Спосіб зберігання та транспортування клітин

Реферат: Спосіб зберігання та транспортування клітин включає їх утримання за позитивних температур у герметичних пробірках з культуральним середовищем. Клітини попередньо інкапсулюють у альгінатні мікросфери. UA 95902 U (54) СПОСІБ ЗБЕРІГАННЯ ТА ТРАНСПОРТУВАННЯ КЛІТИН UA 95902 U UA 95902 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології і клітинної біології і може бути використана для транспортування та зберігання клітин за позитивних температур для подальшого їх використання у експериментальних та клінічних цілях. На даний час різноманітні типи клітин знаходять усе ширше використання у галузі біотехнології, тканинної інженерії, трансплантології, а також при вирішенні низки теоретичних і практичних задач клітинної біології. У той же час, однією з умов лабораторного та клінічного застосування клітин є використання відносно простих методів їх зберігання і транспортування між різноманітними профільними установами із збереженням усіх клітинних властивостей. Типовим способом зберігання та транспортування клітин є кріоконсервування з використанням повільного ступеневого охолодження до -196 °C у кріозахисному середовищі, що містить 10 % ДМСО і ембріональну сироватку великої рогатої худоби [1]. Недоліком даного способу є використання високих концентрацій ДМСО, що має токсичний вплив на клітини, а також використання сироватки ксеногенного походження, яка може бути джерелом інфекцій та викликати імунні реакції під час інфузій. Крім цього він вимагає використання спеціалізованого обладнання і є економічно витратним [2, 3]. Відомий спосіб зберігання та транспортування клітин за температури навколишнього середовища у культуральних флаконах, повністю заповнених культуральним середовищем [4]. Недоліком даного способу є обмеження кількості клітин, які зберігаються або транспортуються, що залежить від площі поверхні дна флакону. Крім цього він вимагає використання великих об'ємів культурального середовища, що робить даний спосіб економічно витратним. Водночас існує ймовірність механічного пошкодження морфо-функціональних властивостей клітин під час їх зберігання або транспортування. У зв'язку з цим важливим питанням є розробка нових способів ефективного та економічно вигідного зберігання і транспортування клітин у відсутності токсичних хімічних сполук і речовин ксеногенного походження. Найбільш близьким до заявленого є спосіб зберігання та транспортування клітин у вигляді суспензії за кімнатної температури (18-22 °C) у герметично закритих пробірках з додаванням культурального середовища [5]. Недоліком даного способу є значне зниження життєздатності клітин - до 50 % вже на 2 добу зберігання або транспортування. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб зберігання та транспортування клітин, який би дозволив подовжити строки зберігання та транспортування клітин за позитивних температур із збереженням високих показників життєздатності. Поставлена задача вирішується тим, що в способі зберігання та транспортування клітин, який включає їх утримання за позитивних температур у герметичних пробірках з культуральним середовищем, згідно з корисною моделлю, клітини попередньо інкапсулюють у альгінатні мікросфери (АМС). Даний спосіб зберігання та транспортування дозволяє підвищити життєздатність клітин на 23-38 % та збільшити строки зберігання до 3 діб. Спосіб здійснюється таким чином. Клітини змішують з 1,2 %-м розчином альгінату натрію і далі по краплях вносять у розчин 100 мМ СаСl2 для полімеризації АМС. Отримані АМС переміщують у герметичні пробірки, що містять культуральне середовище, і транспортують або зберігають за позитивних температур. Перед використанням АМС розчиняють 50 мМ розчином цитрату. Спосіб ілюструється наступними прикладами. Приклад 1. Вплив короткострокового зберігання на морфо-функціональні властивості мезенхімальних стромальних клітин (МСК). МСК виділяли з письмової згоди проінформованих донорів відповідно до рекомендацій Гельсінської декларації Всесвітньої асоціації по проведенню біомедичних досліджень. Клітини " 2 культивували впродовж 4-6 пасажів у культуральних флаконах з площею поверхні 75 cм ("Nunc", США) у середовищі α-МЕМ ("Sigma", США), доповненої 10 % ембріональної сироватки (ЕС) великої рогатої худоби ("Біолот ", Росія), 100 од. пеніциліну, 100 мкг стрептоміцину, за умов 37 °C, 95 %-ї вологості і 5 % СО2. Перед інкапсуляцією клітини знімали за допомогою суміші трипсин-версену (1:4), осаджали шляхом центрифугування за умов 700 об/хв протягом 7 хв і змішували із 1,2 %-м розчином 6 альгінату натрію (Sigma, США). Отриману суспензію з концентрацією 1,5 × 10 клітин/мл поміщали у стерильний шприц об'ємом 2 мл та покапельно вносили у 100 мМ розчин СаСl2. Альгінатні мікросфери з клітинами залишали у розчині СаСl2 на 10 хв за для полімеризації альгінату, після чого проводили ступінчасте відмивання АМС від надлишку іонів кальцію 1 UA 95902 U 5 10 15 20 25 розчином 0,15 М NaCl і 25 мМ HEPES (рН 7,4). Описаний спосіб дозволяв отримувати мікросфери з розмірами в діапазоні 1800-2000 мкм. Далі АМС переносили у герметичні пробірки ("Nunc", США) з додаванням культурального середовища. АМС у герметично закритих пробірках зберігали за позитивних температур, імітуючи умови транспортування. Для порівняння МСК зберігали і у вигляді суспензії. Після цього АМС розчиняли 50 мМ розчином цитрату натрію з подальшим монопрошарковим культивуванням клітин. Життєздатність деінкапсульованних клітин оцінювали з використанням МТТ (3-(4,5-діметілтіазол-2-іл)-2,5-діфенілтетразоліум броміду) тесту як співвідношення МТТ позитивних клітин (клітини, що накопичили темні гранули формазану) до загальної кількості клітин. Даний тест заснований на здатності життєздатних клітин відновлювати солі тетразолію, найбільш розповсюдженою з яких є МТТ. Метаболічну активність клітин оцінювали за ступенем відновлення редокс-індикатора резазуріну ("Serotec", Великобританія). З таблиці 1 видно, що інкапсуляція МСК у АМС сприяла збереженню клітинами високих показників життєздатності до 3 діб інкубації. Водночас, зберігання МСК за умов прототипу призводило до їх агрегації і значного зниження життєздатності вже на 1 добу інкубації. Інкапсуляція МСК у АМС перешкоджала агрегації і дозволяла зберегти клітинам відокремлений одна від одної стан. З таблиці 2 видно, що інкапсуляція сприяє збереженню клітинами здатності відновлювати резазурін до показників, близьких до контрольних. У свою чергу, зберігання МСК, згідно з прототипом, призводить до значного зниження здатності клітин відновлювати редокс-індикатор вже на 2 добу інкубації. Приклад 2. Вплив короткострокового зберігання на морфо-функціональні властивості фібробластів людини. Фібробласти отримували за методом вільної міграції клітин з частин експлантату за умов стандартного культивування даних клітин [6]. Спосіб зберігання здійснювали як у прикладі 1. Дані наведені в таблицях 3 і 4, з яких видно, що так само як і для МСК, інкапсуляція фібробластів в АМС сприяє збереженню високих показників життєздатності та метаболічної активності на відміну від фібробластів, що зберігалися у вигляді суспензії за прототипом. 30 Таблиця 1 Життєздатність МСК після зберігання Життєздатність, % Термін зберігання АМС 37 °C Контроль 1 доба 2 доби 3 доби Суспензія 22 °C 94,8±2,1 93±2,3 89,3±3 87,5±9,1 37 °C 22 °C 98,2±1,5 88±3,7 86,2±2,3* 78,3±3* 69,7±4*# 53,7±4,7*# 49,3±10,4*# Примітки: *- відмінності достовірні по відношенню до контролю (р