Спосіб одержання полімерних кон’югатів доксорубіцину з рн-контрольованим вивільненням лікарської речовини

1. Спосіб одержання полімерних кон'югатів N(2-гідроксипропіл)метакриламіду і метакрилоїламіноацилгідразону з доксорубіцином з рНконтрольованим вивільненням лікарської речовини, який відрізняється тим, що здійснюють наступні три стадії синтезу: a) одержання мономерного метакрилоїламіноацилгідразину, де аміноацил - похідна амінокислоти або олігопептиду, реакцією метакрилоїлгаліду з відповідним пептидом, амінокислотою або їх похідними і подальшим гідразинолізом, b) синтез полімерного прекурсору безпосередньою співполімеризацією N-(2гідроксипропіл)метакриламіду з метакрилоїламіноацилгідразином, і с) зв'язування доксорубіцину з полімерним прекурсором реакцією їх з гідрохлоридом доксорубіцину. 2. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що ацилування на стадії (Іа) здійснюють реакцією гідрохлориду метилового естеру відповідної амінокислоти або олігопептиду з метакрилоїлхлоридом в хлорованому вуглеводні у присутності безводного карбонату натрію. 3. Спосіб за пунктом 1 або 2, який відрізняється тим, що гідразиноліз здійснюють реакцією метилового естеру метакроїлованої амінокислоти або олігопептиду з гідразингідратом у присутності сильної основи. 2 (19) 1 3 Винахід відноситься до способу одержання водорозчинних полімерних протиракових лікарських засобів, здатних до цільової доставки і контрольованого вивільнення цитостатиків в організмі, переважно в тканині і клітинах пухлини. Використання полімерних кон'югатів зосереджено на цілеспрямованій терапії пухлинних захворювань у людей. Розвиток нових фармакологічно-активних субстанцій, особливо протиракових лікарських засобів, все більш і більш був зосереджений на таких формах, які забезпечують можливість специфічної дії активної субстанції тільки в специфічній тканині, або навіть тільки в специфічному типі клітин. Природні або синтетичні макромолекули - полімери - все більш і більш використовувані для одержання таких субстанцій. Було одержано і досліджено багато протиракових полімерних кон'югатів і показано, що в більшості випадків необхідно, щоб цитотоксична субстанція вивільнялась з її полімерної форми, якщо полімерна форма лікарського засобу повинна бути фармакологічно-ефективною. Крім того, показано, що прийнятна молекулярна вага полімерного носія може гарантувати переважне розташування полімерної лікарської речовини в тканині багатьох солідних пухлин (так званий EPR ефект) [Maeda та інші. 2000]. Вивільнення цитостатичного агента із його полімерного носія може бути забезпечене з використанням здатного до біодеструкції зв'язку, що використовується для зв'язування лікарської речовини з полімером, деструкція якого в цільовій тканині приводить до цільового і контрольованого активування лікарської речовини переважно в згадуваній тканині. Полімерні лікарські засоби на основі співполімерів N-(2гідроксипропіл)метакриламіду (НРМА) - важлива група таких медикаментів. Дуже хороший короткий огляд результатів дослідження в цій галузі аж до представлених може бути знайдений монографії G. S. Kwon і в публікації J. Kopecek та інші. [Коресек та інші. 2000, Kwon 2005]. Недавно були опубліковані дослідження активності полімерних лікарських засобів, в яких протиракова лікарська речовина - доксорубіцин, зв'язана з полімерним носієм на основі НМРА співполімерів за допомогою гідролітично нестабільного гідразонового зв'язку [Etrych та інші. 2001 і 2002, Rihova та інші. 2001, Ulbrich та інші. 2003, 2004], і ці субстанції були запатентовані [Ulbrich та інші.]. Ці лікарські засоби показали істотне зменшення побічних, особливо токсичних, ефектів на здоровий організм, водночас збільшуючи протираковий ефект, порівняно із зазвичай використовуваними цитостатиками [Rihova та інші. 2001, Kovar та інші. 2004, Hovorka та інші. 2002]. Синтез таких кон'югатів вперше здійснювався полімер-аналогічною реакцією полімерних естерів 4-нітрофенілу (ONp) з гідразином, і пізніше співполімеризацією НРМА з NBoc (трет-бутилоксикарбонілом), захищеним метакрилоїлованими гідразидами. Жоден із способів не приводив до утворення цілком визначених препа 94594 4 ратів (у разі естерів ONp, мають місце реакції передачі ланцюга і гідролізу частини груп ONp в процесі гідразинолізу; у разі Вос-гідразидів відбуваються реакції деструкції зустрічаються протягом депротектування гідразидних груп), і жоден з способів не здатний підібрати широкий інтервал молекулярної ваги полімерного ланцюга; синтез не зробив можливим одержання великих партій, і відтворюваність одержання індивідуальних партій була відносно низькою. Окрім того, синтези включали декілька стадій, які збільшили їх час і фінансові витрати. Даний винахід забезпечує оптимізований і відтворюваний спосіб одержання полімерних цитостатиків на основі НМРА співполімерів, що містять доксорубіцин, зв'язаний рН-лабільним гідразоновим зв'язком з полімерним носієм, який виключає практично всі вищезазначені недоліки згаданих раніше способів одержання; зокрема, робить можливим збільшення виходу протягом синтезу як мономерів, так і полімерних прекурсорів, точне контролювання молекулярної ваги полімерних прекурсорів і кінцевого продукту; структура, завдяки переважним параметрам співполімеризації, є цілком визначеною, синтез є значно легшим і дешевшим, можливим збільшення його до великих партій, і відтворюваність синтезу є дуже хорошою. Протипухлинна активність полімерних цитостатиків, одержаних згідно з винаходом, така ж, або навіть краща, ніж, цитостатиків, одержаних попередніми способами. Предмет винаходу полягає в способі одержання полімерного кон'югату НМРА співполімеру, що містить зв'язаний з полімером доксорубіцин за допомогою різних зв'язків, що містять гідролітично розщеплювані гідразонові зв'язки. Спосіб одержання базується на трьох-етапному синтезі, що включає синтез мономерів, синтез полімерних прекурсорів і кінцеве зв'язування доксорубіцину з полімерним носієм ковалентним гідразоновим зв'язком. Синтез мономерів починається з синтезу мономера НРМА згідно описаному раніше способу [Ulbrich 2000]. Синтез метакрилоїл(аміноацил)гідразинів, що відрізняються структурою ацильного компонента, був дуже схожим для всіх одержаних мономерів і починається з метакрилоїлування гідрохлориду метилового естеру відповідної амінокислоти або олігопептиду з метакрилоїлхлоридом, здійснюваного в дихлорметані у присутності безводного карбонату натрію. Одержаний продукт перетворювали у метакрилоїлований аміноацилгідразин гідразинолізом відповідного метилового естеру з гідратом гідразину, здійснюваним у метанольному розчині у присутності NaOH. Гліцил, гліцилгліцил, β-аланіл, 6аміногексаноїл, 4-амінобензоїл або складний ацил, утворений з олігопептидів GlyPheGly, GlyLeuGly, або GlyPheLeuGly, переважно використовувався як аміноацил в метакрилоїл(аміноацил)гідразинах. Як приклади синтезу метакрило 5 їл(аміноацил)гідразину, Приклад 1 ілюструє синтез 6-метакроїл(аміногексаноїл)гідразину як приклад синтезу простого ацилу (спейсеру), метакроїлгліцилгліцилгідразину як мономера з дипептидним спейсером, і метакроїлгліцилфенілаланіллейцилгліцилгідразину як мономера з ензиматично дестрктуючим олігопептидом. Синтез полімерних прекурсорів - НМРА співполімерів з метакрилоїлованими аміноацилгідразинами - заснований на безпосередній радикальній співполімеризації НРМА з відповідними метакрилоїлованими гідразинами. Полімеризація здійснюється в розчині, використовуючи метанол, етанол, диметилсульфоксид або диметилформамід як середовище полімеризації. В обох випадках полімеризацію ініціюють здатними до терморозкладання ініціаторами радикальної полімеризації на основі азо- або перокси- ініціаторів. Переважно, використовувалися азобіс(ізобутиронітрил) (AIBN), азобіс(ізоціановалеріанова кислота) (АВІС), або діізопропілперкарбонатом (DIP). Температура полімеризації залежить від використовуваного ініціатора і розчинника (для AIBN, АВІС в метанолі, етанолі, DMF, і DMSO, температура складає 50 60 °С; для DIP - 40 - 50 °С). Полімеризація зазвичай триває 15-18 годин. Одержання всіх полімерних прекурсорів радикальною полімеризацією аналогічне; приклади співполімеризації НРМА з метакрилованими гідразидами надаються в Прикладах 2а - 2с. Порівняно з раніше використовуваним гідразинолізом реактивних естерів або співполімеризацією Вос-захищених гідразидів, пряма співполімеризація приводить до чистих і відтворювано-одержуваних полімерів, які можуть бути одержані у великих партіях і з високим виходом. Зв'язування доксорубіцину з полімерним прекурсором - результат реакції зв'язування гідрохлориду доксорубіцину з полімерним ацилгідразином, що приводить до гідразонового зв'язку. Реакція переважно здійснюється в метанолі, каталізується певною кількістю оцтової кислоти. Реакція може також здійснюватися в диметилсульфоксиді, диметилформаміді, сухому етанолі і диметилацетаміді. Використовуючи розчинники інші, ніж метанол, реакція відбувається добре, але вихід нижчий. Вплив структури зв'язку на хід реакції зв'язування мінімальний. Щоб досягти оптимального виходу реакції зв'язування і мінімальної кількості незв'язаного доксорубіцину в продукті, важливо, у всіх випадках, підтримувати наступні концентрації полімеру і оцтової кислоти в реакційній суміші: концентрація полімеру 170 мг/мл, концентрація оцтової кислоти 55 мг/мл. Оптимальний час реакції складає 22 години при 25 °С. Полімерний лікарський засіб відокремлюється від реакційної суміші осаджуванням в етилацетаті і повторним осаджуванням з метанолу і знову в етилацетаті. Одержання полімерного доксорубіцину, зв'язаного з полімерним прекурсором - співполімером Полі(НРМА-Со-МА-АН-NНNН2) - гідразоновим зв'язком (PHPMA-AH-NH-N=DOX) надається в Прикладі 3. Одержання також включає, хоча це не є необхідним, кінцеве очищення кон'югату від незв'язаного вільної лікарської речовини фільтрацією на гелі, 94594 6 використовуючи Sephadex колонку LH-20 з метанолом як мобільною фазою. Фіг. 1 представляє графік, що показує вивільнення DOX з полімерних кон'югатів, що відрізняються структурою зв'язку між лікарською речовиною і полімером. Температура: 37 °С, фосфатний буфер, рН 5,5, GFLG - зв'язок, утворений послідовністю GlyPheLeuGly-, GLG є -GlyLeuGly-, амінобензойний - 4-амінобензоїл, і Асар є 6-аміногексаноїл. Приклади Приклад 1: Синтез мономерів НРМА одержували відповідно до попередньо описаного способу [Ulbrich та інші. 2000]. Елементний аналіз: Обчислено: С 58,8 %, Η 9,16 %, Ν 9,79 %. Одержано: С 58,98 %, Η 9,18 %, Ν 9,82 %. Продукт був хроматографічно чистий. 6-(Метакроїламіно)гексаноїлгідразин (ΜΑ-ΑΗΝΗΝΗ2) Метил (6-аміногексаноат)гідрохлорид (30 г, 0,165 моль) при інтенсивному перемішуванні при кімнатній температурі розчиняли в 350 мл дихлорметану з додаванням приблизно 100 мг гідрохінону. Розчин охолоджували до 10-15 °С, додавали безводний карбонат натрію (50 г, 0,48 моль), температуру знижували до 5 - 10 °С, і потім додавали краплями розчин метакроїлхлориду (17,3 г, 0,165 моль (екв.)) в 100 мл дихлорметану з такою швидкістю, щоб температура реакційної суміші не перевищувала 15 °С. Після того як увесь метакроїлхлорид вступав в реакцію, суміш перемішували при 15 - 20 °С протягом додаткових 45 хвилин, потім охолоджуючу ванну вилучали, суспензію перемішували ще 20 хвилин, відсмоктували на фільтрі із пористого скла № 3, промивали 300 мл дихлорметану і фільтрат випарювали до сухого залишку в ротаційному вакуумному випарнику. Залишок випарювання розчиняли в 150 мл метанолу, потім додавали гідразингідрат (13 мл, 13,4 г, 0,267 моль) і NaOH (1,5 г, 37,5 ммоль), і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 3 годин. Після того, як гідразиноліз був завершений, рН розчину коригували до 6,2 -6,5 додаванням 35% НСІ (приблизно 12 мл), додавали 300 г безводного сульфату натрію і суміш, включаючи десикант, випарювали до сухого залишку. Додавали до залишку випарювання 500 мл дихлорметану, суспензію інтенсивно перемішували протягом 2 годин, відсмоктували на фільтрі із пористого скла № 4, повністю промивали додатковими 500 мл дихлорметану, і фільтрат концентрували до 150 200 мл у випарнику. Розчин розбавляли 1500 мл етилацетату, концентрували для кристалізації до об'єму 300 - 350 мл у випарнику, і кристалізували в крижаному боксі протягом 24 годин. Продукт відсмоктували, промивали невеликою кількістю холодного етилацетату, висушували у вакуумі. Вихід після першої кристалізації склав 29,5 г продукту (84%) з температурою плавлення 79-81 °С; повторна кристалізація, використовуючи той же спосіб, надала 27,0 г продукту (77 %) з температурою плавлення 80-82 °С. Елементний аналіз: Обчислено: С 56,32 %, Η 8,98 %, Ν 19,70 %. Одержано: С 56,49 %, Η 8,63 %, Ν 19,83%. 7 Н-ЯМР 300 Мгц (CDCI3, 297 К): 1,35 м (2Н, CH2(CH2)2-N); 1,50-1,69 м (4Н, CH2CH2CH2CH2-N); 1,95 дд (3Н, СН3); 2,17 т (2Н, ((С=О)-СН2); 3,26 дт (2Н, N-CH2); 3,91 с (2Н, NH2); 5,30 т (1Η, С=СН2 Е); 5,67 т (1Н, С=СН2 Ζ); 6,10 с (1Н, ΝΗΝΗ2); 7,45 с (1Н, NH-CH2). Продукт був хроматографічно чистий, 1 пік на 4,72 хв (зворотно-фазова колонка Tessek SGX С18 (7 мкм, 125  4 мм), швидкість потоку 0,5 мл/хв, градієнт з 40 до 100 % розчину В за 35 хв (розчин А: 10 % метанол, 89,9 % вода, 0,1 % трифтороцтова кислота (TFA); розчин В: 89,9 % метанол; 10 % вода; 0,1 % TFA), ультрафіолетове виявлення). Метакроїлгліцилгліцилгідразин (MA-GlyGlyNHNH2) Одержання MA-GlyGly-NHNH2 здійснювали в подібних умовах, як для MA-AH-NHNH2. Метиловий естер гліцилгліцину (21,4 г, 0,1 моль) був розчинений в 250 мл дихлорметану з додаванням 60 мг гідрохінону. Після охолоджування до приблизно 12 °С додавали безводний карбонат натрію (30,2 г, 0,29 моль), і при охолоджуванні до 5-10 °С додавали повільно краплями розчин метакроїлхлориду (10,4 г, 0,1 моль) в 60 мл дихлорметану. Після завершення реакції, фільтрування і промивання осаду з приблизно 230 мл дихлорметану, розчинник повністю випарювали. Залишок випарювання розчиняли в 120 мл метанолу і піддавали гідразинолізу гідразингідратом (7,9 мл, 8,1 г, 0,166 моль) в присутності NaOH (0,91 г, 22,7 ммоль). Після завершення гідразинолізу, рН розчину коригували до 6,2 - 6,5 додаванням 35% НСІ (приблизно 12 мл), додавали 230 г безводного сульфату натрію, і суміш, включаючи десикант, випарювали до сухого залишку. Після екстрагування з 300 мл дихлорметану, суспензію відсмоктували на фільтрі із пористого скла, промивали додатково 300 мл дихлорметану, і фільтрат концентрували до приблизно 120 мл. Розчин розбавляли 900 мл етилацетату і після концентрування до 250 мл у випарнику, кристалізували в морозильному боксі. Після перекристалізації продукт відокремлювали фільтрацією, промивали невеликою кількістю холодного етилацетату і сушили у вакуумі. Вихід продукту становив 15,0 г (70 %), температура плавлення 172-174 °С. Елементний аналіз: Обчислено: С 44,86 %, Η 6,54 %, Ν 26,16 %. Одержано: С 45,01 %, Η 6,57 %, Ν 26,02 %. Продукт був хроматографічно чистий, один пік на 21,97 хв. Метакроїлгліцилфенілаланіллейцилгліцилгідразин (MA-Gly-D,L-PheLeuGlyNHNH2). Синтез цього мономера здійснювався аналогічним шляхом, як в обох попередніх випадках (див. вище). Склад реакційної суміші і умови були, як вказано нижче: метиловий естер гліцилфенілаланіллейцилгліцину (22,32 г, 0,05 моль), дихлорметан 510 мл (270 + 240 мл), гідрохінон (60 мг), карбонат натрію (15,1 г, 0,145 моль) і метакроїлхлорид 5,2 г (0,05 моль) використовували для одержання метакрилованого метилового естеру. Для гідразинолізу використовували 4,1 г (0,085 моль) гідразингідрату в 120 мл метанолу і 0,46 г (11,3 ммоль) NaOH. Для висушування використовували 210 г безводного сульфату натрію, і 2 94594 8  290 мл дихлорметану використовували для екстрагування. Продукт кристалізували із суміші дихлорметан-етилацетат. Вихід продукту становив 60 %, температура плавлення 139-140 °С. Елементний аналіз: Обчислено: С 58,10 %, Η 7,36 %, Ν 17,68 %. Одержано: С 58,21 %, Η 7,39 %, Ν 17,54 %. Продукт був хроматографічно чистий, два піки, що мають однакову площу при 19,39 (L-Phe, що містить мономер) і 19,91 хв (D-Phe). Приклад 2а: Синтез полімерного прекурсора співполімера НРМА з 6-(метакроїламіно)гексаноїлгідразином (полі(НРМА-спів-МА-АНМНМН2)) Співполімер полі(HPMA-спів-MA-AH-NHNH2) одержували радикальною співполімеризацією розчину НРМА і MA-AH-NHNH2, ініційованою AIBN в метанолі при 60 °С. 122,8 г НРМА і 13,94 г MA-AHNHNH2 (18 мас% мономерів) розчиняли в 780 мл метанолу і додавали до розчину 6,06 г AIBN (0,8 мас%). Після фільтрації полімеризаційну суміш поміщали в атмосфері аргону в реактор полімеризації (об'ємом 1,5 л), розташований в термостаті. Полімеризаційну суміш перемішували при швидкому обертанні (близько 100 обертів у хвилину). Азот вводили над поверхнею протягом ще декількох хвилин. Температуру полімеризаційної суміші доводили до 60 °С, і полімеризацію продовжували при перемішуванні (50 об./хв.) в атмосфері азоту. Азот видаляли через барботувальний пристрій. Через 17 годин полімеризаційну суміш виймали з термостату, охолоджували у ванні до кімнатної температури і полімер відокремлювали осадженням в етилацетаті (8 л в цілому). Осаджений полімер піддавали седиментації приблизно 0,5 годин, розчин над осадом видаляли відсмоктуванням і полімер відокремлювали фільтрацією через фільтр із пористого скла S4. Осад промивали етилацетатом, переносили у великі чашки Петрі, і висушували при кімнатній температурі в вакуумі, використовуючи мембранний вакуумний насос, приблизно 1 годину. Використовуючи ультразвук, полімер розчиняли в 550 мл метанолу (однолітрова колба Erlenmeyer) і осаджували 7,5 л етилацетату таким же чином, як протягом першого виділення. Осаджений полімер після седиментації протягом приблизно 0,5 годин виділяли фільтрацією через фільтр із пористого скла S4, промивали етилацетатом і висушували до постійної ваги, використовуючи мембранний вакуумний насос (до приблизно 5 годин), і сушильний процес завершували з використанням масляно-дифузійного насосу. Характеристика співполімера: Вихід 114 г (83 %), вміст гідразидних груп 5,83 моль %, молекуляра вага Mw = 28500 г/моль, індекс полідисперсності Іn = 1,9. Приклад 2b: Синтез полімерного прекурсора співполімера ΗΡΜА з метакроїлгліцилгліцилгідразином (полі(HPMA-спів-MA-GlyGly-NHNH2)) Конфігурація і процедура полімеризації були тими ж, як в Прикладі 2а, різниця була в складі полімеризаційної суміші. Склад полімеризаційної суміші був таким, як вказано нижче: НРМА 10 г, (70 ммоль), MA-GlyGly-NHNH2 1,5 г (7 ммоль), діізопропілперкарбонатом 1,15 г (0,91 мас%), і димети 9 лформамід 115 мл. Температура полімеризації 50 °С, і полімеризація відбулася за 16 годин. Полімеризаційний розчин перед осаджуванням в надлишку етилацетату концентрували до приблизно 2/3 його початкового об'єму у вакуумному випарнику, і осадження полімерного продукту здійснювали в 20-кратному об'ємі осаджувача. Полімер позбавляли від низькомолекулярних сумішей осаджуванням з метанолу в етилацетаті. Вихід склав 8,5 г (70 %), вміст гідразидних груп - 9,5 моль %, молекулярна вага Mw = 41700 г/моль, індекс полідисперсності Іn = 2,1. Приклад 2с: Синтез полімерного прекурсора співполімера НРМА з метакроїлгліцилфенілаланіллейцилгліцил гідразином (полі(НРМА-спів-МАСІуРheLеuСІу-NНNН2)). Процедура полімеризації була тією ж, як в Прикладі 2а, різниця була знову тільки в складі полімеризаційної суміші. Склад полімеризаційної суміші був таким, як вказано нижче: НРМА 10 г, (70 ммоль), HPMA-спів-MA-GlyPheLeuGly-NHNH2 2,5 г, (5,6 ммоль), азобіс(ізоціановалеріанова кислота) 1,125 г (1 мас%), і диметилсульфоксид 100 мл. Полімеризацію здійснювали при 55 °С і завершували через 18 годин. Полімер виділяли із полімеризаційної суміші осаджуванням в 20-кратному надлишку етилацетату. Полімер очищували повторним осаджуванням з метанолу в етилацетаті. Вихід склав 9,75 г (78 %), вміст гідразидних груп 5,5 моль %, молекулярна вага Mw = 43200 г/моль, індекс полідисперсності Іn = 2,1. Приклад 3: Одержання полімерного кон'югату PHPMA-AH-NH-N=DOX Співполімери з DOX, зв'язаним з РНРМА носієм гідролітичним розщепленням гідразонового зв'язку, були одержані реакцією гідразидмістких груп співполімерів полі(НРМА-спів-MA-AH-NHNH2) з DOX.HCI в метанолі, каталізованою оцтовою кислотою. Розчин 15,384 г співполімера полі(НРМА-співМА-АН-NНNН2) в 92,1 мл метанолу (167 мг полімеру/мл) поміщали в кювету термостату, в якому було розміщено 2,5 г DOX.HCI (4,3 ммоль). Неоднорідну суспензію перемішували в темноті при 25 °С і через одну хвилину додавали 4,9 мл оцтової кислоти (загальний об'єм 116 мл). Суспензію поступово розчиняли в ході реакції, і через 22 години реакції полімерний продукт виділяли із гомогенного розчину осаджуванням в 1 л етилацетату; осад полімерного медикаменту відокремлювали фільтрацією через фільтр із пористого скла S4, промивали 150 мл етилацетату і висушували до постійної ваги. Загальну кількість DOX визначали спектрально. Mw і Мn визначали рідинною хроматографією (LC АКТА) з аналізом світлорозсіювання (DAWN DSP багато ракурсний детектор, Wyatt). Характеристика полімерного медикаменту. Загальний вихід реакції зв'язування медикаменту: 17,2 г (96 %), загальний вміст DOX: 11,3 мас%, вільний DOX: 1,52 % поза загальним вмістом DOX. Приклад 4: Вивільнення доксорубіцину з полімерних кон'югатів. Вивільнення доксорубіцину з кон'югатів, відмінних за структурою зв'язку між лікарською речовиною і полімером, здійснювали інкубуванням в 94594 10 0,1 Μ фосфатному буфері, що містив 0,15 Μ NaCI при 37 °С. рН буфера коригували до умов ендосоми клітини, тобто до злегка кислотного середовища з рН 5,5. Аліквотні частини інкубувального середовища випробовували з відповідними проміжками, і вміст DOX визначали - після додавання карбонатного буфера (0,1 Μ Na2CO3 + 4 Μ NaCI), після екстрагування у хлороформі і після випаровування розчинника і переносу у метанольний розчин - за допомогою ВЕРХ (Shimadzu VP), використовуючи зворотно-фазову колонку (Tessek SGX С18, 7 рм, 125  4 мм), швидкість потоку елюента: 0,5 мл/хв, градієнт з 40 до 100 % розчину В за 35 хвилин (розчин А: 10 % метанол, 89,9 % вода, 0,1 % трифтороцтова кислота (TFA); розчин В: 89,9 % метанол; 10 % вода; 0,1 % TFA). Використовували для визначення флуоресцентний детектор (Shimadzu RF-IOAXL) (ехс = 480 нм, еm = 560 ran). Криву калібрування будували, використовуючи доксорубіцин. Результати вимірювання вивільнення медикаменту із кон'югатів, відмінних за структурою використовуваного зв'язку (спейсера), показані на Фіг. 1. Джерела інформації: Т. Etrych, M. Jelinkova, Β. Rihova, К. Ulbrich, Нові співполімери НРМА, що містять зв'язаний доксорубіцин через рН сенситивний зв'язок. Синтез, біологічні властивості in vitro і in vivo. J, Controlled Rel. 73, 89-102 (2001) T. Etrych; P. Chytil, M. Jelinkova, B. Rihova, K. Ulbrich, Синтез НМРА співполімерів, що містять доксорубіцин, зв'язаний через гідразоновий зв'язок. Вплив спейсера на вивільнення медикаменту і цитотоксичність in vitro. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002). О. Hovorka, Т. Etrych, Μ. Subr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Rihova, Відмінності у внутрішньоклітинній дії вільного і полімер-зв'язаного доксорубіцину. J. Controlled Release 80, 101-117(2002). J. Kopecek, P. Kopeckova, T. Minko, Z. Lu, Кон'югат НМРА співполімер-протиракова лікарська речовина: Дизайн, Активність і Механізм Дії. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000) Μ. Kovar, L. Kovar, V. Subr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucka, і В. Rihova, НМРА співполімери, що містять доксорубіцин, зв'язаний протеолітично або гідролітично розшеплюваним зв'язком: порівняння біологічних властивостей in vitro. J. Controlled Release 99, 301- 314 (2004). G. S. Kwon, Полімерні системи доставки медикаменту, серії: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, том 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005. H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hori, Судинна проникність пухлини і EPR ефект в макромолекулярній терапії: огляд. J Control Release 65, 271-284 (2000) В. Rihova, T. Etrych, M.. Pechar, Μ.. Jelinkova, Μ.. St'astny, Ο. Hovorka, M. Kovar, Κ. Ulbrich, Ефективність зв'язаного доксорубіцину з носієм НРМА співполімера через гідразоновий зв'язок на клітинній лінії раку з обмеженим вмістом лізосом. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001). 11 94594 K. Ulbrich, V. Subr, J. Strohalm, D. Plocova, M.. Jelinkova, B. Rihova, Полімерні медикаменти на основі синтетичних і природних макромолекул І. Синтез і фізико-хімічні показники. J.Controlled Rel. 64, 63-79 (2000). K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M.. Jelinkova, B. Rihova, Кон'югати антитіло-цільовий полімердоксорубіцин з РН-контрольованим активуванням. J. Drug Targeting, 12, 477-490 (2004). K. Ulbrich, Т. Etrych, P. Chytil, Μ. Jelinkova, В. Rihova, HMPA співполімери з рН-контрольованим Комп’ютерна верстка Л. Купенко 12 вивільненням доксорубіцину. Цитотоксичність in vitro та протипухлинна активність in vivo. J. Controlled Release 87, 33-47 (2003). K. Ulbrich, Т. Etrych, P. Chytil, M.. Pechar, M. Jelinkova, B. Rihova, Полімерні протиракові лікарські засоби з РН-контрольованим активуванням. Int. J. Pharm. 277/1-2 67-72 (2004). К. Ulbrich, Т. Etrych, В. Rihova, Μ. Jelinkova, Μ.. Kovar: РН-сенситивний полімерний кон'югат антрациклінового цитостатика для цілеспрямованої терапії. CZ 293787; WO 03/053473. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601