Спосіб визначення плазміногену в плазмі крові

1. Спосіб визначення концентрації плазміногену, що включає визначення часу лізису фібринового згустку, одержаного з використання фібринмономеру, при активації плазміногену стрептокіназою, який відрізняється тим, що визначають час напівлізису згустку фібрину, за яким розраховують швидкість лізису згустку фібрину та визначають концентрацію плазміногену в плазмі крові за калібрувальною кривою залежності швидкості лізису фібринового згустку від концентрації плазміногену. 3 проферменту, а не його функціональної активності. Найбільш близьким за технічною суттю і результатом до корисної моделі, що заявляється, є спосіб визначення плазміногену за реєстрацією часу лізису фібринового згустку плазміногеном, активованим стрептокіназою, як джерело утворення фібринового згустку використовують фібринмономер, одержаний з фібриногену людини, в концентрації 1,0-10,0 г/л в присутності каоліну. Недоліками цього методу є візуальна реєстрація моменту повного лізису фібринового згустку та використання фібрин-мономеру, отриманого з фібриногену плазми крові людини, що збільшує вартість аналізу [11]. Задачею корисної моделі, що заявляється, є розробка високочутливого, простого у виконанні, автоматичного та економного способу визначення плазміногену в плазмі крові. Поставлена задача вирішується шляхом визначення часу напівлізису фібринового згустку плазміногеном, активованим стрептокіназою, з використанням турбідиметричного методу та автоматичною реєстрацією часу напівлізису фібрин-мономеру, одержаного з фібриногену бика, при концентрації 0,2 г/л у відсутності каоліну. В основі розробленого методу лежить реєстрація зміни світлорозсіювання в процесі полімеризації та гідролізу фібрину при довжині хвилі 350 нм. При внесенні фібрин-мономеру в нейтральне середовище відбувається його швидка полімеризація через утворення протофібрил без зміни оптичної густини середовища з наступною латеральною агрегацією протофібрил, яка супроводжується приростом оптичної густини при 350 нм. У присутності в цій системі плазміну або активованого плазміногену, відбувається лізис фібринового згустку, при цьому оптична густина зменшується. Із застосуванням турбідиметричного методу реєструють час напівлізису - проміжок часу від моменту початку утворення фібринового згустку до моменту зменшення на 50 % його максимальної оптичної густини при 350 нм (t½) та розраховують швидкість лізису фібринового згустку - величину, оборотну часу напівлізису згустку (1/t½). Відлік часу напівлізису фібринового згустку починають з моменту внесення в реакційне середовище фібринмономеру. Зміни світлорозсіювання реєструють автоматично. Приклад. А) Кров з ліктьової вени відбирають в пластикову пробірку, що містить 3,8 %-й розчин цитрату натрію, у співвідношенні 9:1, центрифугують протягом 7 хв. при 1000 об./хв. (240 g), відцентрифуговану плазму крові переносять в іншу пробірку та повторно центрифугують протягом 15 хв. при 3000 об./хв. (1200 g). Одержану бідну на тромбоцити плазму крові людини в кількості 1 мл наносять на афінний сорбент лізин-сефарозу 4В. Неспецифічно адсорбовані компоненти плазми відмивають 0,1 М фосфатним буфером (рН 7,4). Специфічно зв'язаний плазміноген елююють 0,05 М фосфатним буфером (рН 7,4), з 0,1 М 6-аміногексановою кислотою (6-АГК). Вміст плазміногену визначають 65219 4 спектрофотометрично, вимірюючи різницю величин оптичної густини при довжині хвилі 280 та 320 нм. Концентрацію плазміногену в елюаті визначають, використовуючи коефіцієнт абсорбції 17,0 (1 %, 1 см). Визначена концентрація плазміногену в плазмі крові складає 145 мкг/мл. Далі плазму крові з визначеним вмістом плазміногену використовують для побудови калібрувальної кривої. Б) Фібрин-мономер без домішок плазміногену одержують із фібриногену бика в присутності 6АГК та п-хлормеркурійбензоату натрію. В) Для побудови калібрувальної кривої у термостатовану кювету при температурі 37°С вносять від 7 до 28 мкл плазми крові, що містить від 1 до 4 мкг плазміногену, одержаного в п. А прикладу, стрептокіназу з розрахунку 5 МО на 1 мкг плазміногену та 0,05 М трис-HCl буфер (рН 7,4), 0,13 М NaCl, 0,001 М СаСl2. Утворення фібринового згустку ініціюють внесенням у реакційну суміш 20 мкл 1 %-го розчину фібрин-мономеру. Загальний об'єм реакційної суміші складає 1 мл. Реєструють максимальне значення оптичної густини реакційної суміші при довжині хвилі 350 нм та час його зниження на 50 % (t½, с) і розраховують швидкість -1 лізису фібринового згустку (1/t½, с ). Будують калібрувальну криву залежності швидкості лізису згустку фібрину від концентрації плазміногену (креслення). Г) Для визначення рівня плазміногену в крові в термостатовану при температурі 37°С кювету вносять по 20 мкл досліджуваного зразка плазми крові, 20 мкл робочого розчину стрептокінази (15 МО), 940 мкл 0,05 М трис-НСl буферу (рН 7,4), 0,13 М NaCl, 0,001 М СаСl2. Утворення фібринового згустку ініціюють додаванням 20 мкл розчину фібринмономеру. Реєструють максимальне значення оптичної густини при довжині хвилі 350 нм та час його зниження на 50 % (t½, с) і розраховують шви-1 дкість лізису фібринового згустку (1/t½, с ). За калібрувальною кривою знаходять концентрацію плазміногену в досліджуваній плазмі крові, використовуючи розрахункову формулу: Пг=Р×50, де: Пг - концентрація плазміногену, мкг/мл; Р - кількість плазміногену, визначена за калібрувальною кривою в 1 мл реакційної суміші, мкг/мл; 50 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл плазми крові. Концентрація плазміногену в досліджуваній плазмі крові, визначена способом, що заявляється, складає 138 мкг/мл. Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє визначати вміст плазміногену в плазмі крові в нормі та при патологіях і має ряд переваг порівняно з найближчим аналогом, а саме: - дозволяє автоматично з великою точністю визначити час напівлізису фібринового згустку; - джерелом фібринового згустку є фібринмономер без домішок плазміногену, одержаний з фібриногену бика; - концентрація фібрин-мономеру в реакційному середовищі складає 0,2 г/л, що менше від концентрації фібрин-мономеру в найближчому аналогу від 5 до 50 разів; 5 - забезпечує високу точність та відтворюваність результатів, стандартне відхилення складає близько ± 5%. Джерела інформації 1. Castellino F.I., Powell J.R. // Meth. Enzymol. 1981. - vol. 80. - p. 365-378. 2. Баркаган З.С., Момот А.П., Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед, 2001. - 285 с. 3. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО Издательство «Триада», 2005. - 227 с. 4. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: Медицина, 2006. - 544 с. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 65219 6 5. Carrel R., Boswell D. Proteinase inhibitors. Eds by Barrett A., Salvesen G.Elsevier. - Amsterdam 1986. - Р. 403-420. 6. Титаева Е.В., Добровольский А.Б, Титов В.Н. Турбидиметрический метод определения плазминогена. - Лабораторное дело. - 1991. - № 1. - С. 32-35. 7. Хромо-Тех-плазминоген, тест-набор, ООО Фирма «Технология-Стандарт», кат. № 092, РФ. 8. Реахром-плазминоген, тест-набор, НПО РЕНАМ, кат. ФА-2, РФ. 9. ЗАО «Лабораторная диагностика», Plasminogen Hemosil, кат. № 2009000. 10. TriniCHROM Plasminogen (Tcoag, Ирландия), ТВ Т2605. 11. Пат. РФ 2189590, 20.09.2002. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601