Поліпшений спосіб одержання екстрактів ginkgo, що мають низький вміст 4′-о-метилпіридоксину

1. Спосіб одержання екстракту Ginkgo biloba із зменшеним вмістом 4'-О-метилпіридоксину, що має наступні стадії: a) екстрагування листя Ginkgo biloba, використовуючи водний розчин ацетону, водний розчин алканолу, що має 1-3 атоми вуглецю, або безводний метанол, b) відокремлення органічного розчинника, концентруючи розчинник до вмісту не більше 10 мас. %, де вода може бути додана під час заключних стадій дистиляції, c) розбавлення залишкового водного розчину водою до вмісту сухого залишку 5-25 мас. %, охолодження до температури нижче 25 °С і відстоювання до утворення осаду, d) обробка водного залишкового розчину сульфатом амонію й наступне екстрагування принаймні один раз, використовуючи метилетилкетон або суміш метилетилкетону й ацетону, e) концентрування отриманого екстракту й розбавлення водно-етанольною сумішшю, щоб одержати розчин, що містить 50 мас. % води й 50 мас. % етанолу при вмісті сухого залишку 10 мас. %, 2 (19) 1 3 84519 20-30 мас. % - флавоноїди, вибрані із групи, що включає кверцетин, кемпферол та глікозиди ізорамнетину, 4,5-8,5 мас. % - терпенлактони й менше ніж 10 ppm гінкголевих кислот. 13. Екстракт за будь-яким з пунктів 7-11, який відрізняється наступним вмістом: 22,0-27,0 мас. % - флавоноїди, вибрані із групи, що включає кверцетин, кемпферол та глікозиди ізорамнетину, 5,0-7,0 мас. % - терпенлактони й не більше 5 ppm гінкголевих кислот. 14. Екстракт за будь-яким з пунктів 7-11, який відрізняється наступним вмістом: 22,0-27,0 мас. % - флавоноїди, вибрані із групи, що включає кверцетин, кемпферол та глікозиди ізорамнетину, Даний винахід відноситься до поліпшеного багатостадійного способу одержання екстракту Ginkgo biloba із зменшеним вмістом 4'-О-метил піридоксину та/або біфлавонів, де деплеція здійснена фільтрацією на абсорбційній смолі та/або іоніті, і речовини, які будуть вилучені, утримуються на смолі. Винахід, крім того, відноситься до екстракту Ginkgo biloba, що має зменшений вміст 4'-Ометил піридоксину та/або біфлавонів, одержаний способом відповідно до представленого винаходу, так само як до його використання. В останні десятиліття екстракти із листя Ginkgo biloba використовуються як медикамент. Вони в цей час використовуються для лікування різних типів та її симптомів, так само як розладів церебральної й периферичної циркуляції крові. Інгредієнти, чия ефективність пов'язана з терпенлактонами (гінкголіди А, В, і C і білобаліди) так само як глікозиди флавонів (кверцетин, кемпферол і ізорамнетин). Однак, листя Ginkgo biloba також містять компоненти, які не сприяють бажаній ефективності, але які можуть бути відповідальними за ризики й побічні ефекти. На додаток до неполярних інгредієнтів рослини, таким як гінкголеві кислоти, ті компоненти - 4'-О-метил піридоксин та біфлавони. У екстракті Ginkgo, що є ефективним і у той же самий час настільки ж безпечний, наскільки можливо, й настільки ж має незначні побічні ефекти наскільки можливо, ці сполуки таким чином не повинні бути присутніми в великій кількості. 4'-О-метил піридоксин може викликати симптоми отруєння, такі як конвульсивні напади й несвідомий стан. Таким чином, ця сполука також згадується як гінкготоксин. Біфлавони, що містяться в Ginkgo, показують іммунотоксичний потенціал і можуть виявити контактну алергію. Ці біфлавони, що містяться в Ginkgo, є переважно сполуками: аментофлавон, білобетин, гінкгетин, ізогінкгетин і сціадопітизин. 4 2,8-3,4 мас. % - гінкголіди А, В і С усього, 2,6-3,2 мас .% - білобалід і не більше 5 ppm гінкголевих кислот. 15. Застосування екстракту за будь-яким з пунктів 7-14 для виробництва продукту для лікування деменції та її симптомів та/або церебральних або периферичних дисциркуляторних розладів. 16. Застосування за п. 15, де продуктом є медикамент. 17. Застосування за п. 15, де продуктом є харчовий продукт. 18. Продукт, який характеризується вмістом екстракту Ginkgo за будь-яким з пунктів 7-14. 19. Продукт за п. 18, який є медикаментом. 20. Продукт за п. 18, який є харчовим продуктом. 4'-0-метил піридоксин: Біфлавони: Аментофлавон: R1=R2=R3=H Білобетин: R1 = R3 =Н, R2 =ОСН3 Гінкгетин: R3 =Н, R1 =R2=OCH3 Ізогінкгетин: R1=H, R 2=R3=OCH3 Сціадопітизин: R1 =R2 R3 =ОСН3 Способи деплеції 4'-О-метил піридоксину й біфлавонів так само як і одержання екстрактів уже описані в EP 1 037 646 В1 Там, 4'-О-метил піридоксин утримують, використовуючи кислий катіоніт і біфлавони адсорбуються на активованому вугіллі Переважно ці стадії деплеції здійснюються після стадії f) Спосіб згідно EP 1 037 646 В1 (сторінка 3), тобто, після ‘’оброблення розчину сполукою свинця або нерозчинним поліамідом’’ Спосіб EP 1 037 646 В1 заснований на способі, спочатку описаному в DE39 40 091C2. В EP 1 037 646 В1 деплеції біфлавонів і 4'-Ометил піридоксину виконано в стадії способу (стадія f)), де присутній відносно високий вміст солей свинця і солей амонію, таким чином, повинна використовуватися збільшена кількість іоніту. Крім того, деплеції біфлавонів і 4'-О-метил піридоксину описані й заявлені тільки в комбінації. 5 84519 Однак, залежно від меж, які будуть можливо встановлені в майбутньому й через вимогу настільки ж низької модифікації композиції екстракту наскільки можливо, може бути бажаним видалення біфлавонів або тільки 4'-О-метил піридоксину. Крім того, вміст менше, ніж, 50 ррт 4'-О-метил піридоксину і менше, ніж, 100 ррт біфлавонів, які заявлені в EP 1 037 646 В1, є усе ще порівняно високим. Починаючи з EP 1 037 646 В1 не описаний порівняльний приклад, також фактичний ступінь деплеції, досягнутої в Прикладах 2 і 3, не може бути помічений в цьому посиланні. Таким чином, об'єктом, що лежить в основі представленого винаходу, є забезпечення способу одержання екстрактів Ginkgo, що мають низький вміст 4'-О-метил піридоксину та/або низький вміст біфлавонів, які не мають вказаних вище переваг і, зокрема, коли використовують добре придатні для повторного використання та/або економні адсорбенти, що приводить до вмісту 4'-О-метил піридоксину менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт і, особливо переважно менше, ніж 2 ррт та/або вміст біфлавонів менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт і особливо переважно менше, ніж, 5 ррт, що надає екстракти, що мають переважний вміст флавоноїдів 20-30ваг.% (особливо переважно 22.0 - 27.0%), терпен-лактонів 4.5 8.5мас.% (особливо переважно 5.0-7.0%, переважно 2.8-3.4%, гінкголідів А, В і C і 2.6 - 3.2% білобалід) і гінкголевих кислот (не більше 5 ррт), де згадуваний вміст флавоноїдів 22.0 - 27.0%, терпен-лактонів 5.0 - 7.0% (2.8 - 3.4% їх гінкголідів А, В і C і 2.6 до 3.2% білобаліду), і гінкголевої кислоти (не більше 5 ррт) відповідають вимозі німецької Фармакопеї 2003 („Deutsches Arzneibuch", DAB). Згідно DAB флавоноїди визначають у формі кверцетину, кемпферолу та ізорамнетину після кислотного гідролізу й обчислюють як флавоноїдні глікозиди. Цей об'єкт винаходу може бути вирішений, відокремлюючи біфлавони, використовуючи адсорбційні смоли та/або відділення 4'-О-метил піридоксину через кислі іоніти. Щоб одержати екстракти відповідно до представленого винаходу, переважно здійснюють наступний спосіб, де а) стадії а) - і) так само як і m) уже, власне кажучи, описані в DE 39 40 091 С2, повний зміст розкриття яких, особливо щодо деталей способу, повинен бути включений в дану заявку посиланням: а) екстракція листів Ginkgo biloba (препарат) при температурі 20-100°C, переважно 40-60°C, використовуючи ацетон, що містить воду 2090мас.%, водо-місткий алканол, що має 1 - 3 атомів вуглецю (метанол, етанол, н-пропанол і ізопропіловий спирт) і вміст 20-90мас.% безводного метанолу, де співвідношення препарагрозчинник становить 14 -1:20, переважно, 1:5 до 1:10, b) відокремлення органічного розчинника, випаровуючи розчинник до вмісту не більше 10мас.% (переважно не більше 5мас.%), де вода може бути додана під час заключних стадій дистиляції, c) розбавлення водного остаточного розчину, водою до вмісту твердої речовини 5-25мас.% (переважно 15-20мас.%), охолодження розчину до 6 температури нижче°25C (переважно приблизно 10-12°C) і відстоювання водного остаточного розчину до утворення осаду, d) оброблення водного остаточного розчину сульфатом амонію (переважно до вмісту 40мас.%, особливо переважно 25 - 35мас.%) і наступне екстрагування розчину принаймні один раз, використовуючи метилетилкетон або суміш метилетилкетону й ацетону (переважно у співвідношенні 9:1 4:6, особливо 6:4), e) концентрування отриманого екстракту (переважно до сухого залишку 50 - 70мас.%) і розбавлення екстракту сумішшю етилового спирту й води, щоб одержати розчин, що містить 50мас.% води й 50мас.% етанолу і сухий залишок 10мас.%, f) обробка розчину сполукою свинця (переважно ацетатом свинця, ацетатом гідроксиду свинцю (2), нітратом свинця (2) або водною суспензією гідроксиду свинцю), поки не відбудеться зміна в кольорі від коричневого до умбри, або нерозчинним поліамідом (переважно поліамід 6, поліамід 6,6 або поперечно зшитий полівінілпірролідон), g) екстракція відфільтрованого розчину, використовуючи аліфатичний або циклоаліфатичний розчинник, що має точку кипіння 60 - 100°С, h) концентрування водно-спиртового остаточного розчину, з наступною обробкою розчину сульфатом амонію й екстракцією розчину метилетилкетоном та етиловим спиртом, (розчин переважно концентрують під зниженим тиском до вмісту етилового спирту приблизно не більше 5%, додають сульфат амонію до вмісту 20мас.% й екстрагують розчинником у співвідношенні 8 2 до5.5, переважно 6:4), і) концентрування отриманої органічної фази до сухого залишку 50 - 70мас %, к) розчинення концентрату у водному алканолі, що має 1-3 атомів вуглецю й довільно фільтрування продукту, І) фільтрація на абсорбційній смолі та іоніті, де речовини, які будуть вилучені, утримуються на смолі й m) висушування концентрату (переважно при максимальній температурі 60-80°C) під зниженим тиском, щоб одержати сухий екстракт, що має вміст води менше, ніж 5%. Перевагою способу відповідно до представленого винаходу є здійснення стадії деплеції наприкінці способу. Таким чином, менша кількість іоніту повинна використовуватися й одержується особливо низький вміст 4'-О-метил піридоксину, біфлавонів. Переважні абсорбційні смоли в стадії І) є смоли на основі довільно заміщених стирол/дивінілбензолів, такими як Diaion НР-20, НР21 або SP Sepabeads 207 і SP 850. Переважні іоніти - сильно кислі іоніти, такі як Merck я або Amberlite IR-120. Фільтрація довільно включає звичайне ополіскування, використовуючи додатковий розчинник. Водний алканол у стадії к) є водним метанолом, етиловим спиртом, н-пропанолом або ізопропіловим спиртом, що має вміст 2090мас.%, відповідно, переважно водний етанол, концентрацією 40 - 60мас.% є особливо переважним. 7 84519 Предмет представленого винаходу - екстракти, зокрема, сухі екстракти, які одержують способом відповідно до представленого винаходу і які мають наступний вміст: · менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт і особливо менше, ніж 2 ррт 4'- О-метил піридоксину та/або · менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт і особливо, менше, ніж 5 ррт біфлавонів. Крім того, предмет представленого винаходу екстракти, зокрема сухі екстракти, які одержують способом відповідно до представленого винаходу і які мають наступний подальший вміст: · 20-30мас.%, переважно 22.0 - 27.0мас.% флавоноїди, · 4.5 - 8.5мас.%, переважно 5.0 - 7.0мас.% терпен-лактони й · менше, ніж 10 ррт, переважно не більше, чим 5 ррт - гінкголеві кислоти. Подальший предмет представленого винаходу - екстракти, зокрема сухі екстракти, які одержують способом відповідно до представленого винаходу і які показують наступний вміст: · 20-30мас.%, переважно 22.0 - 27.0мас.% флавоноїди, · 2.5 до 4.5мас.% - гінкголіди А, В і C загалом, переважно 2.8 - 3.4мас.% гінкголіди А, В і C загалом, · 2.0 - 4.0мас.%, переважно 2.6 - 3.2 мас.% білобаліди, · менше, ніж 10 ррт, переважно не більше, чим 5 ррт гінкголеві кислоти й · менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт, особливо переважно менше, ніж 2 ррт 4'-Ометил піридоксину та/або · менше, ніж 20 ррт, переважно менше, ніж 10 ррт і особливо переважно менше, ніж 5 ррт - біфлавони. Відповідно до Європейської Фармакопеї, сухі екстракти взагалі мають сухий затишок принаймні 95мас.%. Екстракти відповідно до представленого винаходу можна призначати у формі порошків, гранул, таблеток, драже або капсул, переважно перорально. Щоб одержати таблетки, екстракт змішують з фармацевтично прийнятними ад'ювантами, такими як лактоза, целюлоза, діоксид кремнію, кроскармелоза і стеарат магнію й пресують у таблетки, які довільно вкривають прийнятною оболонкою, виготовленою з, наприклад, гідроксиметилцелюлози, поліетиленгліколю, пігментів (таких, як двоокис титану, окис заліза) і тальку. Екстракт відповідно до представленого винаходу може також бути заповненеий у капсули, довільно при додаванні ад'ювантів, таких як стабілізатори, наповнювачі й т.п. Призначувана доза - 1-2000мг, переважно 50-1000мг, і особливо переважно 100-500мг екстракту на добу. Крім того, предмет представленого винаходу медикамент, харчові продукти або інші препарати, які містять ці екстракти довільно в комбінації з іншими речовинами, такими як активні інгредієнти та/або ад'юванти Термін „харчовий продукт" як використовується тут, особливо стосується дієти 8 чних продовольчих продуктів, дієтично збагачених продуктів, так само як і харчування за медичними показаннями й дієтичних добавок. Приклади Одержання розчину екстракту, використовуваного в Прикладах 1 і 2, також як у Порівняльних Прикладах 1 і 2. Висушене листя Ginkgo biloba (препарат) екстрагували при температурі приблизно 50°C, використовуючи сім частин їхньої ваги (ваг/ваг) (тобто співвідношення розчинника до препарату 1:7) сумішшю ацетон/вода 60/40 (ваг/ваг) (стадія а)). Органічний розчинник у значній мірі відділяли від екстракту (стадія b)), і залишок концентрували, водний розчин розбавляли водою до сухого залишку приблизно 10мас.%. Розчин охолоджували до температури приблизно 12°C при перемішуванні, і одержаний осад вилучали (стадія с)). Приблизно 30мас.% сульфату амонію додавали до водного остаточного водного розчину, і одержаний розчин екстрагували, використовуючи суміш метилетилкетону й ацетону у відношенні 6:4 (стадія d)). Отриманий екстракт в значній мірі концентрували, і концентрат розбавляли водою й етиловим спиртом таким чином, що був о триманий (стадія є)) розчин, що містить 50мас.% води й 50мас.% етанолу при вмісті сухого залишку приблизно 10мас.%. Розчин відфільтровували і фільтрат додавали до водного розчину ацетату гідроксиду свинцю(2) (стадія f)). Після подальшої фільтрації водно-спиртовий розчин екстрагували гептаном (стадія g)). Згодом, залишковий водно-спиртовий розчин концентрували під зниженим тиском до вмісту етилового спирту приблизно 5%, і сульфат амонію додавали таким чином, що досягався вміст приблизно 20мас.% від вмісту води. Отриманий розчин екстрагували, використовуючи суміш метилетилкетону й етилового спирту у відношенні 6:4 (стадія h)). Одержану органічну фазу концентрували (сухий залишок приблизно 55мас.%) (стадія і)). Потім продукт розбавляли етиловим спиртом і водою таким чином, що був отриманий розчин, який має вміст етилового спирту приблизно 75% і сухий залишок приблизно 15%, (стадія k)). Приклад 1: екстракт Гінкго, що має зменшений вміст 4'-О-метил піридоксину 1249г розчину екстракту, отриманого відповідно до способу одержання, описаному вище, відкоригований водою до вмісту етилового спирту приблизно 40% (ваг/ваг) і застосовували до 50мл (відповідно 0.28 мл/г сухого екстракту) Amberlite IR-120 (сильно кислий іоніт) (колонка: приблизно 2 х 16.5см; швидкість потоку: приблизно 8мл/хвилина) (стадія I)), з наступним промиванням з 200 мл 50%-ого етилового спирту (ваг/ваг). Одержаний розчин концентрували на роторному випарнику й висушували при вакуумі при°50 C (стадія m)): 179.4 р. Як видно із наступної таблиці, вміст 4'-О-метил піридоксину 0.4 ррт досягали, власне кажучи, не змінюючи вміст інгредієнтів, які є релевантними щодо ефективності. 9 84519 Порівняльний Приклад 1: екстракт Гінкго без деплеції відповідно до стадії І) представленого винаходу 98.4г розчину екстракту, використовуваного в Прикладі 1 концентрували -випаровуванням і висушували в вакуумі при 50°C: 14.7г. Приклад 2а): екстракт Гінкго, що має зменшений вміст біфлавонів 500г розчину екстракту, отриманого відповідно до способу одержання, описаному вище, розбавляли водою до вмісту етилового спирту приблизно 40% (ваг/ваг) і застосовувалися до 400мл (відповідно 5.7мл/г сухого екстракту) Sepabeads SP 850 (адсорбційна смола) (колонка: приблизно 4 х 32см; швидкість потоку: приблизно 8 мл/хвилини) (стадія I)), з наступним промиванням із приблизно 2л 40% етилового спирту (ваг/ваг) загалом. 10% одержаного розчину (259.3г) концентрували на роторному випарнику й піддавали сублімації (стадія m)): 6.92г. Залишковий розчин 90% використовували в Прикладі 2b). Як видно із наступної таблиці, був досягнутий вміст біфлавонів менше, ніж 1 ррт, відповідно, власне кажучи, не змінюючи вміст інгредієнтів, які є релевантними щодо ефективності. Приклад 2b): екстракт Гінкго, що має зменшений вміст 4'-О-метил піридоксину і біфлавонів 90% розчину, отриманого в Прикладі 2а) (2334.1 g) застосовували до 25мл (відповідно 0.40мл/г сухого екстракту) Amberlite IR-120 (сильно кислий іоніт) (колонка: приблизно 1.5 х 11см; швидкість потоку: приблизно 10мл/хвилина) (стадія I)), з наступним промиванням 100мл 40% етилового спирту (ваг/ваг). Одержаний розчин, концентрували на роторному випарнику й піддавали сублімації (стадія m)): 61.67 р. Як видно із наступної таблиці, був досягнутий вміст 4'-О-метил піридоксину 0.4 ррт і вміст біфлавонів менше, ніж 1 ррт, відповідно, власне кажучи, не змінюючи вміст інгредієнтів, які є релевантними щодо ефективності. Порівняльний Приклад 2: екстракт Гінкго без деплеції відповідно до стадії І) представленого винаходу 50г розчину екстракту використовуваного в Прикладі 2а), концентрували випаровуванням і піддавали сублімації: 7.05г. Порівняльний Приклад 3: екстракт Гінкго з деплецією біфлавонів і 4'-О-метил піридоксину після обробки сполукою свинця (стадія f)) згідно EP 1 037 646 В1 Висушені листя Ginkgo biloba (препарат) екстрагували при температурі приблизно 50°C використовуючи їхню вагу семикратно (ваг/ваг) (тобто співвідношення розчинник/ препарат 1:7), із сумішшю ацетон/вода 60/40 (ваг/ваг). Органічний розчинник був у значній мірі відділений від екстракту і залишок концентрували, водний розчин розбавляли водою до сухого залишку приблизно 10мас.%, охолоджували до температури приблизно 12°С при перемішуванні і одержаний осад вилучали. Приблизно 30мас.% сульфату амонію додавали до водного остаточного розчину і утворений 10 розчин екстрагували, використовуючи суміш метилетилкетону й ацетону у співвідношенні 6:4. Отриманий екстракт в значній мірі концентрували, і концентрат, отриманий таким способом, розбавляли водою й етиловим спиртом таким чином, що був отриманий розчин, який містить 50мас.% води й 50мас.% етанолу при вмісті сухого залишку приблизно 10мас.%. Розчин відфільтровували, фільтрат додавали до водного розчину ацетату гідроксиду свинцю (2) і фільтрували знову (стадія f)). 150мл розчину, отриманого таким способом (частина сухо го екстракту : 7.1%; вміст етилового спирту: приблизно 50%), перемішували з 2.5г (відповідно 0.17г/г кінцевого продукту) активованого вугілля протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Фільтрат застосовували до колонки з 4.2мл (відповідно 0.28мл/г кінцевого продукту) сильно кислого катіоніту (Merck I). Колонку іоніту промивали 4 х 5мл EtOH (50%). Комбіновані елюати екстрагували, використовуючи зтрушування 3 х 70мл н-гексану. Фазу етанол/вода концентрували на роторному випарнику й розбавляли водою до 100г Розчин екстракту, отриманий таким способом, екстрагували 1 х 40мл, 2 х 30мл і 1 х 2 мл сумішшю метилетилкетон/етанол у співвідношенні 3:2, де додавали 15г сульфату амонію, щоб досягти розподілу фаз. Органічну фазу перемішували протягом 1год при кімнатній температурі після додавання 25г сульфату амонію . Відділяли нерозчинений сульфат амонію, також як одержану водну фазу. Розчин екстракту концентрували на роторному випарнику при 50°C і висушували у вакуумі при 60°C: 14.8г. Як видно із наступної таблиці, вміст 4'-О-метил піридоксину - 52 ррт і вміст біфлавонів - 31.3 ррт, таким чином, досягнуто значно більш високий вміст і нижчі результати деплеції в порівнянні із Прикладом 2b) відповідно до представленого винаходу. Визначення вмісту флавоноїдів, терпенлактонів й гінкголевих кислот, наведених у Таблиці 1, здійснювали відповідно до DAB. Кількісне визначення 4'-О-метил піридоксину було виконано за допомогою BEPX(HPLC) і флюоресценцію визначали після збагачення через Sep Рак Плюс картриджі С18, з наступним збагаченням через Bond Elut LRC-SCX картриджі, де Phenomenex Prodigy 5 u 3 колонки BEPX(HPLC) і градієнт трифторукспероральной кислоти (р фактор 2) метанол = 9:1 (об./об.)® метанол, використалися. Визначення вмісту біфлавонів, наведених в Таблиці 1, було виконано за допомогою BEPX(HPLC) і УФ-спектрофотометрії при 340 нм через Water Nova Pak, колонка С18, використовуючи градієнт вода:ацетонітрил 9:1 (об./об.) + 0.3% за об'ємом фосфорної кислоти (85 %) ® ацетонітрил + 0.3% за об'ємом фосфорної кислоти. У кожному випадку калібрування виконували, використовуючи речовини-еталони, що мають високу, певну марку чистоти. 11 Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 84519 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601