відсоток амінокислотних залишків у даній пептидній послідовності, які збігаються з відповідними амінокислотними залишками у відповідній послідовності зазначеного іншого поліпептиду при вирівнюванні двох послідовностей відносно одна одної при введенні пробілів для оптимального вирівнювання якщо буде потреба. Значення % ідентичності можуть бути визначені за допомогою WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). WU-BLAST2 використовує декілька параметрів пошуку, більшість із яких встановлені у виді значень за замовчуванням. Регульовані параметри встановлюють за допомогою наступних значень: інтервал перекривання = 1, частка перекривань = 0,125, поріг слова (T) = 11. Значення % ідентичності по послідовності амінокислот розраховують як декількість співпадаючих ідентичних залишків, визначених за допомогою WU-BLAST-2, ділене на загальну кількість залишків еталонної послідовності (при цьому пробіли, введені WU-BLAST-2 в еталонну послідовність з метою максимального рахунку вирівнювання, не враховують), помножене на 100. Таким чином, при оптимальному вирівнюванні Z з 8 амінокислотами з IP-1, ОН має не більше двох амінокислот, які ідентичні відповідним амінокислотам IP-1. Один або декілька бічних ланцюгів амінокислот у сполуки згідно із даним винаходом може бути кон’югований з ліпофільним замісником. Ліпофільний замісник може бути ковалентно пов'язаний з атомом бічного ланцюга амінокислоти, або, як альтернатива, може бути кон’югований з бічним ланцюгом амінокислоти за допомогою спейсера. Амінокислота може являти собою частину пептиду X або частину пептиду Z. Поза зв'язком з якою-небудь теорією вважається, що зазначений ліпофільний замісник зв'язує альбумін у кровотоку, таким чином екрануючи сполуку згідно із даним винаходом від ферментативної деградації, що може збільшувати період напівжиття сполук. Спейсер, якщо ОН присутній, застосовують, щоб забезпечити проміжок між сполукою і зазначеним ліпофільним замісником. Ліпофільний замісник може бути приєднаний до бічного ланцюга амінокислоти або спейсеру через складний ефір, сульфонільний ефір, тіоефір, амід або сульфаніламід. Відповідно, передбачається, що переважно ліпофільний замісник включає ацильну групу, сульфонільну групу, атом N, атом О або атом S, які є частиною складного ефіру, сульфонільного ефіру, тіоефіру, аміду або сульфаніламіду. Переважно, ацильна група в складі ліпофільного замісника утворює частину аміду або складного ефіру з бічним ланцюгом амінокислоти або спейсером. Ліпофільний замісник, може включати вуглеводневий ланцюг, що містить від 4 до 30 атомів вуглецю. Переважно, зазначений замісник містить щонайменше 8 або 12 атомів вуглецю, і переважно ОН містить 24 атоми вуглецю або менше, або 20 атомів вуглецю або менше. Вуглеводневий ланцюг може бути лінійним або розгалуженим, і може бути насиченим або 7 UA 104605 C2 5 ненасиченим. Передбачається, що вуглеводневий ланцюг переважно містить замісну групу, яка приєднана до бічного ланцюга амінокислоти або спейсера, наприклад ацильну групу, сульфонільну групу, атом N, атом О або атом S. Найбільш переважно, вуглеводневий ланцюг заміщений ацилом, і, відповідно, вуглеводневий ланцюг може бути частиною алканоільної групи, наприклад пальмітоілу, капроілу, лауроілу, міристоілу або стеароілу. Відповідно, ліпофільний замісник може мати формулу, представлену нижче: A 10 15 n «А» може являти собою, наприклад, ацильну групу, сульфонільну групу, NH, N-алкіл, атом О або атом S, переважно ацил. n − ціле число від 3 до 29, переважно щонайменше 7 або щонайменше 11, а більш переважно 23 або менше, більш переважно 19 або менше. Зазначений вуглеводневий ланцюг може містити додатковий замісник. Наприклад, вуглеводневий ланцюг може додатково містити до трьох замісників, обраних з NH 2, ОН і СООН. Якщо вуглеводневий ланцюг містить додатковий замісник, переважно він містить тільки один замісник. Як альтернатива або доповнення, вуглеводневий ланцюг може включати циклоалкан або гетероциклоалкан, наприклад, як показано нижче: N 20 25 30 Переважно циклоалкан або гетероциклоалкан являє собою шестичленне кільце. Найбільш переважно, ОН являє собою піперидин. Як альтернатива, ліпофільний замісник може містити в основі циклопентанофенантреновий остов, який може бути частково або повністю ненасиченим або насиченим. Кожен атом вуглецю в зазначеному скелеті може бути заміщений групою Me або ОН. Наприклад, ліпофільний замісник може являти собою холіл, дезоксихоліл або літохоліл. Як згадувався вище, ліпофільний замісник може бути кон’югований з бічним ланцюгом амінокислоти за допомогою спейсера. Якщо є присутнім, зазначений спейсер приєднаний до ліпофільного замісника й бічного ланцюга амінокислоти. Спейсер може бути приєднаний до ліпофільного замісника й бічного ланцюга амінокислоти, незалежно, за допомогою складного ефіру, сульфонільного ефіру, тіоефіру, аміду або сульфаніламіду. Відповідно, ОН може містити два фрагменти, незалежно обраних з ацилу, сульфонілу, атома N, атома O або атома S. Спейсер може мати формулу: B 35 40 45 50 N n D де В і D незалежно обрані з ацилу, сульфонілу, NH, N-алкілу, атома O або атома S, переважно з ацилу й NH. Переважно, n являє собою ціле число від 1 до 10, переважно від 1 до 5. Спейсер може бути додатково заміщений одним або більше замісником, обраним з алкілу C16, алкіламіну С0-6, алкілгідрокси C0-6 й алкілкарбокси С0-6. Як альтернатива, зазначений спейсер може містити дві або більше повторювані ланки, які мають зазначену вище формулу. B, D й n вибирають для кожної повторної ланки незалежним чином. Суміжні повторювані ланки можуть бути ковалентно зв'язані одна з одною через їх відповідні групи B й D. Наприклад, групи B й D із суміжних повторюваних ланок можуть у сукупності утворювати складний ефір, сульфонільний ефір, тіоефір, амід або сульфаніламід. Вільні ланки B й D з кожного кінця спейсера приєднані до бічного ланцюга амінокислоти й ліпофільного заміснику, як описано вище. Переважно, зазначений спейсер містить п'ять або менше, чотири або менше чи три або менше повторювані ланки. Найбільш переважно, спейсер містить дві повторювані ланки або одну ланку. Спейсер (або одна або більше повторювана ланка спейсера, якщо ОН містить повторювані ланки), може являти собою, наприклад, природну або неприродну амінокислоту. Передбачається, що для амінокислот, які мають функціоналізовані бічні ланцюги, В та/або D можуть являти собою фрагмент бічного ланцюга амінокислоти. Спейсер може бути будь-якою природною або неприродною амінокислотою. Наприклад, спейсер (або одна або більше повторювана ланка спейсера, якщо ОН містить повторювані ланки) може являти собою Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, Asp, Ser Thr, Gaba, 8 UA 104605 C2 5 10 Aib, β-Ala, 5-амінопентаноіл, 6-аміногексаноіл, 7-аміногептаноіл, 8-амінооктаноил, 9амінононаноіл або 10-амінодеканоіл. Наприклад, зазначений спейсер може являти собою одну амінокислоту, обрану з γ-Glu, Gaba, b-Ala й α-Gly. Ліпофільний замісник може бути кон’югований з бічним ланцюгом будь-якої з амінокислот сполук згідно із даним винаходом. Переважно, бічний ланцюг амінокислоти включає карбокси, гідрокси, тіол, амідні або аміногрупи для утворення складного ефіру, сульфонільного ефіру, тіоефіру, аміду або сульфаніламіду зі спейсером або ліпофільним замісником. Наприклад, ліпофільний замісник може бути кон’югований з Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys або Dbu, Dpr й Orn. Переважно, ліпофільний замісник кон’югований з Lys. Однак, будьяка амінокислота, позначена як Lys у формулах, наведених у даній заявці, може бути заміщена на Dbu, Dpr й Orn, при приєднанні ліпофільного замісника. Приклад ліпофільного замісника й спейсера представлений у наведеній нижче формулі: O N HO O O N N O 15 20 25 30 35 40 Тут, Lys із сполуки згідно із даним винаходом (наприклад, з X) ковалентно приєднаний до γGlu (спейсер) за допомогою амідної групи. Пальмітоіл ковалентно приєднаний до спейсеру γGlu за допомогою амідної групи. У конкретному варіанті реалізації даного винаходу, сполука включає або складається з пептиду X, що має послідовність: HSQGTFTSDYSKYLDSK(ізоGlu(пальмітоіл))AAHDFVEWLLRA (SEQ ID NO: 17). Як альтернатива або доповнення, один або більше бічний ланцюг амінокислоти в сполуці згідно із даним винаходом може бути кон’югований з полімерною групою, наприклад, з метою збільшення розчинності та/або періоду напівжиття in vivo (наприклад, у плазмі крові) та/або біодоступності. Також відомо, що така модифікація зменшує виведення з організму (наприклад, виведення через нирки) терапевтичних білків і пептидів. Полімерна група переважно розчинна у воді (є амфіфільною або гідрофільною), нетоксична й фармацевтично інертна. Підходящі полімерні групи включають поліетиленгліколь (ПЕГ), гомоабо сополімери ПЕЕ, монометил-заміщені полімери ПЕГ (МПЕГ), або поліоксиетилен гліцерол (ПОГ). Див., наприклад, Int. J. Hematology 68:1 (1998); Bioconjugate Chem. 6:150 (1995); and Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9:249 (1992). Інші підходящі полімерні групи включають поліамінокислоти, такі як полілізинову, поліаспарагінову кислоту й поліглутамінову кислоту (див., наприклад, Gombotz, et al. (1995) , Bioconjugate Chem. , vol. 6 : 332-351; Hudecz, et al. (1992) , Bioconjugate Chem. , vol. 3, 49-57; Tsukada, et al. (1984) , J. Natl. Cancer Inst., vol 73, : 721-729; і Pratesi, et al. (1985), Br. J. Cancer, vol. 52: 841-848). Полімерна група може бути лінійною або розгалуженою. Вона може мати молекулярну масу 500-40000 Да, наприклад 500-10000 Да, 1000-5000 Да, 10000-20000 Да, або 20000-40000 Да. Сполука згідно із даним винаходом може містити дві або більше таких групи, у цьому випадку сумарна молекулярна вага всіх таких груп, як правило, попадає в діапазони, зазначені вище. Полімерні групи можуть бути з'єднані (за допомогою ковалентного зв'язку) з аміно, карбоксильною або тіоловою групою бічного ланцюга амінокислоти. Переважними прикладами є тіолові групи залишків Cys й епсілон-аміногрупи залишків Lys, і також можна застосовувати карбоксильні групи залишків Asp й Glu. 9 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фахівцеві в даній галузі добре відомі відповідні способи, які можна застосовувати для реакції з’єднання. Наприклад, ПЕГ фрагмент, що несе метокси-групу може бути приєднаний до тіолової групи Cys за допомогою малеімідного зв'язку за допомогою регентів, комерційно доступних від Nektar Therapeutics AL. Більше детальну інформацію про підходящі хімічні групи див. також в WO 2008/101017 і джерелах, наведених вище. Синтез пептидів Сполуки згідно із даним винаходом можна одержати за допомогою стандартних способів синтезу, за допомогою рекомбінантних систем для експресії або будь-яким іншим способом, відомим у даній галузі техніки. Таким чином, аналоги глюкагону можуть бути синтезовані рядом способів, включаючи, наприклад, спосіб, що включає: (а) синтез пептиду твердофазним або рідкофазним способом, послідовно або шляхом з’єднання фрагментів, з наступним виділенням й очищенням кінцевого пептиду; (б) експресію генетичної конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, у клітині-хазяїні й виділення продукту експресії з культури клітин хазяїна, або (в), здійснення позаклітинної експресії in vitro генетичної конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, і виділення продукту експресії; або будь-яку комбінацію способів (а), (б), і (в) з одержанням фрагментів пептиду з наступним з’єднанням фрагментів для одержання пептиду, і виділення пептиду. Переважний синтез аналогів згідно із даним винаходом за допомогою твердофазного або рідкофазного синтезу пептидів. Цей аспект розглянутий в WO 98/11125 й, серед великої кількості інших джерел, “Principles and practice of solid-phase peptide synthesis”. In: Synthetic Peptides (2nd Edition) і Прикладах, наведених у даному документі. Для рекомбінантної експресії, фрагменти нуклеїнових кислот згідно із даним винаходом, як правило, поміщають у відповідні вектори для одержання векторів для клонування або експресійних векторів, що несуть фрагменти нуклеїнових кислот згідно із даним винаходом; такі нові вектори також є частиною даного винаходу. Вектори можуть, залежно від мети й типу призначення, являти собою плазміди, фаги, косміди, міні-хромосоми або віруси; крім того, чиста ДНК, яка тільки тимчасовим чином експресується в визначених клітинах, також являє собою важливий вектор. Переважні вектори для клонування або експресійні вектори (плазмідні вектори) згідно із даним винаходом здатні до автономної реплікації, тим самим забезпечуючи високу копійність для цілей високого рівня експресії або високого рівня реплікації для наступного клонування. Загалом, експресійний вектор містить у собі наступні особливості в напрямку 5'3', які функціональним чином з'єднані один з одним: промотор, керуючий експресією фрагмента нуклеїнової кислоти винаходу, при необхідності послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує лідерний пептид, що забезпечує секрецію (у позаклітинну фазу або, де це застосовано, у периплазму); фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує пептид згідно із даним винаходом, і, при необхідності послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує термінатор. Перераховані компоненти можуть містити в собі додаткові особливості, такі як селективні маркери й точки початку реплікації. При роботі з експресійним вектором у штамах-продуцентах або в клітинних лініях може бути переважно, щоб вектор був здатний інтегруватися в геном клітини-хазяїна. Фахівці, добре знайомі з відповідними векторами, здатні сконструювати вектори відповідно до їх специфічних вимог. Вектори згідно із даним винаходом застосовують для трансформації клітин-хазяїнів для одержання сполуки відповідно до винаходу. Такі трансформовані клітини, які також є частиною даного винаходу, можуть бути культивованими клітинами або клітинними лініями, використовуваними для розмноження фрагментів нуклеїнових кислот і векторів винаходу, або їх можна застосовувати для рекомбінантного одержання пептидів згідно із даним винаходом. Переважними трансформованими клітинами згідно із даним винаходом є мікроорганізми, такі як бактерії (наприклад, види роду Escherichia (наприклад, E. coli), Bacillus (наприклад,Bacillus subtilis), Salmonella або Mycobacterium (бажано непатогенні, наприклад, М. Bovis BCG), дріжджі (такі як, Saccharomyces cerevisiae) і найпростіші. Крім того, трансформовані клітини можуть бути одержані з багатоклітинного організму, тобто це можуть бути клітини грибів, комах, рослин або ссавців. Для цілей клонування та/або оптимізованої експресії переважно, щоб трансформована клітина була здатна до реплікації фрагмента нуклеїнових кислот винаходу. Клітини, що експресують фрагмент нуклеїнової кислоти, є корисним здійсненням винаходу; їх можна застосовувати для дрібномасштабної або великомасштабної продукції пептиду згідно із даним винаходом. 10 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 При виробництві пептиду згідно із даним винаходом за допомогою трансформованих клітин, зручно, хоча це й не є суттєвим, щоб продукт експресії секретувався в культуральне середовище. Ефективність Зв'язування відповідних сполук із рецепторами до GLP-1 або глюкагону (Glu) можна використовувати як індикатор агоністичної активності, але, у цілому, переважніше використовувати біологічний тест, який дозволяє оцінити внутрішньоклітинний шлях передачі сигналу, індукований зв'язуванням сполуки з відповідним рецептором. Наприклад, активація рецепторів глюкагону агоністом глюкагону стимулює утворення клітинного циклічного АМФ (цАМФ). Подібним чином, активація GLP-1 рецепторів агоністом GLP-1 стимулює утворення клітинного цАМФ. Таким чином, вироблення цАМФ у підходящих клітинах, що експресують один із цих двох рецепторів, можна використовувати для моніторингу активності відповідних рецепторів. Застосування підходящої пари типів клітин, кожен з яких експресує тільки один тип рецептора, відповідно, можна використовувати для визначення агоністичної активності відносно щодо обох типів рецепторів. Фахівцям відомі підходящі способи аналізу; а приклади наведені нижче. Рецептори до GLP1 та/або глюкагону можуть мати послідовності рецепторів, як описано в прикладах. Наприклад, у тестах можна використовувати рецептор до глюкагону людини (глюкагон-R), що має первинний реєстраційний номер, GI: 4503947 та/або рецептор до глюкагон-подібного пептиду 1 людини (GLP-1R), що має первинний реєстраційний номер GI: 166795283. (у випадках, де наведені послідовності білка- попередника, варто розуміти, що для аналізу необхідно використовувати зрілий білок, у якому відсутня сигнальна послідовність). Значення EC50 можна використовувати як чисельну міру агоністичної ефективності даного рецептора. Значення EC50 являє собою одиницю вимірювання концентрації сполуки, необхідної для досягнення половини максимальної активності сполуки в конкретному аналізі. Так, наприклад, сполука з EC50[GLP-1R] нижче, ніж EC50 [GLP-1R] нативного глюкагону, у конкретному аналізі може розглядатися як сполука з більш високою ефективністю зв'язування сGLP-1R, ніж глюкагон. Сполуки, описані в даній заявці, як правило, являють собою подвійні агоністи Glu-GLP-1, тобто вони здатні стимулювати утворення цАМФ при зв'язуванні як з рецептором глюкагону, так і з рецептором GLP-1. Стимулювання кожного рецептора можна виміряти в незалежних тестах, а потім порівняти одержані значення одне з одним. При порівнянні значення EC50 рецептора глюкагону (EC50 [Глюкагон-R]) зі значенням ЄС50 для рецептора GLP-1 (EC50 [GLP-1R]) для даної сполуки можна розрахувати відносну селективність глюкагону (в %) для даної сполуки як: Відносна селективність Глюкагон-R [сполука] = (1/EC50 [Глюкагон-R]) х100 / (1/EC50 [Глюкагон-R] + 1/EC50 [GLP-1R]) Відносну GLP-1R селективність також можна розрахувати як: Відносна GLP-1R селективність [сполука] = (1/EC50 [GLP-1R]) х100 / (1/EC50 [Глюкагон-R] + 1/EC50 [GLP-1R]) Відносна селективність сполуки дозволяє порівняти вплив на рецептор GLP-1 або глюкагону з його ефектом на інший рецептор. Наприклад, ніж більша відносна селективність сполуки відносно GLP-1, тим більш ефективна дана сполука відносно рецептора GLP-1, у порівнянні з рецептором до глюкагону. При використанні тестів, описаних нижче, ми виявили, що відносна селективність GLP-1 у порівнянні із глюкагоном людини становить приблизно 5%. Сполуки згідно із даним винаходом мають більш високу відносну селективність відносно GLP-1R, ніж глюкагон людини. Таким чином, при конкретному рівні агоністичної активності відносно рецептора глюкагону, сполука буде демонструвати більш високий рівень агоністичної активності GLP-1R (тобто більшу ефективність відносно рецептора GLP-1), ніж глюкагон. Варто мати на увазі, що абсолютні значення ефективності конкретної сполуки відносно рецептора до глюкагону й GLP-1 можуть бути вище, нижче або приблизно дорівнюють аналогічним значенням для нативного глюкагону людини за умови, що досягається відповідна відносна селективність до GLP-1R. Проте, сполуки згідно із даним винаходом можуть мати більш низьке значення EC 50 [GLP1R], ніж глюкагон людини. Сполуки можуть мати більш низьке значення EC 50 [GLP-1-R], ніж глюкагон, зберігаючи при цьому EC50 [Глюкагон-R], що менше ніж в 10 раз вище, ніж у глюкагону людини, менше ніж в 5 раз вище, ніж у глюкагону людини, або менше ніж в 2 рази вище, ніж у глюкагону людини. 11 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Сполуки згідно із даним винаходом можуть характеризуватися значенням EC 50 [Глюкагон-R], що менше ніж у два рази відрізняється від аналогічного значення для глюкагону людини. Зазначені сполуки можуть характеризуватися значенням EC50 [Глюкагон-R], що менше ніж у два рази відрізняється від значення для глюкагону людини, і значенням EC 50 [GLP-1R], що становить менше половини від значення для глюкагону людини, менше п'ятої частини від значення для глюкагону людини або менше однієї десятої від значення для глюкагону людини. Відносна селективність GLP-1 сполук згідно із даним винаходом може становити від 5% до 95%. Наприклад, сполуки згідно із даним винаходом можуть мати відносну селективність 5-20%, 10-30%, 20-50%, 30-70% або 50-80%, або 30-50%, 40-60,%, 50-70%, або 75-95%. Терапевтичне застосування Сполуки згідно із даним винаходом можуть забезпечити перспективний підхід для лікування ожиріння й метаболічних захворювань, включаючи діабет типу 2. Цукровий діабет, який часто називають просто, як діабет, являє собою синдром порушення обміну речовин, зазвичай внаслідок сполучення спадкоємних й екологічних причин, що виражається в аномально високому рівні цукру в крові (гіперглікемія). Рівень глюкози в крові знаходиться під контролем гормону інсуліну, виробленого бетаклітинами підшлункової залози. Діабет розвивається через руйнування продукуючих інсулін панкреатичних бета-клітин (при діабеті 1 типу) або через стійкість до впливу інсуліну (при гестаційному діабеті), а потім втрати бета-клітин (при діабеті 2 типу). Обидва типи діабету призводять до гіперглікемії, що багато в чому є причиною гострих ознак діабету: надмірному виробленню сечі, що викликає компенсаційну спрагу й збільшення споживання рідини, погіршенні зору, непоясненої втрати ваги, млявості, а також змін в енергетичному обміні. Метаболічний синдром характеризується групою метаболічних факторів ризику в окремо взятої людини. Вони містять у собі абдомінальне ожиріння (надлишкова жирова тканина навколо внутрішніх органів черевної порожнини), атерогенну дисліпідемію (порушення жирів у крові, включаючи високий рівень тригліцеридів, низький рівень холестерину ЛПВП та/або високий ЛПНП холестерину, що сприяє утворенню бляшок на стінках артерій), підвищений кров'яний тиск (гіпертонія), резистентність до інсуліну й порушення стійкості до глюкози, протромботичний стан (наприклад, високий рівень фібриногену й інгібітору активатора плазміногену-1 у крові) і протизапальний стан (наприклад, підвищений рівень С-реактивного білка в крові). Індивіди з метаболічним синдромом мають підвищений ризик розвитку діабету типу 2, а також ішемічної хвороби серця й інших захворювань, пов'язаних з іншими проявами атеросклерозу (наприклад, інсульту й захворювання периферичних судин). Домінуючими основними факторами ризику для цього синдрому представляються абдомінальне ожиріння, резистентність до інсуліну й порушення толерантності до глюкози; протромботичний стан (наприклад, високий рівень фібриногену й інгібітору активатора плазміногену-1 у крові) і протизапальний стан (наприклад, підвищений рівень С-реактивного білка в крові). Поза зв'язком з якою-небудь конкретною теорією, іважається, що сполуки згідно із даним винаходом діють як подвійні агоністи GluGLP-1. Подвійний агоніст поєднує в собі дію глюкагону на жировий обмін із впливом GLP-1 на рівень глюкози в крові й прийом їжі. Сполуки згідно із даним винаходом, таким чином, можуть діяти в синергетичному режимі й прискорювати усунення зайвих жирових відкладень, викликати стійке зниження ваги й безпосередньо знижувати аномальний рівень глюкози до нормального без ризику гіпоглікемії, яка пов'язана із супутнім використанням GLP-1 агоністів і сульфонілсечовини. Синергетичний ефект подвійних агоністів GluGLP-1 може також привести до зниження серцево-судинних факторів ризику, таких як високий рівень холестерину й ЛПНП, а також змінити стійкість до глюкози, наведені фактори можуть бути повністю незалежні від їх впливу на масу тіла. Сполуки згідно із даним винаходом можна застосовувати як лікарський засіб для запобігання збільшенню ваги, що сприяє зниженню ваги, усуненню надлишкової маси тіла або лікування ожиріння (наприклад, контроль апетиту, харчування, прийому їжі, калорій, та/або витрати енергії), у тому числі патологічного ожиріння, а також супутніх захворювань і станів, включаючи, але не обмежуючи, ожиріння, пов'язане із запаленням, ожиріння, пов'язане із захворюванням жовчного міхура й ожиріння, що індукує апное сну. Сполуки згідно із даним винаходом можна також застосовувати для лікування метаболічного синдрому, резистентності до інсуліну, порушення толерантності до глюкози, цукрового діабету 2 типу, артеріальної гіпертензії, атерогенної дисліпідемії, атеросклерозу, артеріосклерозу, ішемічної хвороби серця й інсульту. Всі ці патологічні стани можуть бути пов'язані з ожирінням. Проте, вплив сполук згідно 12 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 із даним винаходом на зазначені патологічні стани може бути опосередкований в цілому або частково через вплив на вагу тіла, або може бути незалежним від неї. Фармацевтичні композиції Сполуки згідно із даним винаходом, або їх солі, можуть бути приготовані як фармацевтичні суміші, придатні для зберігання або введення, які зазвичай містять терапевтично ефективну кількість сполуки згідно із даним винаходом, або її солі у фармацевтично прийнятному носії. Терапевтично ефективна кількість сполуки згідно із даним винаходом буде залежати від шляху введення, типу ссавця, якого лікують, і фізичних характеристик конкретного розглянутого ссавця. Ці фактори та їх відношення до визначення цієї кількості добре відомі кваліфікованим лікарям. Ця кількість і спосіб введення може бути адаптований для досягнення оптимальної ефективності, і може залежати від таких факторів, як вага, дієта, одночасне лікування іншими препаратами й іншими факторами, добре відомими кваліфікованим лікарям. Для визначення розмірів доз і режиму дозування, найбільш підходящого для людини, можна керуватися результатами згідно із даним винаходом, які можуть бути підтверджені в ретельно спланованих клінічних випробуваннях. Ефективна доза й протокол лікування може бути визначений за допомогою традиційних засобів, починаючи з низької дози на лабораторних тваринах, а потім за допомогою збільшення дози з паралельним спостереженням ефектів, а також шляхом систематичної зміни режиму дозування. Численні фактори повинні розглядатися лікарем при визначенні оптимальної дози для даної персони. Такі міркування відомі фахівцям. Термін «фармацевтично прийнятний носій» включає будь-який зі стандартних фармацевтичних носіїв. Фармацевтично прийнятні носії для терапевтичного застосування добре відомі у фармакології, і описані, наприклад, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Наприклад, можна застосовувати стерильний фізіологічний розчин і фосфатно-сольовий буфер при злегка підкислених або фізіологічних значеннях рН. рН-буферними агентами можуть бути фосфат, цитрат, ацетат, трис/(гідроксиметил)амінометан (ТРИС), N-трис(гідроксиметил)метил-3амінопропансульфонова кислота (TAPS), бікарбонат амонію, діетаноламін, гістидин, що являє собою переважний буфер, аргінін, лізин, або ацетат, або їх суміші. Термін надалі включає будьякий агент, перерахований у Фармакопеї США для використання на тваринах, включаючи людину. Термін «фармацевтично прийнятні солі» відноситься до солей сполук. Солі включають фармацевтично прийнятні солі, такі як кислотно-аддитивні солі й основні солі. Приклади кислотно-аддитивних солей є гідрохлориди, цитрати й ацетати. Прикладами основних солей є солі, де катіон обраний з лужних металів, таких як натрій і калій, лужно-земельних металів, 3 4 3 4 таких як кальцій, та іони амонію + N(R )3(R ), де R й R незалежно означають необов'язково заміщений С1-6-алкіл, необов'язково заміщений C2-6-алкеніл, необов'язково заміщений арил, або необов'язково заміщений гетероарил. Інші приклади фармацевтично прийнятних солей описані в “Remington’sPharmaceuticalSciences” ,17thedition. Ed. Alfonso. Gennaro (Ed.), MarkPublishingCompany, Easton, PA, U.S.A., 1985 й у більш пізніх виданнях, а також в енциклопедії фармацевтичної технології. «Лікування» являє собою підхід для одержання корисних або бажаних клінічних результатів. Для цілей даного винаходу, корисні або бажані клінічні результати включають, але не обмежуються перерахованим, полегшення симптомів, зменшення ступеня захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) стану хвороби, затримку або уповільнення прогресування захворювання, поліпшення або паліативне лікування хворобливого стану, і ремісію (часткову або повну), незалежно від того, виявлені або не виявлені. «Лікування» може також означати продовження строку життя у порівнянні з очікуваним строком життя при відсутності лікування. «Лікування» є втручанням, здійснюваним з метою запобігання розвитку або зміни патології розладу. Відповідно, термін «лікування» відноситься як до терапевтичних, так і до профілактичних і запобіжних заходів. До тих, хто має потребу в лікуванні, відносяться носії захворювання, а також ті особи, у яких необхідно запобігти розвитку захворювання. Фармацевтичні композиції можуть бути у формі дози для однократного введення. У такому виді суміш розділена на одиничні дози, що містять відповідні кількості активного компонента. Одинична доза може бути підготовлена для упаковки, що містить дискретні кількості препаратів, наприклад, пакетик таблеток, капсул і порошків у флаконах або ампулах. Одинична доза може бути також у виді капсул, облаток або таблеток, або це може бути відповідна кількість будь-якої із цих пакувальних форм. Упаковка може бути надана у виді разової дози в ін'єкційній формі, наприклад у виді ручки. Суміші можуть бути розроблені для кожної прийнятного способу й виду введення. Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі включають ті, які використовуються 13 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 в складах, придатних для перорального, ректального, назального, місцевого (у тому числі защічного й під'язичного), вагінального або парентерального (включаючи підшкірні, внутрім'язові, внутрішньовенні, внутрішкірні й трансдермальні) введення. Суміші можуть бути зручно представлені у формі одиничної дози й можуть бути одержані будь-яким зі способів, добре відомих у галузі фармацевтики. Для сполук, описаних у даній заявці, особливо підходять підшкірні або трансдермальні способи введення. Комбінована терапія Сполуки згідно із даним винаходом можна вводити в рамках комбінованої терапії з агентом для лікування цукрового діабету, ожиріння або гіпертонії. У таких випадках, два зазначених активних агенти можна призначати спільно або окремо, як частину того самого фармацевтичного препарату, або у виді окремих препаратів. Таким чином, сполуку згідно із даним винаходом (або її сіль) можна застосовувати в сполученні з антидіабетичними агентами, включаючи, але не обмежуючись наведеними прикладами, метформін, сульфонілсечовину, глінід, DPP-IV інгібітор, глітазон або інсулін. У переважному варіанті сполуки або солі застосовують у комбінації з інсуліном, DPP-IV інгібітором, сульфонілсечовиною або метформіном, особливо із сульфонілсечовиною або метформіном, для досягнення адекватного контролю глікемії. У ще більш переважному варіанті сполуки або солі згідно із даним винаходом застосовують у комбінації з інсуліном або аналогом інсуліну для досягнення адекватного контролю глікемії. Приклади аналогів інсуліну, включають, але не обмежуються перерахованими, Lantus, Novorapid, Humalog, Novomi й ActraphaneHM. Сполуку або сіль згідно із даним винаходом можна, крім того, застосовувати в комбінації агентами проти ожиріння включаючи, але не обмежуючись даними прикладами, агоніст рецептора глюкагон-подібного пептиду 1, пептид YY або його аналог, антагоніст канабіноїдного рецептора 1, інгібітор ліпази, агоніст рецептора 4 меланокортину або антагоніст, що концентрує гормональний рецептор 1 меланіну. Аналог сполуки згідно із даним винаходом або її сіль можна застосовувати в комбінації з агентами від гіпертонії, включаючи, але не обмежуючись даними прикладами, інгібітор ангіотензин-перетворюючого ферменту, блокатор рецептора ангиотензина II, діуретики, бетаблокатори або блокатори кальцієвих каналів. МЕТОДИ Загальний синтез аналогів глюкагону Твердофазний синтез пептидів здійснювали, як СППС на синтезаторі, обладнаному мікрохвилями, з використанням стандартної Fmoc стратегії в NMP на полістирольній смолі (TentaGelSRam). HATU разом з DIPEA як основу використовували як з’єднуючий реагент. Піперидин (20% в NMP) використовували для зняття захисту. Псевдопроліни: Fmoc-Phe-Thr (Psi. Me, Mepro)-OH й Fmoc-Asp-Ser (Psi. Me, Mepro)-OH (придбані в NovaBiochem) використовували, де це було застосовано. Відщеплення: Синтезований пептид відщеплювали від смоли шляхом обробки 95/2.5/2.5% (v/v) TFA/TIS/вода при кімнатній температурі протягом 2 год. Для пептидів з метіоніном у послідовності використовували суміш 95/5% (v/v) TFA / EDT. Більшість TFA видаляли при зниженому тиску, синтезований пептид осаджували, промивали діетиловим ефіром і висушували до постійної маси при кімнатній температурі. Очищення синтезованого пептиду шляхом ВЕРХ Синтезований пептид очищали стандартною зворотною фазовою ВЕРХ на робочій станції PerSeptive Biosystems VISION. Для керування приладом і збору даних використовували VISION 3,0 програмне забезпечення. Пептиди аналізували з використанням мас-спектрометрії й очищали до більше ніж 90% за оцінкою за допомогою ВЕРХ. Загальний синтез ацильованих аналогів глюкагону Неочищений пептид синтезували, як описано вище для загального синтезу аналогів глюкагону, за винятком, що неочищений пептид ацилювали за бічним ланцюгом залишку лізину, поки пептид був зв'язаний зі смолою й повністю захищений за групами бічних ланцюгів, за винятком епсілон-аміну на лізині, який повинен бути ацильований. Лізин, який повинен бути ацильований, вводили за допомогою Fmoc-Lys (ivDde)-OH. N-кінець пептиду захищали групою Boc з використанням Boc2O в NMP. У той час як пептид був зв'язаний зі смолою, захисну групу ivDde вибірково відщеплювали за допомогою 2% гідразин гідрату в NMP. Незахищений бічний ланцюг лізину спочатку зв'язується зі спейсерною амінокислотою, як Fmoc-Glu-OtBu, з якої знімали захист піперидином й ацилювали жирними кислотами з використанням стандартної методології зв'язування пептиду, як описано вище. Навпаки, гістидин на N-кінці може бути 14 UA 104605 C2 5 включений у початок, як Boc-His (Boc)-OH. Відщеплення від смоли й очищення здійснювали, як описано вище. Аналіз стабільності пептиду Аналоги глюкагону інкубували у виді твердих сполук при 40 °C і розчиняли у виді розчинів в 0,1 М водної HCl (2 мг/мл). Розчини інкубували при 40°. Аналоги глюкагону, що залишилися інтактними, вимірювали шляхом ОФ-ВЕРХ шляхом інтеграції УФ сигналу при 220 нм. Відсоток аналогів глюкагону, що залишилися інтактними, являє собою міру відносної стабільності. Тверді й розчинені сполуки глюкагону перед аналізом розводили в розчинниках для ВЕРХ до концентрації 0,2 мг/мл й аналізували у відповідних тимчасових точках. 10 Таблиця 1 Параметри аналітичної ВЕРХ Колонка Gemini C18 150x3мм (0-3хв; 18%B) (3-22хв; 45%B) Градієнт (22-23хв; 95%B) (час; % B) (23-24хв; 18%B) (24-30хв; 18%B) Розчинник A 0.1 % TFA в 1% MeCN:MQW Розчинник Б 0,085 % TFA в MeCN Потік 0,300 мл/хв Об’єм ін'єкції 35 мкл Температура 30 °C колонки. Детекція УФ 220 нм 15 20 25 30 35 40 Одержання клітинних ліній, що експресують глюкагон й GLP-1 рецептор людини. кДНК, що кодує рецептор глюкагону людини (глюкагон-R) (первинний реєстраційний номер P47871) і рецептор глюкагон-подібного пептиду 1 людини (GLP-1R) (первинний реєстраційний номер 43220) клонували із клонів кДНК BC104854 (MGC: 132514 / Image: 8143857) або BC112126 (MGC: 138331/IMAGE: 8327594), відповідно. ДНК, що кодує рецептор глюкагону або GLP-1-R, ампліфікували способом ПЛР із використанням праймерів, до складу яких входять кінцеві сайти рестрикції для субклонування. До 5'-кінця праймера додатково приєднували близьку до консенсусу послідовності Козака для забезпечення ефективної трансляції. Відсутність помилок у ДНК, що кодує Glucagon-R й GLP-1-R, перевіряли шляхом секвенування ДНК. ПЛР-продукти, що кодують Glucagon-R або GLP-1-R, субклонували в експресійний вектор ссавців, який містить ген стійкості до неоміцину (G418). Експресійні вектори ссавців, що кодують Glucagon-R або GLP-1-R, трансфікували в HEK293 шляхом стандартного способу трансфекції з фосфатом кальцію. Через 48 годин після трансфекції клітини висівали для обмеження розведення клонування й відбирали на культуральному середовищі з 1 мг/мл G418. Три тижні через 12 колоній, що вижили, клітини яких експресували рецептор глюкагону й GLP-1-R, збирали, розмножували й застосовували в аналізі визначення ефективності відносно щодо рецептора глюкагону й GLP-1-R, як описано нижче. Для аналізу профілю сполук був обраний один клон, що експресує рецептор глюкагону, і один клон, що експресує GLP-1-R. Аналіз ефективності відносно рецептора глюкагону й рецептора GLP-1 Клітини HEK293, що експресують рецептор глюкагону людини, або рецептор GLP-1 людини, висівали в кількості 40000 клітин на лунку в 96-лункові мікротитрувальні планшети, покриті 0,01% полі-L-лізином, і вирощували протягом 1 дня в культурі в 100 мкл культурального середовища. У день аналізу культуральне середовище видаляли й клітини промивали однократно 200 мкл буфера Tyrode. Клітини інкубували в 100 мкл буфера Tyrode, що містить зростаючі концентрації тестових пептидів, 100 мкл IBMX й 6 мМ глюкозу, протягом 15 хв. при 37С. Реакцію зупиняли додаванням 25 мкл 0,5 М HCl, інкубували на льоді протягом 60 хв. Вміст цАМФ оцінювали за допомогою набору FlashPlatecAMP від Perkin-Elmer. EC50 і відносну ефективність у порівнянні з еталонними сполуками (глюкагон й GLP-1) оцінювали шляхом програмного суміщення з кривою. Липоліз у первинних адіпоцитах пацюків 15 UA 104605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ефект аналогів глюкагону на ліполіз досліджували на первинних культурах адіпоцитів пацюків. Адіпоцити виділяли з епідідимальної жирової тканини, одержаної від нормальних молодих статевозрілих пацюків Sprague-Dawley. Шматки жиру подрібнювали й інкубували на шейкері (220 оборотів на хвилину) з колагеназою (1 мг/мл) у буфер Кребса-Рінгера, що містить 4% BSA (KRB-БСА) протягом 60 хвилин при 37 °C. Суспензію фільтрували через нейлоновий фільтр (розмір пор 160 мкм), фільтрат центрифугували при 200 xg протягом 3 хв. Середовище під верхнім плаваючим шаром адіпоцитів видаляли пастеровською піпеткою. Адіпоцити промивали 3 рази в KRB-BSA буфері, ресуспендували й центрифугували. Адіпоцити ресуспендували в KRB-BSA буфері, змішували й інкубували на шейкері з тестовими сполуками в 96-лункових глибоких планшетах (50 000 клітин/лунку) у загальному об’ємі 1 мл при 37° С протягом 60 хв. Планшети залишали на льоді протягом не менше 10 хв. після інкубації з наступним центрифугуванням при 200 xg протягом 3 хв. 300 мкл буфера з-під шару адіпоцитів поміщали в 96-лункові глибокі планшети. Цей процес повторювали ще два рази, потім поєднували 3 екстракти, зібрані від кожної культури. Гліцерин, що утворився в результаті ліполізу в культурах адіпоцитів, вимірювали шляхом додавання реагенту вільного гліцерину (200 мкл) до аліквотів екстракт адіпоцитів (25 мкл), інкубували при кімнатній температурі протягом 15 хв і вимірювали оптичну щільність при 540 нм. Оральний тест на толерантність до глюкози (ОТТГ) у мишей db/db У мишей Db/db Dbu, які не одержували корм протягом ночі, брали первинні зразки крові (рівень глюкози в крові натще) перед введенням (інтраперитонеально) наповнювача (ацетатний буфер, 20 мМ оцтова кислота, 250 мМ маннітол, pН 5,0) або тестованої сполуки ZP2669 (SEQ ID NO: 4) (45 нмоль/кг). У ході експерименту мишам не давали корм, щоб уникнути ефекту змішування зі споживаним кормом. Через п'ятнадцять хвилин мишам перорально вводили глюкозу (1 г/кг в 5 мл/кг), і вимірювали рівень глюкози в крові при t=30 хв, t=60 хв, t=120 хв й t=240 хв. Вимірювали різницю у порівнянні з базовим рівнем глюкози (t=0) для кожного моменту часу й визначали площу під кривою AUC0-240хв. Статистичний аналіз значень AUC зі шляхом однофакторного дисперсійного аналізу й апостеріорного аналізу Даннета проводили за допомогою програми GraphPad Prism версії 4. Розходження розглядали як статистично значимі при р