Спосіб одержання екзополісахариду

Реферат: UA 92017 U UA 92017 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способів одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. № 595379, СРСР, Опубл. 28.02.78, Бюл. № 8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В-12074 [патент № 4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris АТСС 31601 [патент № 4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ЕПС [патент України на винахід № 97910, С12Р 19/04. Спосіб одержання екзополісахариду / Пирог Т.П., Савчук О.М. Опубл. 26.03.2012, Бюл. № 6], який передбачає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ацетату натрію і меляси, мінеральні солі і ростові фактори, причому у процесі культивування штаму IMB В-7005 здійснюють періодичну (кожні 18-20 год.) нейтралізацію культуральної рідини розчинами водорозчинних органічних кислот (оцтової, лимонної, бурштинової, щавлевої). Недоліком цього способу є невисока в'язкість розчинів ЕПС за присутності одновалентних 2+ катіонів і у системі Сu -гліцин, а саме ці реологічні властивості визначають практичну значущість цього полісахариду. В основу корисної моделі поставлено задачу створення новою способу одержання екзополісахариду, який покращує його реологічні властивості і підвищує показники синтезу. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі, ростові фактори, з внесенням на початку стаціонарної фази росту фумарату. Згідно корисної моделі як джерело вуглецю використовують соняшникову олію (0,9-1,1 %, об'ємна частка), концентрація фумарату становить 0,04-0,06 % (масова частка), а інокулят вирощують на середовищі з глюкозою. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецевого живлення соняшникової олії (0,9-1,1 %, об'ємна частка), внесення на початку стаціонарної фази росту фумарату у концентрації 0,04-0,06 % (масова частка) і використання інокуляту, вирощеного на глюкозі, дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 Μ KСl у 10-11 разів і підвищити на 20-30 % ЕПС-синтeзувальну здатність. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КH2РO4-6,8; КОН - 0,9; NH4NO3-0,4; MgSO4×7H2O-0,4; СаС12×2Н2O-0,1; FeSO4×7Н2O-0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують соняшникову олію (1 %, об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,05 % (масова частка) фумарату у вигляді 10 %-ного розчину фумарату натрію. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить глюкозу (0,5 %, масова частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 Μ KСl у 10-11 разів і підвищити на 20-30 % ЕПС-синтезувальну здатність. Приклад 1 Залежність синтезу ЕПС Acinetobacter sp. IMB В-7005 від моменту внесення фумарату у середовище з соняшниковою олією. Acinetobacter sp. IMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН 2РО4-6,8; КОН - 0,9; ΝΙΙ4ΝO3-0,4; MgSO4×7H2O-0,4; СаСl2×2Н2O-0,1; FeSO4×7Н2O-0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують соняшникову олію (1,0 %, об'ємна частка). На початку процесу (лаг-фаза), в експоненційній (48 год.) і стаціонарній фазі росту (72 год.) у середовище вносять 0,05 і 0,1 % (масова частка) фумарату у вигляді 10 %-ного розчину фумарату натрію. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (24 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить соняшникову олію (0,5 %, об'ємна частка) як джерело вуглецевого живлення. Кількість 1 UA 92017 U 5 10 посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за такими показниками: кількість синтезованих ЕПС і ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом: ЕПС осаджують з культуральної рідини ізопропанолом, осад промивають у чистому ізопропанолі і висушують при кімнатній температурі упродовж доби. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г EПС/ г АСБ. Як видно з наведених у табл. 1 даних, максимальне підвищення синтезу ЕПС спостерігається у разі внесення 0,05 % фумарату у стаціонарній фазі росту. Таблиця 1 Показники синтезу епс acinetobacter sp. Іmb в-7005 за додавання екзогенною фумарату у середовище із соняшниковою олією Середовище 1 Концентрація фумарату, Момент внесення % (масова частка) фумарату (фаза росту) 0,05 0,1 Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна ЕПС (г/л), % від контролю 114±5 123±6 145±7 95±5 110±5 127±6 ЕПС-синтезувальна здатність (г ЕПС/г АСБ), % від контролю 94±5 124±6 140±7 95±5 103±5 120±6 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі без фумарату. 15 20 25 Приклад 2 Синтез ЕПС Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищі з соняшниковою олією залежно від концентрації фумарату. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють, як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,03-0,07 % (масова частка) фумарату у вигляді 10 %-ного розчину фумарату натрію. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, у разі внесення 0,04-0,06 % фумарату натрію у середовище з олією показники синтезу ЕПС є найвищими. Приклад 3 Синтез ЕПС Acinetobacter sp. ІMB В-7005 залежно від концентрації олії у середовищі культивування і природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту. Таблиця 2 Вплив концентрації фумарату на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на соняшниковій олії Концентрація фумарату, ЕПС (г/л), % від % контролю 0,03 125±6 0,04 140±7 0,05 145±7 0,06 145±7 0,07 130±6 ЕПС-синтезу вальна здатність (г ЕПС/г АСБ), % від контролю 120±6 140±7 140±7 145±7 125±6 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ЕПС на середовищі без фумарату. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело 2 UA 92017 U 5 10 вуглецю використовують соняшникову олію у концентрації 0,8-1,2 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,05 % (масова частка) фумарату у вигляді 10 %-ного розчину фумарату натрію. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційиої фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить соняшникову олію (0,5 % об'ємна частка) і глюкозу (0,5 %, масова частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, використання посівного матеріалу, вирощеного на глюкозі, дає змогу суттєвіше підвищити показники синтезу ЕПС порівняно із застосуванням інокуляту, вирощеного на середовищі з соняшниковою олією. Таблиця 3 Вплив концентрації соняшникової олії на синтез ЕПС Acinetobacter sp. ІMB В-7005 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Соняшникова олія Глюкоза Концентрація соняшникової олії, % 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 ЕПС (г/л), % від контролю 130±6 140±7 145±7 145±7 130±6 140±7 150±8 155±8 150±8 140±7 Пpимітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ППС па середовищі без фумарату. 15 20 25 30 Приклад 4 Порівняння показників синтезу і реологічних властивостей ЕПС Acinetobacter sp. ІMB В-7005 згідно прототипу і запропонованого способу. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують соняшникову олію у концентрації 1,0 % (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,05 % (масова частка) фумарату у вигляді 10 %-ного розчину фумарату натрію. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить глюкозу (0,5 %, масова частка). Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Кінематичну в'язкість 0,1 %-них розчинів ЕПС вимірюють на скляному віскозиметрі Оствальда ВПЖ-4 при температурі 20 °C. Властивості розчинів ЕПС оцінюють за зміною їх кінематичної в'язкості за присутності 0,1 Μ KСl. Для порівняння властивостей розчинів ЕПС як критерій оцінки використовують відносне збільшення в'язкості його розчинів, яке визначають за формулою:   o  1  100 % o Відносне збільшення в'язкості , де: 1 - в'язкість розчину ЕПС у досліджуваних умовах (за присутності 0,1 Μ KСl); o в'язкість розчину ЕПС у дистильованій воді. 3 UA 92017 U Таблиця 4 Синтез ЕПС за різних умов культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 Умови культивування Згідно прототипу Згідно запропонованого способу 5 Відносне збільшення кінематичної ЕПС-синтезувальна здатність (г в'язкості (%) за присутності 0,1 Μ KСl ЕПС/г АСБ), % від контролю 46,2±2,3 6,9±0,34 485,1±24 8,9±0,44 Як свідчать дані, наведені у табл. 4, використання запропонованого способу дає змогу збільшити в'язкість 0,1 % розчинів ЕПС за присутності 0,1 Μ KСl у 10-11 разів і підвищити на 2030 % ЕПС-синтезувальну здатність порівняно з прототипом. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб одержання екзополісахариду, що включає культивування Acinetobacter sp. IMB В-7005 на поживному середовищі, що містить джерело вуглецевого живлення, мінеральні солі, ростові фактори, з внесенням на початку стаціонарної фази росту фумарату, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують соняшникову олію (0,9-1,1 %, об'ємна частка), концентрація фумарату становить 0,04-0,06 % (масова частка), а інокулят вирощують на середовищі з глюкозою. 15 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4