Спосіб визначення захисних властивостей слини

Реферат: UA 82358 U UA 82358 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме до стоматології, і може бути використана для дослідження функціональної діяльності слинних залоз і протективних властивостей слини при різних патологічних процесах у ротовій порожнині. Слина має важливу роль в підтримці гомеостазу порожнини рота. Один відсоток слини складають молекули таких органічних сполук, як білки, глікопротеїни і ліпіди, а також невеликі молекули органічних речовин. Глікопротеїни слини покривають і змащують поверхню слизової оболонки. Їх великі молекули запобігають прилипанню і колонізації бактерій, захищають тканини від фізичного пошкодження. Вуглеводний склад глікопротеїнів представлений п'ятьма типами моносахаридів: фукозою, галактозою, гексозамінами (N-ацетилглюкозаміном, N-ацетилгалактозаміном) і сіаловою кислотою. Відомий спосіб діагностики стану місцевого імунітету за методом визначення імуноглобулінів у слині (патент № UA 36955 А, МПК (2006) А61К39/00, опубл. 16.04.2001, бюл. № 3), за яким визначають концентрації секреторної та мономерної форми імуноглобуліну А, а також IgM і IgG, та по співвідношенню їх між собою визначають рівень імунних глікопротеїнів у слині та стан місцевого гуморального імунітету. Однак недоліками способу є його дорожнеча, тому що для визначення різних типів імуноглобулінів використовуються імуноферментні тестсистеми. Також не визначається якість секреторного компонента імуноглобуліну, яка характеризує стійкість імуноглобуліну до атак мікробних ферментів і час його існування. Не враховується загальна кількість глікопротеїнів у слині, а тільки ті, що мають імунні характеристики. Більшість глікопротеїнів слини мають захисні фізико-хімічні властивості, які перешкоджують прикріпленню мікробів до слизової оболонки порожнини рота, але відомий спосіб їх не враховує. Найбільш близьким серед об'єктів аналогічного призначення за сукупністю істотних ознак є спосіб визначення захисних властивостей слини (Биохимические методы исследования в клинике / Под редакцией Покровского А.А. - М.: Медицина, 1969.-249 с), що включає визначення біохімічним способом вмісту в слині гликопротеїнів по компоненту вуглеводної групи гексозаміну з наступним порівнянням даних дослідної та контрольної проб. Визначають гексозаміни у біологічних рідинах за методикою Ельсона та Моргана. Виконують забір проби слини, гідроліз (розчинення) осаду соляною кислотою, і нейтралізацію кислоти лугом. В отриманий розчин додають хімічні реагенти і проводять визначення змісту глікопротеїнів по гексозаміну відповідно з калібрувальній кривій. Недоліки способу полягають у тому, що в досліджуваній рідині міститься білок, який своєю присутністю може призвести до спотворювання результатів за рахунок мутності досліджуваної суміші. Також недоліками є недостатня ефективність використання критеріїв якості оцінки, обмеження можливостей збільшення чутливості при ідентифікації та необхідність великого проміжку часу, що в сукупності запобігає підвищенню об'єктивності оцінки та точності. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективний спосіб оцінки захисних властивостей слини, при якому б визначення рівня гексозамінів виконувалося з високою точністю за менший проміжок часу при простоті у використанні за допомогою доступних реактивів та приладів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення захисних властивостей слини, що включає визначення біохімічним способом вмісту в слині гликопротеїнів по компоненту вуглеводної групи - гексозаміну з наступним порівнянням даних дослідної та контрольної проб, відповідно до корисної моделі, додатково виконують осадження глікопротеїнів 96 %-м етанолом, узятим у співвідношенні 2:1 до слини, і відділення осаду центрифугуванням, спектрофотометрично визначають зміст гексозамінів в осаді й при зниженні показника діагностують зміну захисних властивостей слини. Під дією ацетилацетону в лужному середовищі гексозаміни перетворюються в похідні піролу, які дають з n-диметиламінобензальдегідом інтенсивне червоне забарвлення. Субстрат гідролізують кислотою, гексозаміни ацетилюють ацетилацетоном, обробляють лугом для отримання циклічного оксазолу або піролу, який пов'язують з п-діметіламінобензальдегідом для отримання забарвленого субстрату, інтенсивність забарвлення якого вимірюють. Надосадову рідину, що містить білок після центрифугування зливають, що дозволяє виключити вплив в'язкості й мутності слини на дослідження. За рахунок попереднього осадження і видалення білка в два рази скорочується час проведення хімічної реакції визначення гексозамінів в ротовій рідині. Спосіб визначення захисних властивостей слини здійснюють таким чином. 1 мл слини доливають до 2 мл 96 % етанолу, центрифугують 10-15 хв. при 1500 об/хв, надосадову рідину зливають. До осаду додають 1 мл 8 н. НСl. Пробірку закривають повітряним холодильником (пробкою зі вставленою в неї скляною трубочкою). Пробірку ставлять в штатив і поміщають для 1 UA 82358 U 5 10 15 20 гідролізу в киплячу водяну баню на чотири години, після чого гідролізат переносять в мірну пробірку, нейтралізують 3 н. NaOH до слаболужної реакції на лакмус і доводять дистильованою водою до 5 мл. До 1 мл отриманого супернатанту (з цього моменту вводять контрольну пробу, в яку беруть відповідно 1 мл дистильованої води) додають 1 мл ацетілацетонового реактиву і прикриті пробками пробірки ставлять на 15 хвилин в киплячу баню. Після охолодження в пробірки додають 2 мл 96 %-го етанолу і 0,5 мл реактиву Ерліха, перемішують, через 30 хвилин заміряють екстинції на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 540 (зелений світлофільтр), в кюветі з робочою довжиною 10 мм проти контролю. Результати розраховують по калібрувальної кривої, побудованої за стандартним розчином d-глюкозаміну гідрохлориду. Розрахунок здійснюють за формулою: ΔЕ х 462,4 (мкг/мл), де ДЕ - різниця між оптичною щільністю дослідної і контрольної проби, а 462,4 - коефіцієнт перерахунку. Норма вмісту гексозамінів в ротовій рідині 0,45-0,55 ммоль/л, і при зниженні показника діагностують зміну захисних властивостей слини. За пропонованим способом обстежено 64 дитини обох статей у віці від 12 до 17 років з хронічним гастритом і дуоденітом, госпіталізованих для обстеження та лікування в спеціалізоване гастроентерологічне відділення обласної дитячої клінічної лікарні. Хворі з хронічним гастритом і дуоденітом були розділені на дві підгрупи: 1-а - діти з запальними змінами в слизовій оболонці шлунка і дванадцятипалої кишки - 25 осіб; 2-а - діти із запальними та ерозивними змінами в слизовій оболонці шлунка і дванадцятипалої кишки - 22 особи. Контрольну групу склали 17 соматично здорових дітей. Слину збирали вранці, натщесерце, шляхом спльовування в мірну одноразову пластикову ємкість у кількості 3 мл. Біохімічний склад глікопротеїнів ротової рідини у обстежених пацієнтів представлений в таблиці 1. Таблиця 1 Склад глікопротеїнів ротової рідини у дітей обстежуваних груп Показник Гексозаміни, ммоль/л Фукоза, ммоль/л Сіалова кислота, ммоль/л Загальні глікопротеїни, мг/мл Загальний білок, г/л Контрольна група (n=17) 0,51±0,07 0,57±0,01 0,15±0,02 0,11±0,02 2,94±0,41 І група (n=25) II група (n=22) 0,33±0,02* 0,69±0,04 0,19±0,02* 0,03±0,01** 4,36±0,77* 0,23±0,05** 1,09±0,08** 0,12±0,01* 0,03±0,01** 10,32±2,83** Примітка: * - р