Спосіб виготовлення препарату на основі азотофіксуючих бульбочкових бактерій

1 Спосіб виготовлення препарату на основі азотофіксуючих бульбочкових бактерій, що включає вирощування азотофіксуючих бактерій, підготовку наповнювача, яка включає його висушування, розмелювання, зволожування, фасування, стерилізацію, перевірку на наявність сторонньої мікрофлори, та уведення у наповнювач азотофіксуючих бактерій і поживних речовин, який відрізняється тим, що як наповнювач використовують вермикулітний субстрат 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що у наповнювач додають ВІДХІД цукрового виробництва дефекат Винахід стосується способів виготовлення органічних добрив з добавкою культури бактерій За найближчий аналог обрано спосіб виготовлення препарату ризоторфін на основі азотфіксуючих бульбочкових бактерій (Методические рекомендации «Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе» Академия сельскохозяйственных наук, Ленинград, 1991, 60с, стр31) Ризоторфін призначений для передпосівної обробки насіння бобових культур з метою підвищення їх врожайності і вмісту білка Дія ризоторфіну основана на використанні здатності бульбочкових бактерій фіксувати атмосферний азот у симбіозі з бобовими рослинами В залежності від культур бактерій випускають два види препаратів ризоторфін, виготовлений із швидкоростучих бульбочкових бактерій (ШББ) роду Rhizobium, і ризоторфін, виготовлений із повільно зростаючих бульбочкових бактерій (ПББ) роду Bradyrhizobium Клітини бульбочкових бактерій вказаних родів являють собою палички шириною 0,5-1,0 мікронів і довжиною 1,0-7,0 мікронів, які часто є зігнутими Форма клітин бульбочкових бактерій змінюється при проходженні фази розвитку, а також під впливом складу середовища Вони проявляють високу специфічність до рослини-хазяїна Повільно зростаючі бульбочкові бактерії (ПББ) - сої, люпину, вигни, еспарцету, маша, арахісу та швидкоростучі буль бочкові бактерії (ШББ) -люцерни, конюшини, нугу, чини, донника, сочевиці, віки розрізняють у залежності від швидкості зростання на агаризованому середовищі На бобовому агарі ШББ через тричотири доби формують прозорі, округлі колонії в'язкої консистенції розміром 3,0-5,0мм і більше ПББ на десяту - п'ятнадцяту добу формують колони діаметром не більше 1,0-2,0мм, білого кольору випуклі, круглі, пастоподібні Спосіб виготовлення ризоторфіну включає отримання робочих культур, які вирощують у ємностях (колбах, бутлях, ферментерах) з коефіцієнтом заповнення поживного середовища 0,6% на квчалці при температурі 28-30°С протягом 3648годин Отриману ферментаційну рідину використовують для інокуляції стерильного торфу За наповнювач у ризоторфіні використовується торф з рН4,5-5,0 Його висушують до повітряно-сухого стану (20-25% вологи), розмелюють на млинах з одночасним просіюванням до розміру часток не більше 0,1мм Розмолотий торф завантажують у змішувач і добавляють приблизно 5% СаСОз або доломітове борошно для отримання рН6,8-7,0 та воду для отримання вологості 35-40% Після цього торф розфасовують у поліетиленові пакети і стерилізують, наприклад, гамма-промінням, джерелом яких є Со6 , дозою 2,5-5,0Мрад При необхідності здійснюють перевірку наповнювача на наявність сторонньої мікрофлори Далі стерильний 1 00 со Ю 53187 торф інокулюють ІН'ЄКЦІЄЮ охолодженої до 3-8°С суміші ферментаційної рідини і розчину поживних добавок (меляси, кукурудзяного екстракту і глюкози) Ознаками найближчого аналога, які збігаються з суттєвими ознаками винаходу є наявність у способі виготовлення препарату на основі азотфіксуючих бульбочкових бактерій вирощування азотфіксуючих бактерій, підготовку наповнювача,, яка включає його висушування, розмелювання, зволожування, фасування, стерилізацію, перевірку на наявність сторонньої мікрофлори, та уведення у наповнювач азотфіксуючих бактерій і поживних речовин Технічним результатом винаходу є зниження енергоємності та трудовитрат технологічного процесу, підвищення якості препарату Причинами, які перешкоджають досягненню технічного результату при використанні найближчого аналога, є використання торфу за субстратнаповнювач, що потребує значної енергоємності при отриманні гама-торфина, нестабільність фізиКО-ХІМІЧНИХ властивостей, висока заплідненість різними мікроорганізмами, необхідність використання торф'яників визначених видів, вказаних в технічних умовах, а також відсутність виробництва гама стерильних субстратів для виготовлення біопрепаратів в Україні В основу винаходу поставлено технічну задачу створення способу виготовлення препаратуна основі азотфіксуючих бульбочкових бактерій, нового бактеріального препарату - органічного добріша з використанням альтернативного наповнювач а-субстрату Поставлена технічна задача вирішена у Південному філіалі Інституту сільскогосподарської мікробіологи УААН, де розроблено спосіб виробництва препарату ризобофіт з використанням наповнювача - вермикулітного субстрату У способі виготовлення препарату на основі азотфіксуючих бульбочкових бактерій, що містить вирощування азотфіксуючих бактерій, підготовку наповнювача, яка вклютає його висушування, розмелювання, зволожування, фасування, стерилізацію, перевірку на наявність сторонньої мікрофлори, та уведення у наповнювач азотфіксуючих бактерій і поживних речовин, згідно винаходу, за наповнювач використовують вермикулітний субстрат Згідно винаходу, у наповнювач додають ВІДХІД цукрового виробництва дефекат Для приготування наповнювача використовується пилоподібна фракція (для додання йому гігроскопічності) вермикуліту - мінералу класу алюмосилікатів У сільському господарстві вермикуліт використовується для поліпшення структури грунту і як сорбент токсичних речовин Вибір цього наповнювача обумовлений рядом його позитивних властивостей Найбільш важливими перевагами вермикуліту перед торфом є сталість фізикоХІМІЧНИХ властивостей і значно менша заплідненість мікроорганізмами При високотемпературній термічній обробці (до 800°С він, на відміну від торфу, не утворює токсичних для мікроорганізмів речовин Стерилізацію можна проводити в промислових автоклавах і сухо повітряних стерилізаторах, які можна установити на заводах і в регіона льних лабораторіях За сорбціиною здатністю вермикуліт не уступає торфу, що створює можливість іммобілізації великої КІЛЬКОСТІ мікроорганізмів на його поверхні Вермикуліт має нейтральну або слабо лужну реакцію, торф - кислу (1,0-6,0) Торфи з нейтральним рН містять багато спор грибів і бактерій і не придатні для виробництва субстрату Вермикуліт має більш високу адгезійну здатність, що виключає застосування клейких речовин, необхідних для втримання тор4у на поверхні насіння Використання вермикуліту дозволяє одержати високоякісний препарат зі значно нижчими у порівнянні з найближчим аналогом енергоємністю та трудовитратами на його виробництво Спосіб здійснюють таким чином Для приготування субстрату використовується сухий вермикуліт, що має сіро-жовтий колір і слюдяний блиск Вермикуліт розмелюють до пилоподібної фракції на кулачковому лабораторному чи промисловому млину і промивають ДВІЧІ водопровідною водою Промитий вермикуліт розкладають на поліетиленовій ПЛІВЦІ і просушують до повітряно-сухого стану або сушать у сушильних шафах і печах Сухий вермикуліт зберігають у паперових мішках Далі сухий вермикуліт зволожують до 40% внесенням 400мл водопровідної води на 1кг вермикуліту Вносять 3% дефекату (30м на 1кг вермикуліту) і фасують у поліпропіленові пакети, наприклад, розміром 20х30см вагою 130г Дефекат - це ВІДХІД цукрового виробництва, основним компонентом якого є солі кальцію У дефекаті міститься невеликий запас поживних речовин вуглеводів, вітамінів, органічних солей, мікроелементів і інших мінеральних речовин, що можуть служити додатковим джерелом харчування бактерій Стерилізують вермикуліт тричі з добовим інтервалом в автоклаві в режимі 1,5 атмосфер протягом 1,5 годин Якість стерилізації перевіряють посівом на стандартне живильне середовище МП А (м'ясо-пептоновий агар) з 0,5% глюкози і сахарози (10г субстрату розмішують у ЮОмл стерильної води, 1мл суспензії висівають у чашку Петрі і заливають середовищем МПА) У кожен пакет зі стерильним вермикулітом стерильно додають за допомогою дозатора поживні речовини - 3 г меляси і 1г кукурудзяного екстракту (для соєвих ризобій необхідна добавка 1г глюкози) Готовий субстрат має колір від темносірого до бурого, вологість 40%, вагу в одному пакеті 160г Вирощування азотфіксуючих бактерій здійснюють за відомими технологіями Інокулюють вермикулітний субстрат-наповнювач через дозатор, уводячи шокуляційною голкою 40мл культури бактерій, згідно регламенту виробництва ВІДПОВІДНОГО препарату Механічно перемішують для однорідного розподілу бактеріальних клітин у препараті Зберігають препарат при температурі 8-12°С протягом 6 МІСЯЦІВ Якість препарату визначають титр бактерій методом граничних розведень з наступним висівом на відповідне потребам мікроорганізму що культивують , агаризоване середовище, чистоту - висівом на МПА з вуглеводами Титр шестимісячного збереження біопрепаратів для бульбочкових бактерій - 5,0-6,0млрд кп/г, для асоціагивних бактерій - 8,0-12,0млрд,кл/г згідно Таблиці 53187 Таблиця Під яку сільськогосподарську культуру застосовується Штам бактерій Enterobacter aerogenes ЗОф Agrobactenum radiobacter 10 Flavobactenum sp L 30 Agrobactenum radiobacter 204 Нові штами (неідентнфіковані) 8301 8306 П Bradyrhizobium japonicum 6346 Bradyrhizobium japonicum M-8 Bradyrhizobimn japonicum Д-2 Rhizobium legummosarum П-2 Титр клітин, млрд , у 1г овочеві злакові трави пшениця 6,0 3,8 20,0 16,9 пшениця пшениця пшениця соя соя соя горох 6,5 24,3 4,0 2,8 6,8 2,5 13,0 ЯЧМІНЬ При обробці насіння 200г препарату розмішують у 1л води і наносять на одну його гектарну норму Обробку проводять у день посіву або безпосередньо перед посівом Вермикулітний препа рат на основі азотфісуючих бульбочкових бактерій поліпшує мінеральне харчування сільськогосподарських культур і підвишує їх продуктивність ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24