Спосіб визначення желатиназ у плазмі крові

Реферат: Спосіб визначення активності желатиназ у плазмі крові людини включає електрофорез попередньо розведених у буфері Леммлі дослідних зразків у желатин-поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію, промивку гелю Тритоном Х-100, інкубацію в ензимному буфері, фарбування у розчині Кумассі G250, знебарвлення розчином метанолоцтова кислота-вода, денситометрію гелю та розрахунок кількості желатиназ відносно стандартного зразка. При цьому зразки плазми крові попередньо інкубують, розводять у забуференому фізіологічному розчині, додають Леммлі, проводять електрофорез у поліакриламідному гелі з наступним переведенням обробленого гелю у цифровий формат та розраховують активність желатиназ за допомогою програми Sorbfil Videodensitometer 2.0, використовуючи як еталон пул плазми крові від 20 здорових донорів, активність желатиназ у якому прийнята за 100 %. UA 83196 U (12) UA 83196 U UA 83196 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біології і медицини, а саме до способів визначення активності желатиназ А і В у плазмі крові, що може бути корисним у лабораторній діагностиці патологічних станів та при проведенні науково-дослідних робіт. Желатинази належать до сімейства матриксних металопротеїназ, що вміщує більше 30 ферментів, гідролізуючих білки сполучної тканини. Останнім часом з'явилось багато досліджень, в яких доводиться участь желатиназ у патогенезі багатьох захворювань (новоутворення, серцево-судинні захворювання, ураження нирок та інші), тому зростає інтерес різних дослідників до засобів визначення їх кількості та активності. Відомий спосіб визначення активності металопротеїназ у сироватці крові з використанням флуоресцентного субстрату MCA-Pro-Ley-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 [Потеряева О.Н., Русских Г.С., Чернышева А.С., Мокрушников П.В. Метод определения активности матриксных металлопротеиназ в сыворотке крови // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал.-2010. - № 6. - http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_mll.php?id=461]. Метод базується на визначенні кількості флуорогенного субстрату МСА-Рrо-Ley-Gly-Leu-DPA-Ala-ArgNH2, що специфічно розщеплюється під дією матриксних металопротеїназ сироватки крові. Основними етапами методу є інкубація 200 мкл робочого розчину субстрату з 20 мкл нерозведеної сироватки впродовж 60 хвилин при 37 °C, зупинка реакції 900 мкл 3 % розчином оцтової кислоти і вимірювання інтенсивності флуоресценції на спектрофлуориметрі при 325 нм. Як стандарт використовують розчин метилкумарил аміду (МКА) з концентрацією 1 мкмоль/л. Активність ферментів розраховують за запропонованою авторами формулою. Недоліком цього методу є відсутність специфічності відносно желатиназ, оскільки за допомогою запропонованого в роботі субстрату можна оцінити лише загальну активність металопротеїназ. Застосування цього методу обмежується також високою вартістю субстрату і необхідністю використання спектрофлуориметра. Відомий спосіб напівкількісного визначення активності желатиназ у різних біологічних рідинах методом зимографії [Нu X., Beeton Ch. Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography // 2010. - JoVE. 45. http://www.jove.com/details.php?id=2445] здійснюється поетапно в порядку: 1 - електрофорез у Novex® гелі протягом 90 хвилин при напрузі 125 В; 2 інкубація гелю в ренатуруючому Novex® буфері за кімнатної температури протягом 30 хвилин при обережному помішуванні; 3 - перенесення гелю в ензимний Novex® буфер і інкубація спочатку при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, потім 16-18 годин при 37 °C; 4 - після закінчення інкубації гель промивають деіонізованою водою тричі по 5 хвилин і переносять на 1 годину у фарбувальний розчин SimplyBlue SafeStain, після чого двічі промивають у деіонізованій воді протягом 1 години. Для визначення активності матриксних металопротеїназ проводять сканування гелів і денситометрію з наступним розрахунком активності за допомогою програмного забезпечення ImageJ, порівнюючи площі піків дослідних проб з тестовим зразком. Ідентифікацію відповідних матриксних металопротеїназ проводять по стандартним зразкам з відомою молекулярною масою. Як тестовий зразок у той же гель завантажують розчинну рекомбінантну форму ферменту, активність якого досліджують. Недоліками цього способу є залежність від наявності готових наборів для зимографії, що випускаються фірмою Invitrogen (США), мають високу вартість і не завжди доступні клінічним лабораторіям, а також необхідність використання високоочищених препаратів матриксних металопротеїназ. Найбільш близьким до запропонованого способу дослідження активності желатиназ є застосування методу зимографії [Hajighasemi F., Hajighasemi S. Zymographic analysis of gelatinases patterns in peripheral blood mononuclear cells // Journal of Medicine and Medical Science-2011.- Vol. 2(6) - P. 904-909], що полягає у проведенні попереднього вертикального електрофорезу зразків супернатантів клітинних культур у 10 % поліакриламідному гелі (ПААГ), кополімеризованому з 2 мг/мл желатину в присутності 0,1 % додецилсульфату натрію (ДСН) протягом 3 годин при постійній напрузі 80 В. Зразки розводять буфером Леммлі з рН 6,8, що містить 10 мМ тріс, 7 М сечовину, 10 % гліцеролу, 1 % ДСН, залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин і потім вносять в лунки гелю для електрофорезу. Після закінчення електрофорезу гель на 1 годину поміщають у розчин 2,5 % Тритону Х-100 для видалення ДСН, потім переносять у ензимний розчин, що містить 0,1 М тріс-НСl, рН 7,4 і 10 мМ СаСl2, в якому інкубують гель протягом 18 годин при 37 °C. Забарвлювання здійснюють шляхом інкубації гелю у розчині 0,5 % Кумассі діамантового синього G250, 30 % метанолу та 10 % оцтової кислоти впродовж 3 годин, після чого знебарвлюють у суміші метанолоцтова кислота-вода (30:10:60). За допомогою денситометра розраховують відносну активність желатиназ відносно до контролю, як контроль використовують стандартний зразок з відомою активністю желатиназ. Недоліками 1 UA 83196 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цього методу є недостатня стандартизація умов проведення аналізу та його пристосованість для аналізу желатиназ лише у клітинних культурах. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу визначення активності желатиназ у плазмі та сироватці крові при різноманітних патологічних станах. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі визначення желатиназ, що включає електрофорез попередньо розведених у буфері Леммлі дослідних зразків у желатинполіакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію, промивку гелю Тритоном Х-100, інкубацію в ензимному буфері, фарбування у розчині Кумассі G250, знебарвлення розчином метанолоцтова кислота-вода, денситометрію гелю та розрахунок кількості желатиназ відносно стандартного зразка, згідно з корисною моделлю, зразки плазми крові попередньо інкубують при 37 °C впродовж 20 хвилин, розводять у співвідношенні 1:20 у забуференому фізіологічному розчині, додають у співвідношенні 1:1 буфер Леммлі, проводять електрофорез у 7,5 % поліакриламідному гелі з наступним переведенням обробленого гелю у цифровий формат та розраховують активність желатиназ за допомогою програми Sorbfil Videodensitometer 2.0, використовуючи як еталон пул плазми крові від 20 здорових донорів, активність желатиназ у якому прийнята за 100 %. Корисну модель, що заявляється, здійснюють наступним чином: 1. Підготовка дослідних зразків. Зразки плазми крові попередньо інкубують при 37 °C протягом 20 хвилин, розводять у 20 раз забуференим фізіологічним розчином, потім у співвідношенні 1:1 додають буфер Леммлі з рН 6,8, що містить 0,4 М тріс-НСl, 5 % ДСН, 20 % гліцеролу, 0,03 % бромфенолового синього. 2. Підготовка еталонного зразку. Венозну кров від достатньої кількості донорів (не менше 20) забирають у пластикові ємності з антикоагулянтом (цитрат натрію, ЕДТА, гепарин тощо) і отримують плазму кожного донора шляхом центрифугування впродовж 15 хвилин при 3000 об/хв. Однакові об'єми зразків плазми від 20 донорів ретельно перемішують до однорідної маси, отримуючи таким чином пул плазми, який розливають по 50 мкл у пластикові пробірки типу Епендорф і зберігають в аліквотах протягом 6 місяців при температурі -32 °C, а для більш тривалого зберігання - при -72 °C. Пул-плазму використовують як еталон, активність желатиназ в якому прийнята за 100 %. Для кожного електрофорезу використовують вміст однієї аліквоти, здійснюючи підготовку еталонного зразка, аналогічно такій для дослідних зразків (див. п. 1). Повторне заморожування-розморожування стандартних та дослідних зразків плазми не дозволяється. 3. Проводять вертикальний електрофорез досліджуваних зразків плазми крові у 7,5 % ПААГ в присутності 0,1 % ДСН, 2 мг/мл желатина, 1,5 М тріс-НСl, рН 8,8, 0,05 % персульфату амонію, 0,005 % TEMED. У кожну лунку гелю вносять по 20 мкл зразка, що підготований за п. 1, у центральну лунку - 20 мкл еталонного зразка, підготованого за п. 2. Як електродний буфер використовують розчин, що містить 0,025 М тріс, 0,192 М гліцин, 0,01 % ДСН рН 8,3. Електрофоретичне фракціонування відбувається у холодовій камері при 4 °C близько 4 годин при 20 мА. 4. Після закінчення електрофорезу гелі промивають 4 рази по 15 хвилин у розчині 2,5 % Тритону Х-100, потім інкубують 18-20 годин при 37 °C у ензимному буфері, що містить 0,025 М тріс-НСl, рН 7,5, 5 мМ СаСl2, 0,9 % NaCl, 0,05 % NaN3. 5. Для візуалізації отриманих результатів гелі фарбують Кумассі діамантовим синім G250, що розчинений у суміші метанолоцтова кислота-вода у співвідношенні 3:1:6. Враховуючи шкідливі властивості метанолу його дозволяється замінити 96 % етанолом. Потім гелі знебарвлюють 7 % оцтовою кислотою і зберігають у цьому розчині впродовж 2-3 діб при кімнатній температурі. Дія желатиназ проявляється як знебарвлені смуги на синьому фоні. 6. Гелі фотографують. Кількісний розрахунок активності желатиназ проводять за допомогою програми Sorbfil Videodensitometer 2.0, розраховуючи відсоток активності желатиназ відносно активності цих ферментів у еталонному зразку плазми, в якому активність желатиназ прийнята за 100 %. Як приклад на фігурі 1 представлено зимограму зразків плазми крові хворих на проліферативні захворюваннями крові, де за номерами 1-3 зразки плазми хворих на гострий мієлолейкоз, 4 - еталон, 5, 6 - плазма крові хворих на мієлому, 7-10 - плазма хворих на хронічний лімфолейкоз. Усереднені дані за результатами розрахунку відносної (у %) активності желатиназ у хворих на проліферативні захворювання крові графічно представлено на фігурі, де 1 - активність желатиназ у хворих на гострий мієлолейкоз; 2 - на мієлому; 3 - на хронічний лімфолейкоз. Запропонований спосіб визначення активності желатиназ характеризується високою чутливістю, простотою і доступністю реагентів та може бути використаний в клінічних і науково 2 UA 83196 U 5 10 15 дослідних лабораторіях. Перевагою способу є отримання достовірних результатів досліджень при невеликих витратах на проведення експерименту у порівнянні з зарубіжними аналогами. Технічний результат, що досягається при використанні корисної моделі, визначається використанням як еталона пулу плазм, активність желатиназ в якому для даної популяції усереднена завдяки змішуванню плазми значної кількості здорових донорів і приймається за 100 %. Використання пул-плазми як еталонного зразка дозволяє спростити аналіз, підвищити відтворюваність отриманих даних у порівнянні з запропонованими раніше способами. Розроблений спосіб може бути використаний у науково-дослідних роботах та в лабораторній діагностиці різноманітних патологічних станів. Перелік фігур креслення Додаток 1 Фіг. 1. Зимограма плазми крові хворих з проліферативними захворюваннями крові. Додаток 2 Фіг. 2. Відносна активність желатиназ (%) у хворих з проліферативними захворюваннями крові. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення активності желатиназ у плазмі крові людини, що включає електрофорез попередньо розведених у буфері Леммлі дослідних зразків у желатин-поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію, промивку гелю Тритоном Х-100, інкубацію в ензимному буфері, фарбування у розчині Кумассі G250, знебарвлення розчином метанолоцтова кислота-вода, денситометрію гелю та розрахунок кількості желатиназ відносно стандартного зразка, який відрізняється тим, що зразки плазми крові попередньо інкубують при 37 °C протягом 20 хвилин, розводять у співвідношенні 1:20 у забуференому фізіологічному розчині, додають у співвідношенні 1:1 буфер Леммлі, проводять електрофорез у 7,5 % поліакриламідному гелі з наступним переведенням обробленого гелю у цифровий формат та розраховують активність желатиназ за допомогою програми Sorbfil Videodensitometer 2.0, використовуючи як еталон пул плазми крові від 20 здорових донорів, активність желатиназ у якому прийнята за 100 %. 3 UA 83196 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4