Отримання екстракту з ембріонів курей

Реферат: Спосіб отримання екстракту з ембріонів курей, який включає інкубування протягом 9 діб, гомогенізацію, центрифугування, причому екстракт отримують лише з ембріонів курей з наступним їх заморожуванням в рідкому азоті за температури -196 °C, та виключає стадії фракціонування та опромінення. UA 85646 U (54) ОТРИМАННЯ ЕКСТРАКТУ З ЕМБРІОНІВ КУРЕЙ UA 85646 U UA 85646 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості, а саме до виготовлення біологічно активних речовин з сировини тваринного походження. Прогресуючий ріст захворювань людей та тварин, зумовлений екологічними, зоогігієнічними і соціальними чинниками, висуває проблему створення лікарських засобів для корекції метаболізму, імунітету, а також для профілактики оксидативного стресу, в одну з найважливіших в медицині і ветеринарії. На сьогодні, як в наукових дослідженнях, так і в практичній медицині, фармакології і ветеринарії актуальним стає отримання і використання препаратів з природної сировини, які мають біостимулюючі та антиоксидантні властивості. Варіантами джерел для отримання таких препаратів є кордова кров, фетальні тканини та ембріональні клітини, які містять у своєму складі комплекс ростових факторів, цитокінів та інших біологічно активних речовин, що забезпечують швидкий ріст і диференціювання тканин, мають стимулюючий вплив на клітинний метаболізм [Гальченко С.Е. Екстракти кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів: одержання та біологічна дія./С.Е. Гальченко// Проблеми кріобіології. 2005. - Т. 15, № 3. - С. 403-406.]. Біологічні препарати нормалізують метаболічні процеси в організмі, мають антиоксидантні властивості та є універсальними імунокоректорами, що і визначає їх основну роль підвищувати стійкість організму до дії несприятливих ендогенних і екзогенних факторів при різних формах патології. Такі препарати сприяють створенню в організмі найбільш сприятливих умов для прояву його власних захисних механізмів і компенсаторних можливостей, корекції метаболічних порушень [Дегтяренко Т.В., Макулькин Р.Ф. Биогенные стимуляторы и иммунореактивность: В 2 т. - Одесса: Маяк, 1997 Мельников Н.В., Вахитов Р.В., Кигамов Ф.Н. Использование метода криоструктурирования в призводстве органопрепаратов./ Мельников Н.В., Вахитов Р.В., Кигамов Ф.Н. // Здравоохранение Башкортостана. - 2002. - № 2. - С. 64-66]. З літературних даних відомо, що ембріональні тканини мають сильну імуностимулюючу, протекторну, регенераторну та метаболічну дію. Тому пошук і розробка препаратів, що мають широкий спектр різних біологічних ефектів з мінімальною кількістю побічних, є актуальним і перспективним напрямом досліджень [Мысачева В.И. Влияние препаратов на основе эмбриональных тканей кур на иммунную систему / В.И. Мысачева, В.В. Хомов, А.А. Сизов и др. // Ветеринария. - 1995. - № 11. - С. 46-47]. Відомий спосіб переробки плаценти (Спосіб переробки плаценти). Він включає подрібнення, екстракцію за допомогою органічних реагентів та розділення екстракту на окремі фракції. При цьому в одній фракції міститься ліпідний комплекс, а в іншій - концентрат амінокислот та пептидів. Але використання високотоксичних реагентів в даному методі переробки біологічного матеріалу, а також розділення екстракту на окремі фракції може знижувати його ефективність. Відомий спосіб переробки ембріональної сировини (Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей). Він включає подрібнення тільки м'яких ембріональних тканин, їх гомогенізацію у дисперсійному середовищі до руйнування мембран клітин, фракціонування супернатату з виділенням цільового продукту зі середньою мол. масою менше 10 кДа, стерилізацію та розлив препарату. Недоліком цього способу є проблема отримання ембріональної сировини, окрім того нечітка визначеність джерела ембріональної сировини робить невизначеним біохімічний склад препарату. Також відомий спосіб переробки ембріонів птиці (Способ получения нуклеопротеидих комплексов из эмбрионов птиц). Для отримання нуклеопротеїдних комплексів автори відмивають ембріонів птиці в ізотонічному розчині, далі гомогенізують при 8000 об/хв, потім центрифугують, а супернатат пропускають через поліамідні волокна зі селективністю 5kDa. Далі концентрат знову центрифугують та ліофільно висушують. Спосіб відрізняється складністю та багатоступінчатостю виготовлення лікувального засобу. Невизначеність строків інкубації та джерела ембріональної сировини робить невизначеним склад препарату. Найбільш близьким технічним рішенням до корисної моделі, що пропонується, є спосіб отримання біостимулятора ембріонального (Способ приготовления бостимулятора ембрионального), що включає інкубування курячих яєць протягом 9 діб, опромінення на 5, 6 та 7 добу по 30 хвилин з частотою модуляції 9 Гц та силою випромінювання 9 мВт, охолодження протягом 6-7 діб, гомогенізацію яйцевої маси та стабілізування отриманого гомогенату 0,3 % розчином фенолу. Але отримання імунобіологічного препарату даним способом потребує використання спеціального обладнання, а також відрізняється багатоступінчатістю процесу. Тому, задачею корисної моделі є удосконалення отримання високоефективних екстрактів з ембріонів курей, що будуть містити амінокислоти, пептиди та ліпіди. Поставлена задача вирішується тим, що за даним способом переробки ембріонів курей, який включає інкубування протягом 9-ти діб, гомогенізацію, центрифугування, згідно з корисною 1 UA 85646 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 моделлю, екстракт отримують лише з ембріонів курей з наступним їх замороженням в рідкому азоті за температури -196 °C, та виключає стадії фракціонування та опромінення. Приклад конкретного виконання Екстракт отримували з ембріонів 9-ти діб розвитку. Вибір цього терміну інкубації був зумовлений літературними даними про те, що саме в період першої третини ембріонального розвитку спостерігається найвища імунологічна активність ембріональних клітин і [Мысачева В.И. Влияние препаратов на основе эмбриональных тканей кур на иммунную систему / В.И. Мысачева, В.В. Хомов, А.А. Сизов и др. // Ветеринария. - 1995. - № 11. - С. 46-47]. Відразу після виїмки яєць з інкубатора їх овоскопували і відбирали необхідну кількість тих, що відповідали цьому терміну розвитку ембріонів. Ембріони витягали з шкаралупи, відділяли від амніотичних оболонок та тричі промивали ізотонічним розчином хлористого натрію. Ембріони заморожували в рідкому азоті при -196 °C. Розморожування проводили повільно на водяній бані при температурі 37 °C. Далі ембріони гомогенізували в скляному гомогенізаторі Поттера при 4 °C. Подрібнення ембріонів проводили в суміші розчинів ізотонічного хлористого натрію і фосфатного буфера в співвідношенні 1:1. Далі гомогенат центрифугували при 900 g при кімнатній температурі. Центрифугат фільтрували за допомогою фільтрів Millex PVDF. Отримували екстракт з ембріонів курей, що є напівпрозорою рідиною рожевого кольору. Після визначення амінокислотного складу було встановлено, що екстракт з ембріонів курей містить незамінні (треонін - 2,09, валін - 3,15, метіонін - 1,92, ізолейцин - 2,56, лейцин - 3,68, фенілаланін - 2,86, лізин -2,88 мг/100 мг), напівзамінні (цистин - 2,03, гліцин - 1,17, тирозин 1,07, гістидин - 0,97, аргінін - 2,54 мг/100 мг) і замінні (серин - 4,11, аспарагінова кислота - 5,03, глютамінова кислота - 7,15, аланін - 3,12, пролін - 1,97 мг/100 мг) амінокислоти. Дослідження жирнокислотного складу екстрактів з ембріонів курей показало, що в найбільшій кількості в них міститься олеїнова - 6,71 мг/100 мг, пальмітинова - 3,74 мг/100 мг, лінолева - 2,04 мг/100 мг і стеаринова - 1,44 мг/100 мг кислоти. Біологічну активність отриманих екстрактів вивчали під час встановлення їх антирадикальної [Re R. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation depolarization assay / R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente [et. al.] // Free Radical Biology and Medicine.-1999. - Vol. 26, № 9/10. - P. 1231-1237] та хелатуючої активності [Dinis Т. С. Р. Action of phenolic derivates (acetoaminophen, salycilate, and 5-aminosalycilate) asinhibitors of membrane lipid peroxidation arid as peroxyl radical scavengers / Т. С P. Dinis, V. M. С Madeira, L. M. Almeida // Arch. Biochem. Biophys.-1994. - Vol. 315, № 1. - P. 161-169.], а також оцінки кількісного вмісту фенольних сполук [Singleton V. L. Analysis of total phenols and oxidation substrates and antioxidants by means of FolinCiocalteau reagent /V. L. Singleton, R. Orthofer, R. M. Lamuela-Raventos // Methods Enzymol.-1999. - Vol. 299. - P. 152-177.]. Дослідження екстрактів проводили також на безпородних мишах-самцях масою 21-23 г на моделі експериментальної гіпоксії. Тварини були розділені на 4 групи: І - інтактна, II - миші з гіпоксією, що отримували р-р NaCl 0,9 %, III - миші з гіпоксією, що отримували екстракт, IV миші з гіпоксією, що отримували препарат-порівняння Ербісол. Екстракт з курячих ембріонів вводили дослідній групі тварин внутрішньом'язово в стегно за 12 годин до початку експерименту в дозі 0,01 мл/г маси тіла. Тваринам контрольної групи, вводили таку ж кількість ізотонічного розчину хлористого натрію, тваринам четверної групи вводили Ербісол. Моделювали мишам гіпоксію з гіперкапнією. При появі судом і атонального дихання тварин виводили з експерименту методом декапітації. У сироватці крові визначали загальну кількість ТБК-реагуючих продуктів (ТБК-РП). Для цього використали комерційні набори фірми ТОВ "Агат-мед". + Метод оцінки антирадикальної активності заснований на здатності відновлювати АВТ8 радикал [Phipps S. М. Assessing antioxidant activity in botanicals and other dietary supplements / S. M. Phipps, M. H. M. Sharaf, V. Butterweck // Pharmacopeial Forum.-2007. - Vol. 33, № 4. - P. 810814.] Результати досліджень показали, що загальна антирадикальна активність екстракту з ембріонів курей вище, порівняно з Ербісолом за рахунок високої активності повільно відновлюючих центрів (Таб. 1). 2 UA 85646 U Таблиця 1 + Антирадикальна активність швидко та повільно відновлюючи АВТ8 -радикал центрів Показники Активність швидко Активність повільно Загальна відновлююча відновлюючих центрів, % відновлюючих центрів, % активність за 400 сек., % Екстракт з ембріонів курей Препарат порівняння 5 1,4 68,6 70 2,6 38,4 41 Одним з основних механізмів антирадикального захисту биологічних макромолекул є хелатні сполуки, що зв'язують іони металів перемінної валентності і тим самим попереджують реакції розкладання перекисів. Було встановлено, що отриманий екстракт з ембріонів курей проявляє хелатуючу активність, так відсоток зв'язаного заліза склав 73 %, в той час як ця активність у препараті порівняння відсутня (Таб. 2). Таблиця 2 Здатність утворювати хелатні комплекси Показники Екстракт з ембріонів курей Препарат порівняння Зв'язане залізо, % 73,14 0 10 15 Фенольні сполуки є найбільш ефективними "перехоплювачами" вільних радикалів [Меньшикова Е.Б. Зенков Н.К. Антиоксиданти и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологи. - 1999. - Т. 113, № 4. - С. 442-453]. Результати досліджень показали, що вміст фенольних комплексів в ембріональному екстракті вище, ніж у препараті порівняння на 41 % (Таб. 3). Таблиця 3 Загальний вміст фенольних сполук Екстракт з ембріонів курей Препарат порівняння 20 Вміст фенольних сполук, екв. мМоль галієвої кислоти 2,04 1,20 Для оцінки процесів ПОЛ in vivo в сироватці крові мишей визначали концентрацію ТБКреагуючих продуктів (ТБК-РП). Гіпоксія викликала достовірне підвищення кількості ТБК-РП в сироватці крові ІІ-ої групи мишей в 2 рази, а введення екстракту сприяло зниженню цього показника, в той час, як при введенні тваринам препарату порівняння вміст ТБК-РП в сироватці крові перевищував інтактні значення в 1,6 разу (таб. 4). Таблиця 4 Вплив екстракту з ембріонів курей та препаратів порівняння на кількість ТБК-РП Група тварин Інтактна Миші, що отримували р-р NaCl Миші, що отримували екстракт Миші, отримуючі препарат порівняння Кількість ТБК-РП, мкмоль/л 2,16 4,02* 2,2 3,6* *- р