Спосіб моделювання затримки статевого дозрівання у самців

Реферат: Спосіб моделювання затримки статевого дозрівання у самців шляхом дії екзогенних чинників. Самцям щурів батьківського покоління протягом 30 діб додають до їжі суміш фітоестрогенів у дозі 20 мг/кг маси тіла. Після цього спаровують їх з інтактними самками та отримують нащадків самців, які мають затримку статевого розвитку. UA 91090 U (12) UA 91090 U UA 91090 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біології та експериментальної медицини і може бути використана для відтворення репродуктопатій у самців, що є необхідним при проведенні фармакологічних і медико-біологічних досліджень. За умов сучасного напруженого життя (стрес) та негативного навантаження навколишнього середовища з'являється все більше порушень здоров'я, внаслідок яких виникає затримка статевого розвитку, що у подальшому може відбитися на відтворювальній спроможності особини. Дослідження сомато-статевого розвинення лабораторних тварин - необхідна частина оцінки репродуктивної функції, яку здійснюють у процесі вивчення нових фармакологічних засобів, проведення токсикологічних досліджень, визначення наслідків дії чинників різної природи (хімічних, фізичних, екологічних, психоемоційних тощо) [1, 2]. Так, при доклінічному вивченні впливу лікарських засобів, що застосовуються під час вагітності, на нейроендокринні системи регуляції репродукції та адаптації у нащадків [3], виявляються потенційно небезпечні вади. При цьому навіть за відсутності тератогенного ефекту, у випадку призначення гормональних, протисудомних, гіпотензивних, седативних, кардіотропних засобів, антибіотиків, вітамінно-мінеральних комплексних препаратів, припускається можливість виникнення тяжких функціональних розладів з боку репродуктивної системи, які виявляються у нащадків лише по досягненні зрілого віку у вигляді безпліддя, аномалій статевої поведінки. Доклінічній перевірці нешкідливості потенційних лікарських засобів підлягають в першу чергу стероїдні гормони (гестагени, андрогени, естрогени, глюкокортикоїди), їх агоністи та антагоністи, а також психо- та нейротропні препарати. При цьому саме зміна темпу статевого дозрівання за умов застосування таких сполук може бути першою видимою ознакою порушення нейроендокринної регуляції репродуктивної системи [2]. Відомо кілька методів моделювання затримки статевого розвитку, суть яких полягає в екзогенному введенні тваринам гормонів [4], лікарських засобів [5, 6, 7] або стресуванні тварин у пренатальний або неонатальний період [8]. Але вказані моделі є нефізіологічними та викликають багато різноманітних побічних ефектів. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб моделювання затримки статевого розвитку у щурів за допомогою введення ретаболілу новонародженим самцям, який викликає порушення соматостатевого розвитку [9]. За такий спосіб новонародженим самцям на третю добу післянатального життя вводять ретаболіл у дозі 1 мг/кг маси тіла. Зміни, які викликані уведенням цієї речовини, носять глибокий та незворотній характер. Спосіб дозволяє відтворити порушення соматостатевого розвитку, які супроводжуються патоспермією та гіпофертильністю у зрілому віці. Основним недоліком цього способу є те, що таке втручання не має природного клінічного аналога. Тому актуальним залишається пошук моделі розладу репродуктивної системи, що супроводжується затримкою статевого розвитку унаслідок дії моделюючого агента у преконсумаційний період і є максимально наближеною до реальних обставин. Задача корисної моделі - розробка простої у виконанні, стабільної та фізіологічної моделі затримки статевого дозрівання у самців-нащадків унаслідок дії екзогенних чинників на батька. Поставлена задача вирішується тим, що самцям щурів батьківського покоління впродовж 30 діб згодовують з їжею суміш рослинних фітоестрогенів (ФЕ) у дозі 20 мг/кг маси тіла, після чого їх спаровують з інтактними самками для одержання нащадків самців, які мають затримку статевого розвитку. Технічний результат - розширення арсеналу експериментальних моделей затримки статевого дозрівання у самців. Відомо, що вплив деяких речовин на батька може змінювати стан репродуктивної системи їх нащадків чоловічої статі. Наразі підвищений рівень тестостерону (Тс) та стресування напередодні парування призводить до затримки або дизсинхронії статевого розвитку [10, 11]. Як показали наші дослідження експозиція самців до надлишку ФЕ призводить до порушень репродуктивного потенціалу, який відображається не тільки у порушенні статевоїповедінки та зниженні якості сперми батька, але й несе відбиток у фемінізації та ретардації статевого розвитку, дозріванні їх нащадків чоловічої статі та запліднюючій спроможності сім'яної рідини. Для здійснення способу самцям щурам батьківського покоління (група Ро(ФЕ)) впродовж 30 днів згодовували з їжею надлишок суміші ФЕ у дозі 20 мг/кг маси тіла, після чого їх спаровували з інтактними самками для одержання нащадків (група Ро(ФЕ)/F1). Щурят спостерігали до статевої зрілості, досліджували характер сомато-статевого розвитку. У віці 6-7 місяців у них вивчали статеву поведінку, стан сперматогенезу, плідність, вміст Тс та естрадіолу (Е 2), масу деяких внутрішніх органів. 1 UA 91090 U 5 10 15 20 25 30 Для аліментарного надходження ФЕ використовували харчову домішку "Genistein Soy Complex isoflavone rich" (Soylife, USA), відносний вміст ізофлавонів у якому (у перерахунку на індивідуальні аглікони) був: дайдзеїну 60 %, гліцитеїну 22 %, геністеїну 18 %. Дозу розраховували за так званим "геністеїновим еквівалентом" [12]. Після пологів проводили вимірювання ано-генітальної відстані (АГВ) самців-нащадків та оцінювали статевий розвиток тварин за часом опущення яєчок у мошонку. Життєздатність щурят оцінювали за часткою тварин, що залишились живими на 30-ту добу життя. Контролювали також динаміку маси тіла. Статеву поведінку самців-нащадків досліджували у 15 хвилинному парному тесті з оваріектомованою рецептивною самкою. Визначали кількісні та часові показники статевої поведінки: кількість наближень самця до самки, кількість садок, інтромісій та еякуляцій. За секундоміром оцінювали часові показники: латентність садки, інтромісії, еякуляції, розраховували тривалість постеякуляторного інтервалу, коефіцієнт садки/інтромісії. Для формування в самців стереотипних реакцій та отримання ними сексуального досвіду було проведено три поведінкових тести з самками. Вихідний рівень статевої активності досліджуваних самців оцінювали за даними четвертого тесту. Фертильність самців-нащадків визначали за результатами парування з інтактними самками. Самок знеживлювали шляхом швидкої декапітації на 20-у добу вагітності, підраховували кількість жовтих тіл вагітності, місць імплантації та плодів. Визначали рівень преімплантаційних, постімплантаційних та сумарних внутрішньоутробних втрат у вагітних самок, розраховували індекс запліднення та індекс вагітності. Після виведення щурів з експерименту шляхом швидкої декапітації визначали масу сім'яників, сім'яних пухирців, епідидимісів, вентральної частини передміхурової залози. Стан сперматогенезу оцінювали за концентрацією епідидимальних сперміїв, їх рухливістю та відсотком патологічних форм, використовували камеру Горяєва [13]. Рівень гормонів у сироватці крові щурів визначали імуноферментним методом за допомогою тест-наборів Estradiol ELISA EIA-2693 (DRG, США) та Стероид ИФА-тестостерон-01 (АлкорБио, Росія) на аналізаторі Stat FAX-3100. Отримані результати наведені як середнє арифметичне x  , його похибка Sx і порівняні з даними, які отримані у інтактних тварин, народжених від інтактних батьків (група Po(-)/F1). Статистичну вірогідність відмінностей між групами розраховували, використовуючи критерій t 2 35 40 45 Ст'юдента або  (у випадку якісних порівнянь), які вважали значущими при Р0,05. Спостереження за самцями-нащадками, батько яких, протягом 30 діб перед спаровуванням, отримував ФЕ, проводили з першого дня від народження. Загибелі новонароджених щурят відмічено не було, як і не було знайдено суттєвої різниці у масі піддослідних та контрольних тварин, що свідчить про відсутність токсичного ефекту застосованої дози суміші ФЕ. Отримані дані наведені в таблиці. Ознакою внутрішньоутробного статевого розвитку є величина АГВ. Так, у самців-нащадків групи Ро(ФЕ)/F1 АГВ при народженні була менша, ніж у інтактних тварин, що може свідчити про фемінізуючу дію преконсумаційного введення ФЕ батьку. Крім цього у тварин статеве дозрівання за часом опущення яєчок запізнювалось порівняно зі щурами контрольної групи. У віці 6 міс. вивчали статеву поведінку нащадків самців. У щурів піддослідної групи виявлені зміни у статевій поведінці, які полягали, по-перше, у зменшенні частки самців, які демонстрували повноцінний статевий акт. Так, еякуляція спостерігалася у однієї тварини з десяти (в гр. Po(-)/F1-100 %; Р