Спосіб одержання екзополісахариду

Реферат: Винахід належить способу одержання екзополісахариду, який включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори, причому як джерело вуглецевого живлення використовують суміш фумарату натрію і меляси масовою часткою 1,8 і 1,0 % відповідно, вміст мінеральних солей у середовищі становить (г/л): КН 2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001, а як посівний матеріал використовують культуру, вирощену на моносубстраті глюкози масовою часткою 0,5 %. Спосіб дає змогу підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність продуцента в 1,2 раза. UA 98252 C2 (12) UA 98252 C2 UA 98252 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, а саме, до способу одержання мікробних екзополісахаридів (ЕПС), які можуть використовуватись у нафтовидобувній, хімічній, парфумерній, харчовій та ін. промисловості, сільському господарстві, медицині. Відомі способи одержання екзополісахаридів, продуцентами яких є Xanthomonas campestris 8162 [А.с. №595379, СРСР, Опубл. 28.02.78, Бюл. №8], Xanthomonas campestris NRLL В-12075 та NRLL В-12074 [патент №4400467, США, опубл. 23.08.83], Xanthomonas campestris ATCC 31601 [патент №4418145, США, опубл. 29.11.83]. Однак штами Xanthomonas campestris є фітопатогенними, деякі з них генетично нестабільні, оскільки дисоціюють на мукоїдні і немукоїдні форми, що спричиняє нестабільність якості синтезованих полісахаридів. Вказані негативні особливості штамів-продуцентів завдають шкоду довкіллю, а також обмежують використання препаратів. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання 7 ЕПС [патент України №52816 МПК С12Р 19/00. Спосіб одержання екзополісахариду / Пирог Т.П., Лащук Н.В., Гарбарчук СО. Опубл. 10.09.2010, Бюл. №17], який передбачає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно корисної моделі як джерело вуглецевого живлення використовують суміш фумарату натрію і глюкози у молярному співвідношенні 4:1 (масовою часткою 1,8 і 0,5 % відповідно). Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованого ЕПС (9,8 тіл). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання екзополісахариду, який підвищує кількість синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність продуцента. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання екзополісахариду включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори. Згідно винаходу як джерело вуглецевого живлення використовують суміш фумарату натрію і меляси масовою часткою 1,8 і 1,0 % відповідно, вміст мінеральних солей у середовищі становить (г/л): КН 2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001, а як посівний матеріал використовують культуру, вирощену на моносубстраті глюкози масовою часткою 0,5 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на середовищі, що містить мінеральні солі (г/л): КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001, а як джерело вуглецю суміш фумарату натрію (1,8 %) і меляси (1,0 %) з використанням посівного матеріалу, вирощеного на моносубстраті глюкози масовою часткою 0,5 % дає змогу підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність продуцента в 1,2 рази. Спосіб здійснюється таким чином. Acinetobacter sp. ІMB В-7005 вирощують на середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на мінеральному середовищі наведеного вище складу, що містить 0,5 % (масова частка) глюкози як джерело вуглецевого живлення. Кількість посівного матеріалу становить 10 %. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (220 об/хв) при 30 °C, pH 6,8-7,0 упродовж 90 год. Використання нового способу дає підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПСсинтезувальну здатність Acinetobacter sp. ІMB В-7005 в 1,2 рази. Приклад 1 Синтез екзополісахариду за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату натрію і меляси Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв) при 30 °C упродовж 90 год. на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КН 2РО4 - 1,8; NH4CІ - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовище додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату, 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і меляси (1,0 %, масова частка), а також суміш фумарату натрію і глюкози (1,8 % та 0,5 % відповідно). Фумарат натрію вносять у середовище у вигляді 10 %-ного розчину. Початкове pH середовища становить 7,0 (перед внесенням посівного матеріалу середовище підлужнюють 10 %-ним розчином калій гідроксиду). 1 UA 98252 C2 5 10 Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищі наведеного вище складу, яке як джерело вуглецю та енергії містить фумарат натрію (0,5 %). Концентрація інокуляту становить 10 %. Концентрацію біомаси визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу клітин (АСБ) у відповідності з калібрувальним графіком. Ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС оцінюють за наступними показниками: кількість синтезованих ЕПС, ЕПС-синтезувальна здатність. Кількість синтезованого екзополісахариду встановлюють ваговим методом. ЕПС-синтезувальну здатність розраховують як відношення кількості синтезованого ЕПС до біомаси та виражають у г ЕПС/г АСБ. Як видно з наведених у табл.1 даних, заміна глюкози на мелясу у середовищі 1 супроводжується незначним (на 8-9 %) підвищенням кількості синтезованого ЕПС, проте у цьому разі спостерігається суттєве зростання рівня біомаси, що призводить до зниження ЕПСсинтезувальної здатності майже у три рази (з 18,6 до 6,6 г ЕПС/г біомаси). 15 Таблиця 1 Синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату і С6-сполук Субстрат Фумарат + глюкоза (найближчий аналог) Фумарат + меляса 20 25 30 35 40 45 ЕПС, г/л ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г біомаси 9,8±0,45 18,6±0,80 10,8±0,50 6,6±0,32 Це явище може бути зумовлене наявністю у середовищі як мінерального джерела азоту (у вигляді NH4Cl), так і азоту, що входить до складу меляси. Відомо, що меляса містить до 1,8 % азоту, третя частина якого перебуває у формі бетаїну, що практично не засвоюється мікроорганізмами. Отже, концентрація доступного для бактерій азоту меляси становить близько 0,8-1,2 %. Враховуючи концентрацію меляси у середовищі культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 (0,5 % за вуглеводами), вміст "мелясного" азоту (за елементом N) середовищі становить 0,1 г/л. Така сама кількість азоту міститься в 0,4 г/л NH 4CІ. Отже, рівень біомаси за умов росту продуцента ЕПС на середовищі з фумаратом і мелясою повинен бути удвічі вищим, ніж на аналогічному середовищі з фумаратом і глюкозою. Таким чином, для підвищення ефективності синтезу ЕПС у разі використання як субстрату суміші фумарату і меляси культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 слід здійснювати на середовищі, яке не містить мінерального джерела азотного живлення. Приклад 2 Вплив джерела мінерального азоту на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В7005 на середовищі з фумаратом і мелясою Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють на середовищах такого складу (г/л): середовище 1: КН2РО4 - 1,8; NH4CІ - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О 0,001; середовище 2: КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7H2O - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О - 0,001. У середовища додатково вносять 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату, 0,0006 % (масова частка) пантотенату кальцію. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш фумарату натрію (1,8 %, масова частка) і меляси (1,0 %, масова частка). Початкове pH середовища становить 7,0 (перед внесенням посівного матеріалу середовище підлужнюють 10 %-ним розчином калій гідроксиду). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищах 1 і 2, які як джерело вуглецю та енергії містить фумарат натрію (0,5 %). Концентрація інокуляту становить 10 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв) при 30 °C упродовж 90 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл.2, засвідчують, що виключення джерела мінерального азоту з середовища для одержання посівного матеріалу і культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 супроводжується підвищенням ЕПС-синтезувальної здатності у 2 рази порівняно з використанням середовища 1 (з 6,6 до 13,3 г ЕПС/г біомаси відповідно). 2 UA 98252 C2 Таблиця 2 Синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на безазотному середовищі з фумаратом натрію і мелясою Середовище для одержання інокуляту 1 (з NH4CІ) 2 (без NH4CІ) 5 10 15 20 Середовище для біосинтезу 1 (з NH4CІ) 2 (без NH4CІ) 2 (без NH4CІ) ЕПС, г/л 10,8±0,50 11,0±0,45 11,0±0,45 ЕПС-синтезувальна здатність, гЕПС/г біомаси 6,6±0,32 9,8±0,49 13,3±0,65 Приклад 3 Вплив якості посівного матеріалу на синтез ЕПС за умов росту Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату натрію і меляси Культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 здійснюють на середовищі 2 (див. приклад 2) з фумаратом натрію (1,8 %, масова частка) і мелясою (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (16-18 год.), вирощену на середовищі 2, яке як джерело вуглецю та енергії містить глюкозу (0,5 %), мелясу (1,0 %), фумарат натрію (0,7 %) та суміш фумарату і меляси (0,56 і 0,126 % відповідно). Концентрація інокуляту становить 10 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах на качалці (300 об/хв) при 30 °C упродовж 90 год. Показники синтезу ЕПС визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що найвищі показники синтезу ЕПС на суміші фумарату і меляси спостерігаються у разі використання посівного матеріалу, вирощеного на моносубстраті глюкози. Отже, використання як джерела вуглецю суміші фумарату натрію (1,8 %) і меляси (1,0 %) і посівного матеріалу, вирощеного на глюкозі, а також виключення мінерального джерела азотного живлення зі складу середовища дає змогу підвищити концентрацію синтезованого ЕПС і ЕПС-синтезувальну здатність в 1,2 рази порівняно з культивуванням Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на суміші фумарату і глюкози. Таблиця 3 Залежність синтезу етаполану на суміші фумарату і меляси від способу підготовки посівного матеріалу Джерело вуглецю у середовищі одержання інокуляту Глюкоза Меляса Фумарат Фумарат + меляса ЕПС, г/л 11,8±0,55 10,6±0,53 11,0±0,45 10,9±0,45 ЕПС-синтезувальна здатність, г ЕПС/г біомаси 22,3±1,4 10,3±0,46 13,3±0,65 11,5±0,57 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб одержання екзополісахариду, який включає культивування Acinetobacter sp. ІMB В-7005 на поживному середовищі, що містить суміш ростових субстратів, мінеральні солі і ростові фактори, який відрізняється тим, що як джерело вуглецевого живлення використовують суміш фумарату натрію і меляси масовою часткою 1,8 і 1,0 % відповідно, вміст мінеральних солей у середовищі становить (г/л): КН2РО4 - 1,8; MgSO4×7Н2О - 0,4; СаСІ2×2Н2О - 0,1; FeSO4×7Н2О 0,001, а як посівний матеріал використовують культуру, вирощену на моносубстраті глюкози масовою часткою 0,5 %. Комп’ютерна верстка А. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3