Спосіб визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів

Реферат: Спосіб визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів по зменшенню концентрації вуглеводнів нафти відносно поживного середовища з нафтою у відсутності мікроорганізмів (контроль № 1). Залишкову концентрацію нафти визначають з поправкою на суспензію мікроорганізмів (контроль № 2), структурні компоненти яких теж мають поглинальну здатність в -1 інфрачервоній області спектра в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см . UA 90550 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ НАФТОДЕСТРУКТИВНОЇ АКТИВНОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ UA 90550 U UA 90550 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до способів визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів, і може використовуватися в промисловій мікробіології, біотехнології для виготовлення біопрепаратів та їх застосування у біотехнологічних процесах очищення води або ґрунту від нафтових забруднень, при аналітичному контролі забруднення навколишнього середовища нафтою та нафтопродуктами тощо. Проблема забруднення навколишнього природного середовища нафтою і продуктами її переробки є дуже актуальною. В Україні виявлено багато районів із перевищенням гранично допустимих концентрацій нафтопродуктів не лише у воді, але і в ґрунтах (зокрема, в ґрунтах аеродромів, нафтобаз, нафтосховищ, нафтопереробних заводів, нафтових свердловин, автозаправок, автостоянок тощо). Нафтопродукти, що потрапили у водні об'єкти або ґрунт, становлять реальну небезпеку для всього живого. Тому задачею сьогодення є розробка методів очищення довкілля, найбільш перспективним з яких є переробка забруднювачів мікроорганізмами з високою нафтодеструктивною активністю. Досягнутий рівень техніки в даній області характеризується наступними прикладами. Відомий візуальний спосіб оцінювання нафтодеструктивної активності мікроорганізмів [Петрикевич СБ., Кобзев Е.Н., Шкидченко А.Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.-2003. - Т. 39, № 1. - С. 25-30], в якому утилізацію нафти для кожного штаму оцінюють візуально по утворенню зон просвітлення при рості на нафтопродуктах. По розміру цих зон виділяють найбільш активні штами мікроорганізмів-деструкторів нафти. Недоліком даного способу є лише приблизна оцінка нафтодеструктивної активності мікроорганізмів. А при дослідженні окремих безбарвних вуглеводнів (гексан, декан та інші) такі спостереження провести зовсім неможливо. Відомий спосіб індикації деструктивної активності мікроорганізмів за визначенням активності вуглеводноокиснювальних бактерій з використанням н-алканів, мічених тритієм [Коронелли Т.В., Дермичева С.Г, Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием // Прикладная биохимия и микробиология.-1988. -Т. 24, №2. -С. 203-206]. Спосіб трудомісткий і дає оцінку деструктивної активності мікроорганізмів тільки по відношенню до алканів. Відомі й інші непрямі способи індикації нафто деструктивної активності мікроорганізмів: по приросту чисельності бактерій-деструкторів на середовищах, що містять нафту/нафтопродукти як єдине джерело вуглецю; за зміною рН культуральної рідини на початку і в кінці культивування [Патент RU на винахід № 2426781 "Способ выбора штаммов микроорганизмовдеструкторов нефти и нефтепродуктов" по Кл. C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02, C12Q 1/04, опубл. 20.08.2011 Бюл. № 23; Патент RU на винахід № 2352630 "Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов" по Кл. C12N 1/20, C12N 1/26, опубл. 20.04.2009, Бюл. № 11]. Недоліки: визначення деструктивної активності мікроорганізмів по збільшенню чисельності бактерій на середовищі з вуглеводнями не дозволяє достовірно судити про їх нафтодеструктивну активність, оскільки збільшення чисельності бактерій на середовищі з вуглеводнями також може слугувати наслідком резистентності мікроорганізмів до нафтопродуктів. Крім того, облік чисельності вуглеводноокиснювальних бактерій чашковим методом дає велику помилку, а використання методу граничних розбавлень ускладнює процес. За контроль приймають поживне середовище з нафтою у відсутності мікроорганізмів, що не несе ніякої інформації, бо якщо в дослідних пробах спостерігається збільшення загального числа мікроорганізмів та зміни рН середовища у бік підлужування, то, як слід, за відсутністю мікроорганізмів у контрольних пробах (поживне середовище з нафтою або конкретним вуглеводнем) ніяких змін у кількості мікроорганізмів і рН середовища не відбувається. Найбільш близьким аналогом (прототип) заявленої корисної моделі є робота авторів [Патент України на винахід № 34894 "Препарат Родойл для біологічного очищення ґрунту і води від забруднень нафтою та нафтопродуктами" по Кл. C02F 3/34, опубл. 15.08.2003, Бюл. № 8]. Недоліком прототипу є те, що інтерпретацію результатів проводили по відношенню до одного контролю: по відношенню до мінерального середовища за відсутністю мікроорганізмівдеструкторів нафти, враховуючи таким чином тільки природний процес вивітрювання легких нафтових фракцій. Не враховується поправка на речовини не нафтового природного походження, що продукують водні або ґрунтові мікроорганізми, наявність яких при проведенні кількісного аналізу на нафту/нафтопродукти методом гравіметрії, флуориметрії або ІЧспектрометрії викривляє картину оцінювання нафтодеструктивної активності мікроорганізмів. 1 UA 90550 U 5 10 15 20 25 В основу корисної моделі поставлена задача більш надійного визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів, призначених для виготовлення на їх основі біопрепаратів для сорбції і деструкції вуглеводнів нафти, що забруднюють ґрунт або водне середовище. Поставлена задача вирішується способом визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів по зменшенню концентрації вуглеводнів нафти відносно поживного середовища з нафтою у відсутності мікроорганізмів (контроль № 1), який відрізняється тим, що залишкову концентрацію нафти визначають з поправкою на суспензію мікроорганізмів (контроль № 2), структурні компоненти яких теж мають поглинальну здатність в інфрачервоній області спектра в -1 діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см . Пропонований спосіб здійснюють таким чином. Відповідну культуру бактерій, що призначено для використання в біотехнології очищення ґрунту або води від нафти, попередньо нарощують на стерильному поживному середовищі. Після цього у фіксований об'єм бактеріальної культури вводять нафту визначеної концентрації та витримують певний час. Використовують два контролі: поживне середовище з нафтою (контроль № 1 – K / ) і суспензію мікроорганізмів у поживному середовищі у відсутності нафти (контроль № 2 - K // ). Через певний час експозиції визначають по відношенню до двох контролів K / і K // нафтодеструктивну активність мікроорганізмів по зменшенню кількості нафти у досліджуваних бактеріальних культурах (дослідні проби - Дп). Кількісний облік біодеструкції нафти проводять методом ІЧ-спектрометрії на приладі "ИКС-29", або на іншому аналізаторі, при кімнатній температурі в статичних умовах без перемішування і аерації проб. Знімають IЧ- спектри контрольних і досліджуваних проб. У -1 кожному випадку в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см здійснюють реєстрацію ІЧ-спектра поглинання, обумовленого валентними коливаннями СН3- і СН2- груп аліфатичних і аліциклічних сполук і бокових ланцюгів ароматичних вуглеводнів, а також вуглець-водневих зв'язків ароматичних сполук. Нафтодеструктивну активність бактерій ( A НД , %), призначених для використання в біотехнології очищення ґрунту або води від вуглеводнів нафти, визначають за формулою: A НД //   /   С (K )  Cвим (K )V1  n    V2    100%, (1)  / С (K )       де С (K / ) - вихідна концентрація нафти (мг/л) з поправкою на поживне середовище з 30 нафтою у відсутності мікроорганізмів (контроль № 1 - K / ); Cвим (K // ) - залишкова виміряна концентрація нафти (мг/л) з поправкою на суспензію мікроорганізмів у поживному середовищі у відсутності нафти (контроль № 2 - K // ); V1 - об'єм 35 40 45 чотирихлористого вуглецю, що взятий для екстракції; V2 - об'єм бактеріальної суспензії; n коефіцієнт розбавлення елюату, одержаного після пропускання екстракту через хроматографічну колонку з оксидом алюмінію ( n  1 , якщо елюат не розбавляють). Залишкову виміряну концентрацію нафти ( Cвим (K // ) , мг/л) визначають за попередньо побудованою градуювальною залежністю D  f (C) , враховуючи в процесі біодеструкції нафти поправку на суспензію мікроорганізмів у поживному середовищі у відсутності нафти (контроль № 2 - K // ). Поправку на K // , тобто на структурні компоненти бактерій, що теж мають -1 поглинальну здатність в області 2700-3200 см , враховують через значення ( D ): D  D( Дп)  D(K // ). (2) Різницю оптичних густин розчинів ( D ) розраховують за аналітичним сигналом, -1 відображеним на ІЧ-спектрі (область 2700-3200 см ) при хвильових числах, що відповідають максимуму і мінімуму смуги поглинання, за формулою: D  In(T1 / T2 ), (3) -1 де T1 - значення пропускання (%) в максимумі смуги поглинання при (2926±15) см ; T2 -1 50 значення пропускання (%) в мінімумі смуги поглинання при (270015) см [ГОСТ 38.01378-85. Охрана природы. Гидросфера. Определение содержания нефтепродуктов в сточных водах методом инфракрасной спектрофотометрии. - С. 6]. Спосіб ілюструється наступним прикладом. Приклад. 2 UA 90550 U 5 10 15 20 25 За пропонованим способом оцінювали нафтодеструктивну активність окремих штамів бактерій роду Pseudomonas: P. fluorescens ОНУ328, P. maltophilia ОНУ329 (виділені з морської води), P. cepacia ОНУ327 (виділений із ґрунту), що зберігаються в колекції мікроорганізмів кафедри мікробіологіі, вірусологіі та біотехнології ОНУ імені II. Мечникова. Бактерії попередньо нарощували при рН 7,0-7,2 і температурі 28° С протягом 48 год. на поживному стерильному середовищі М-9, що містило, (тіл): КН2РО4 - 1,5; Na2HPO4 - 3; NaCl - 5; NH4Cl - 1; пептон - 10; глюкоза - 2; дріжджовий екстракт - 5. Готували вихідну бактеріальну суспензію з концентрацією 3 1 × 10 мікробних клітин/см по оптичному стандарту ім. A.M. Тарасевича. В три пробірки, що містили по 10 мл бактеріальної суспензії (стерильне середовище з бактеріями P. fluorescens ОНУ328, P. maltophilia ОНУ329, P. cepacia ОНУ327 окремо) вводили 3 сиру нафту густиною 0,84 г/см визначеної концентрації (С° = 500 мг/л). Готували ще чотири контрольних пробірки: до першої, що містила 10 мл поживного середовища додавали 0,05 % сирої нафти (контроль № 1), а до трьох інших пробірок - суспензію окремих штамів бактерій роду Pseudomonas (контроль № 2а - P. fluorescens ОНУ328, контроль № 26-P. maltophilia ОНУ329, контроль № 2в - Р. серасіа ОНУ327) у поживному середовищі загальним об'ємом 10 мл. Проби витримували 10, 20 та 30 діб у статичних умовах при кімнатній температурі. За цей проміжок часу легкі фракції нафти випаровувались на 1,0-2,4 %, що було встановлено інтегральним методом ІЧ-спектрометрії при інтерпретації ІЧ-спектрів, зареєстрованих на -1 приладі "ИКС-29" в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см , і враховано через поправку на поживне середовище з нафтою (контроль № 1 - K / ): С° ( K / )10 = 495 мг/л; С° ( K / )20 = 493 мг/л; С° ( K / )30 = 488 мг/л. Екстрагування нафти із проб здійснювали з використанням чотирихлористого вуглецю марки "х.ч." Органічний розчинник об'ємом 25 мл ( V1 =25 мл) змішували з 10 мл досліджуваної проби ( V2 =10 мл), інтенсивно струшували впродовж хвилини, після чого давали пробам відстоятися впродовж 15 хв. Потім екстракт пропускали через хроматографічну колонку, заповнену оксидом алюмінію (II ступеня активності по Брокману). По формулі (1) розраховували нафтодеструктивну активність ( A НД , %), бактерій роду Pseudomonas. Результати за пропонованим способом представлені у таблиці. 30 Штам Cвим (K // ) , P. fluorescens ОНУ328 P. maltophilia ОНУ329 P. серасіа ОНУ327 77,2 61,6 54,0 мг/л Cвим (K // ) , мг/л A НД , % Cвим (K // ) , мг/л A НД , % 10 діб 20 діб 76,0 61,5 56,0 71,6 53,6 72,8  / С (K ) =493 мг/л 61,0 68,8 72,7  / С (K ) = 495 мг/л A НД , % 30 діб 41,2 78,8 40,0 79,5 46,4 76,2  / С (K ) =488 мг/л Табличні дані свідчать про те, що усі досліджувані мікроорганізми є досить ефективними деструкторами нафти ( A НД = 61,079,5 %) і тому можуть успішно використовуватися в 35 біотехнологіях очищення довкілля. Найбільшою нафто деструктивною активністю володіє штам P. maltophilia ОНУ329 ( A НД = 79,5 %). З прикладу видно, що даний пропонований спосіб забезпечує надійне визначення нафто деструктивної активності мікроорганізмів. 40 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення нафтодеструктивної активності мікроорганізмів по зменшенню концентрації вуглеводнів нафти відносно поживного середовища з нафтою у відсутності мікроорганізмів (контроль № 1), який відрізняється тим, що залишкову концентрацію нафти визначають з поправкою на суспензію мікроорганізмів (контроль № 2), структурні компоненти яких теж мають поглинальну здатність в інфрачервоній області спектра в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 -1 см . 3 UA 90550 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4