Спосіб одержання клітинних ліній овочевих рослин родини solanaceae l. (помідор, перець солодкий, баклажан) в культурі in vitro

Реферат: Спосіб одержання клітинних ліній овочевих рослин родини Solanaceae L. (помідор, перець солодкий, баклажан) в культурі in vitro включає використання як донорського матеріалу експлантатів, які знаходяться у ювенільній фазі розвитку - сім'ядолей 7-10 денних стерильних проростків, висаджування їх на середовище Мурасиге-Скуга (МС), модифіковане регуляторами росту БАП від 2 до 5 мг/л, та ІОЦK - від 2 до 5 мг/л, розмноження клітинних ліній методом прямого органогенезу, підрощування конгломератів мікропагонів на середовищі МС, модифікованого 1 мг/л БАП та 2 мг/л ГK3, та укорінення сформованих рослин-регенерантів на середовищі МС, доповненому 0,5 мг/л ІОЦK. UA 81587 U (12) UA 81587 U UA 81587 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до сільського господарства, а саме способів одержання вихідного селекційного матеріалу методами клітинної селекції, та біотехнології - культивування тканин рослин в культурі in vitro - регенерація рослин із калюсних тканин шляхом планового морфогенезу, що дозволяє одержувати клітинні лінії, які можуть бути використані в селекції, біотехнології, насінництві, фізіології, генетиці і клітинній біології. Розробка може бути застосована для селекційних чи науково-теоретичних потреб. За останні 15 років у науковій літературі опубліковано експериментальні результати, що демонструють можливість використання клітинних ліній як перспективний селекційний матеріал, який активно використовується у створенні конкурентних сортів і гетерозисних гібридів [1-3]. Сомаклональна мінливість, що виникає у процесі культивування клітин in vitro, є важливим джерелом розширення спектра доступної генетичної мінливості та покращення конкурентоздатності вже створених сортів як за кількісними, так і за якісними ознаками, наприклад такими, як абіотична та біотична стійкість. Доступність достатньої генетичної мінливості (біологічна варіативність) і ефективні процедури добору дозволяють значно прискорювати традиційний селекційний процес [4, 5]. Ефективні регенераційні системи також є важливими складовими сучасних систем генетичної трансформації, за рахунок яких за останні 10 років здійснено великий об'єм наукових досліджень і одержано комерційні сорти рослин [6]. Не зважаючи на велику кількість наукових досліджень, викладені в наукових публікаціях методики не є ефективними в роботі з українськими сортами, оскільки вони були розроблені для генотипів з іншими генетичними параметрами та показниками морфогенезу. Іншими об'єктивними чинниками, які істотно зменшують результативність реалізації тотипотентності клітин рослин родини пасльонових є тип вибраного експлантату, та несприятливі умови культивування. Тому, перед тим як розпочати експериментальні дослідження зі створення вихідного матеріалу для селекції, здійснюється великий обсяг досліджень, метою яких є оптимізація складу культуральних живильних середовищ та визначення оптимального типу донорського матеріалу, для підвищення частоти регенерації [7-10]. Найбільш близьким за суттю (спосіб-прототип) до запропонованої корисної моделі є спосіб одержання клітинних ліній помідора за Кільчевским та ін. (2012) [11], який полягає у наступному: 1. Насіння вихідних форм вводять в стерильну культуру і вирощують на безгормональному середовищі до одержання проростків. Культивування проводять при освітленні 2000 лк та температурі 23-25 °C. 2. Для ініціювання і проліферації калюсів як експлантатів використовують сегменти сім'ядолей, отримані від рослин помідора в фазі початку формування першого листа. 3. Індукція морфогенезу здійснюється на поживному середовищі Мурасиге-Скуга (МС) [12], модифікованому БАП та НОЦК. 4. Одержану калюсну тканину для індукцію морфогенезу розміщують на живильне середовище МС, яке містить 1 мг/л кінетину та 0,2 мг/л ІО ЦК. Найближчим за складом компонентів до середовища, яке використовується у корисній моделі, є пропис МС [12]. Склад живильного середовища-прототипу наступний, мг/л: 40 макроелементи NH4NO3 KNO3 СаСl2 б/в MgSO4 × 7H2O КН2РО4 мікроелементи Н3ВО3 MnSO4 × 5H2O CuSO4 × 5H2O ZnSO4 × 7H2O NaMoO4 × 2H2O KJ CoCl2 × 6H20 FeSO4 × 7H2O Ка2ЕДТАх2Н2О органічні речовини тіамін хлорид піридоксин хлорид мезоінозит 1650 1900 333 370 170 6,2 24,1 0,025 8,6 0,25 0,83 0,025 27,85 37,25 3 1 100 1 UA 81587 U Продовження органічні речовини сахароза, г/л 30 агар-агар, г/л 7 вода до 1 л. 5 10 15 20 25 30 35 Наведений спосіб (прототип) одержання клітинних ліній томата в культурі in vitro має наступні недоліки: - у більшості генотипів української селекції розвиток морфогенних пагонів на регенераційному середовищі відбувається з низькою частотою, тому при застосуванні з різними генотипами спосіб потребує значної модифікації; - не з усіх сформованих зон ініціації вдається отримати розвинені рослини-регенеранти, придатні для подальшого розмноження; - спосіб (прототип) використовується лише з тканинами помідора, а з тканинами перцю солодкого і баклажана не є ефективним. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу одержання клітинних ліній овочевих рослин родини Solanaceae L. (помідор, перець солодкий, баклажан) в культурі in vitro, яка б в 2 рази скорочувала тривалість культивування рослин від введення в культуру in vitro до моменту одержання клітинних ліній, забезпечувала протягом п'яти - семи пасажів високі показники морфогенезу у високого відсотка використаних експлантатів різних генотипів за рахунок чого суттєво збільшувала сумарний вихід пробіркових рослин і була базовою при оцінці регенераційної здатності пасльонових культур. Поставлена задача вирішується наступним способом: 1. Насіння стерилізують у розчині гіпохлориту натрію у концентрації 30 %, з експозицією обробки - 25 хвилин після чого промивають 5 разів стерильною водою. 2. Простерилізоване насіння висаджують для одержання проростків на базове безгормональне живильне середовище МС. 3. Для індукції калюсогенезу і морфогенезу сім'ядолі семи - десяти денних стерильних проростків висаджують на базове середовище МС, модифіковане регуляторами росту БАП від 2 до 5 мг/л, та ІОЦК - від 2 до 5 мг/л. Висаджений матеріал культивують за температури 20-22 °C, фотоперіод 16 - год. освітлення, 8 год. темноти при інтенсивності освітлення - 2 тис. люкс. Пересадки експлантатів проводять через кожні 30 діб. 4. Отримані конгломерати мікропагонів для додаткової диференціації підрощують на середовищі з додаванням 1 мг/л БАП та 2 мг/л ГК3. 5. Укорінення сформованих рослин-регенерантів проводять на середовищі МС, доповненому ауксинами - 0,5 мг/л ІОЦК. Приклад. В таблиці наведено дані щодо ефективності використання способу одержання клітинних ліній овочевих рослин родини Solanaceae L. Дослідження в культурі in vitro помідора проводили протягом шести років, перцю солодкого - один рік, баклажана - два роки. Ефективність розробленого способу оцінено на 39 генотипах помідора, 20 генотипах баклажана, 6 генотипах перцю солодкого. Як контроль було використане безгормональне середовище МС. Таблиця Вплив концентрацій регуляторів росту у середовищі МС на калюсогенез і морфогенез помідора, баклажана і перцю солодкого Культура Помідор Калюсогенез Вміст регуляторів Середній Ефективність, росту, мг/л діаметр % 3 калюсів, мм МС б/г(контроль) 15,0 114,0±50 БАП-2 94,5 897,2±83,5 ІОЦК - 4 БАП-5 70,5 675,9±55,3 ІОЦК - 2 40 2 Ефективність регенерації, % Кількість пагонів на калюс, шт. 0,0 0,0 66,4 3,5±0,4 45,5 2,1±0,2 UA 81587 U Продовження таблиці Культура Перець солодкий Баклажан Калюсогенез Вміст регуляторів Середній Ефективність, росту, мг/л діаметр % 3 калюсів, мм МС б/г(контроль) 25,3 204,3±0,25 БАП-4 87,9 542,8±43,0 ІОЦК -2 БАП-5 90,1 608,2±57,2 ІОЦК-0,5 МС б/г(контроль) 0,0 0,0 ІОЦК-2 + 100,0 497,42±10,6 БАП-4 Ефективність регенерації, % Кількість пагонів на калюс, шт. 0,0 0,0 54,5 1,9±0,3 70,5 1,5±0,09 0,0 0,0 85,0 23±0,4 Примітка * - достовірна при рівні значимості 0,05 5 10 15 20 25 30 35 40 Використані в досліді живильні середовища з додаванням БАП та ІО ЦК виявили свою ефективність як індуктори калюсо- і органогенезу в культурі ізольованих тканин і органів помідора. У експлантатів помідора індукція світло-зеленого первинного калюсу розпочиналась через 2 тижні, при цьому інтенсивність і початок проліферації у різних генотипів були різними. Обидва склади живильних середовищ з додаванням регуляторів росту підтвердили свою компетентність в ініціації морфогенезу з сім'ядольних експлантатів помідора. На середовищі МС, модифікованому 2 мг/л БАП та 4 мг/ л ІОЦК, 74,5 %, використаних генотипів виявили здатності до індукції калюсу і формування морфогенних зон. Середній діаметр калюсів помідора 3 після чотирьох тижнів культивування дорівнював 897,2±10,4 мм . На середовищі МС модифікованому 5 мг/л БАП та 2 мг/л ІОЦК здатність до індукції калюсу на 24,0 % була меншою і дорівнювала 50,5 %. На цьому варіанті середовища висока регенераційна активність спостерігалась у генотипів, які мали невисоку здатність до проліферації калюсу і органогенезу на середовищі модифікованому 2 мг/л БАП та 4 мг/л ІО ЦК, що підтверджує залежність органогенних властивостей насамперед від генотипу. Формування з калюсів помідора рослинрегенерантів органогенного походження розпочиналось на 6 тижні культивування. На середовищі МС, модифікованому 2 мг/л БАП та 4 мг/л ІО ЦК, відбувалась стабільна регенерація 3,5±0,4 шт. регенерантів на пасаж, а з калюсів на середовищі, модифікованому 5 мг/л БАП та 2 мг/л ІОЦК 2,1±0,2 шт. регенерантів, що дозволяє нам рекомендувати розроблені середовища як регенераційні для культури помідора. Ефективність калюсогенезу перцю солодкого на середовищі МС модифікованому 4 мг/л БАП та 2 мг/л ІОЦК становила 77,9 %, а на середовищі 5 мг/л БАП та 0,5 мг/л ІО ЦК - 90,1 %. На експлантатах перцю солодкого формування темно-зелених структур, з яких при наступному культивуванні формувались рослини-регенеранти, розпочиналось через 3 тижні. За один пасаж утворювалось від 1,5 до 1,9 шт. регенеранти на калюс. Ефективність регенерації з калюсної тканини перцю солодкого становила від 54,5 до 70,5 %. У експлантатів баклажана на розробленому середовищі МС, модифікованому 4 мг/л БАП та 2,0 мг/л ІОЦК, індукція калюсогенезу розпочиналась через 30 діб, а ефективність калюсогенезу становила 100 %. Новоутворений калюс був щільний, структурований, світло-фіолетового 3 кольору, через 4 тижні культивування дорівнював 497,4±1,6 мм . Експлантати баклажана на середовищі, модифікованому регуляторами росту, виявили високі морфогенетичні показники - з 85,0 % калюсів за один пасаж виявляли регенераційний відгук. З одного калюсу баклажана було індуковано в середньому 2,3±0,4 шт. рослин регенерантів. Розроблений спосіб забезпечує у помідора, баклажана і перцю солодкого стабільні показники регенерації більше 45 % і може бути рекомендованою для застосування в програмах, пов'язаних з культурою ізольованих клітин і тканин in vitro і генною інженерією, так як їх використання забезпечує стабільну регенерацію клітинних ліній в калюсній культурі з генотипів різного походження. Список посилань 1. Шабетя О.М. Вихідний матеріал для створення гетерозисних гібридів баклажанів: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. с.-г. наук: спец. 06.01.05 - "Селекція і насінництво" / О.М. Шабетя. - X., 1999.-19 с. 3 UA 81587 U 5 10 15 20 25 2. Мусияка В.К. Культура клеток и тканей томата / В.К. Мусияка // Физиология и биохимия культурных растений.-2000. - Т. 32, № 2. - С. 83-94. 3. Kashyap V. Byotechnology of eggplant / V. Kashyap, S. Vinod Kumar// Scietia Horticulture.2002. - P. 1-25. 4. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна./ А.В. Поляков //Тверь, 2000,-188 с. 5. Игнатова С.А. Клеточные технологии в растениеводстве, генетике и селекции возделываемых растений: Задачи, возможности, разработка систем in vitro: [монография] / C.A. Игнатова. - Одесса: Астропринт, 2011.-224 с. 6. Stenitz В. Regeneration in vitro and genetic transformation of pepper current state of the art / B. Stenitz., D. Wolf// Capsicum and Eggplant Newsletter/ - 1999. - P. 9-15. 7. Anel K. Multiple Shoot Induction and Plant Regeneration from Nodal Explants of Peppers (Capsicum annuum L.) //Islan J. Exp. Biol. Sci.-2011. - V. 2(3). - P. 517-520. 8. Agra W. Plant Regeneration in Tissue cultures of Pepper (Capsicum annuum L.) / W. Agra., N. Chandra, S. Kothari // Plant Cell Tiss. Org. Cult.-1989. № 16. P. 47-55. 9. Юркова Г.Н., Галецкая Г.Р. Регенерационная способность коллекционных образцов культурного томата / Г.Н. Юркова, Г.Р. Галецкая // Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане: Мат. Респ. Конф., 18-22 ноября 1990, Алма-Ата. - Алма-Ата, 1990. - С. 122-123. 10. Мирошниченко В.П. Оценка способности к пролиферации каллуса и органогенезу в культуре in vitro некоторых генотипов томата / В.П. Мирошниченко, В.А. Кравченко, А.В. Куземенский. [та ін.] // Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів: Мат. Міжнар. наукової конференції. - X., 1999. - С. 101-104. 11. Кильчевский А. Клеточная инженерия / А. Кильчевский, Л. Хотылева // Биотехнология в селекции растений. - Минск: Буларус. Навукаб 2012. - С. 22-47. 12. Murashige Т. A revised medium for rapid grown and bioassay with tobacco tissue culture / T. Murashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum.-1962.-15. - P. 473-497. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб одержання клітинних ліній овочевих рослин родини Solanaceae L. (помідор, перець солодкий, баклажан) в культурі in vitro, який включає використання як донорського матеріалу експлантатів, які знаходяться у ювенільній фазі розвитку - сім'ядолей 7-10 денних стерильних проростків, висаджування їх на середовище Мурасиге-Скуга (МС), модифіковане регуляторами росту БАП від 2 до 5 мг/л, та ІОЦK - від 2 до 5 мг/л, розмноження клітинних ліній методом прямого органогенезу, підрощування конгломератів мікропагонів на середовищі МС, модифікованого 1 мг/л БАП та 2 мг/л ГK3, та укорінення сформованих рослин-регенерантів на середовищі МС, доповненому 0,5 мг/л ІОЦK. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4