Інсектицидний білок axmi-115 та спосіб його застосування
Номер патенту: 106968
Опубліковано: 10.11.2014
Автори: Агарвал Шруті, Дак Ніколас Б., Кемпбелл Кріс, Томсо Деніел Дж., Харгісс Трейсі, Козіел Майкл Г., Кароцці Надін, Семпсон Кімберлі С., Макналті Брайен, Хайнріш Волкер
Формула / Реферат
1. Виділена або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з:
a) нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 3 або її комплементу;
b) нуклеотидної послідовності, яка має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю SEO ID NO: 3, де вказана нуклеотидна послідовність кодує білок, що має інсектицидну активність, або її комплементу;
c) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6;
d) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичність амінокислотної послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 6, де вказана амінокислотна послідовність має інсектицидну активність; і
е) нуклеотидної послідовності, здатної до гібридизації з комплементом нуклеотидної послідовності за підпунктом b) в строгих умовах, де вказані строгі умови включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при температурі 37 °С, і промивку в 0,1Х SSC при температурі від 60 до 65 °С.
2. Виділена або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де вказана нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промотором, який здатний направляти експресію нуклеотидної послідовності в клітину рослини.
3. Виділена або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1 або п. 2, де вказана нуклеотидна послідовність є синтетичною послідовністю, яку було сконструйовано для експресії в рослині.
4. Виділена або рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, де вказана нуклеотидна послідовність вибирається з SEQ ID NO: 15 або 16.
5. Касета експресії, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1 або п. 2.
6. Касета експресії за п. 5, яка додатково містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує гетерологічний поліпептид.
7. Рослина або бактеріальна клітина-хазяїн, яка містить касету експресії за п. 5.
8. Виділений поліпептид з інсектицидною активністю, вибраний з групи, яка складається з:
a) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6;
b) поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 6, де вказана амінокислотна послідовність має інсектицидну активність;
с) поліпептиду, який кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 3;
d) поліпептиду, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка є щонайменше на 90 % ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 3, де вказаний поліпептид має інсектицидну активність; і
е) нуклеотидної послідовності, здатної до гібридизації з комплементом нуклеотидної послідовності за підпунктом b) в строгих умовах, де зазначені строгі умови включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при температурі 37 °С, і промивку в 0,1Х SSC при температурі від 60 до 65 °С.
9. Поліпептид за п. 8, який додатково містить гетерологічні амінокислотні послідовності.
10. Антитіло, яке вибірково зв'язується з поліпептидом за п. 8.
11. Композиція, яка містить поліпептид за п. 8.
12. Композиція за п. 11, де вказана композиція вибирається з групи, яка складається з порошку, пилоподібного препарату, таблеток, гранул, аерозолю, емульсії, колоїдних часток і розчину, і де необов'язково вказана композиція готується шляхом десикації, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, седиментації або концентрування культури клітин Bacillus thuringiensis.
13. Спосіб контролювання або знищення популяції лускокрилих i твердокрилих шкідників, який включає контактування вказаної популяції з інсектицидно ефективною кількістю поліпептиду за пунктом 8.
14. Спосіб одержання поліпептиду з інсектицидною активністю, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 7 в умовах, в яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.
15. Рослина, що має стабільно включену в її геном конструкцію ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок, який має інсектицидну активність, де вказана нуклеотидна послідовність вибирається з групи, що складається з:
a) нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 3 або її комплементу;
b) нуклеотидної послідовності, яка має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 3, де вказана нуклеотидна послідовність кодує білок, що має інсектицидну активність, або її комплементу;
c) нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6;
d) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO 6, де вказана амінокислотна послідовність має пестицидну активність; і
е) нуклеотидної послідовності, здатної до гібридизації з комплементом нуклеотидної послідовності за підпунктом b) в строгих умовах, де зазначені строгі умови включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при температурі 37 °С, і промивку в 0,1X SSC при температурі від 60 до 65 °С,
де вказана нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промотором, що запускає експресію кодуючої послідовності в рослинній клітині.
16. Рослина за п. 15, де вказана рослина є рослинною клітиною.
17. Трансгенне насіння рослини за п. 15, де вказане насіння містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з:
a) нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 3 або її комплементу;
b) нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 3, де вказана нуклеотидна послідовність кодує білок, що має інсектицидну активність, або її комплементу;
c) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6;
d) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 6, де вказана амінокислотна послідовність має пестицидну активність; і
е) нуклеотидної послідовності, здатної до гібридизації з комплементом нуклеотидної послідовності за підпунктом b) в строгих умовах, де зазначені строгі умови включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при температурі 37 °С, і промивку в 0,1Х SSC при температурі від 60 до 65 °С.
18. Спосіб захисту рослини від комахи-шкідника, який включає введення у вказану рослину або її клітину щонайменше одного вектора експресії, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує інсектицидний поліпептид, де вказана нуклеотидна послідовність вибирається з групи, яка складається з:
a) нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 3 або її комплементу;
b) нуклеотидної послідовності, яка має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 3, де вказана нуклеотидна послідовність кодує білок, що має інсектицидну активність, або її комплементу;
c) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6;
d) нуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 6, де вказана амінокислотна послідовність має інсектицидну активність; і
е) нуклеотидної послідовності, здатної до гібридизації з комплементом нуклеотидної послідовності за підпунктом b) в строгих умовах, де зазначені строгі умови включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при температурі 37 °С, і промивку в 0,1Х SSC при температурі від 60 до 65 °С.
Текст
Реферат: Винахід належить до композицій та способів надання інсектицидної активності клітинамхазяїнам з використанням молекул нуклеїнової кислоти дельта-ендотоксину, а також до амінокислотних послідовностей, що відповідають цим полінуклеотидам, антитіла, які специфічно зв'язуються з цими амінокислотними послідовностями. UA 106968 C2 (12) UA 106968 C2 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Даний винахід стосується галузі молекулярної біології. Пропонуються нові гени, які кодують інсектицидні білки. Ці білки і послідовності нуклеїнових кислот, що кодують їх, використовуються при розробці рецептури інсектицидних препаратів і при отриманні трансгенних рослин, резистентних до комах-шкідників. Рівень знань Bacillus thuringiensis – це грампозитивна спороутворююча ґрунтова бактерія, яка характеризується здатністю продукувати кристалічні включення, що є специфічно токсичними для певних рядів і видів комах, але нешкідливими для рослин або інших організмів, проти яких вони не націлені. Це обумовило застосування композицій, що включають штами Bacillus thuringiensis або їх інсектицидні білки, в якості прийнятних для оточуючого середовища інсектицидів для боротьби з сільськогосподарськими комахами-шкідниками або комахамипереносниками різноманітних хвороб, що вражають людину і тварин. Кристалічні (Cry) білки (дельта-ендотоксини) від Bacillus thuringiensis володіють сильною інсектицидною активністю головним чином проти личинок Lepidopteran, Dipteran і Coleopteran. Ці білки демонстрували активність проти рядів комах-шкідників Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga і Acari, а також проти інших рядів безхребетних, таких як Nemathelminthes, Platyhelminthes і Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. В книзі Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). Ці білки спочатку були класифіковані як CryI–CryV на основі головним чином їх інсектицидної активності. Головними класами були Lepidoptera-специфічні (I), Lepidoptera- і Diptera-специфічні (II), Coleoptera-специфічні (III), Diptera-специфічні (IV) і нематода-специфічні (V) і (VI). Далі їх було класифіковано на підродини; більш тісно споріднені білки в межах кожної родини отримали підрозділові літери, такі як Cry1A, Cry1B, Cry1C і т.д. Ще більш тісно споріднені білки в межах кожного підрозділу отримали такі назви, як Cry1C1, Cry1C2 і т.д. Не так давно для генів Cry була запропонована нова номенклатура, заснована швидше на гомології амінокислотних послідовностей, ніж на специфічності щодо комахи-мішені (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В цій новій класифікації кожному токсину присвоєна унікальна назва, що включає первинний ранг (арабська цифра), вторинний ранг (велика літера), третинний ранг (мала літера) і четвертинний ранг (ще одна арабська цифра). В новій класифікації римські цифри було замінено на арабські цифри в первинному рангу. Білки з менш ніж 45 % ідентичністю послідовностей мають різні первинні ранги, а критеріями для вторинного і третинного рангів є 78 % і 95 %, відповідно. Кристалічний білок не демонструє інсектицидної активності, доки він не буде всмоктаний і солюбілізований в шлунку комахи. Всмоктаний протоксин гідролізується протеазами в травному тракті комахи до активної токсичної молекули (Höfte & Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242255). Цей токсин зв'язується з апікальними рецепторами щіткової кайми в шлунку личинок і входить в апікальну мембрану, створюючи іонні канали або пори, що призводить до загибелі личинки. Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять доменів збережених послідовностей і три збережені структурні домени (дивись, наприклад, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193199). Перший збережений структурний домен складається з семи альфа спіралей і є задіяним у входженні у мембрану і утворенні пор. Домен ІІ складається з трьох бета-листків, розміщених в конфігурації грецького ключа, а домен ІІІ складається з двох антипаралельних бета-листків, які за формою нагадують рулет (de Maagd et al., 2001, supra). Домени ІІ і ІІІ є задіяними в розпізнаванні і зв'язуванні рецептору і тому вважаються детермінантами специфічності токсину. Крім дельта-ендотоксинів, існують кілька інших відомих класів пестицидних білкових токсинів. Токсини VIP1/VIP2 (дивись, наприклад, патент США № 5,770,696) є бінарними пестицидними токсинами, які демонструють сильну активність щодо комах, механізм якої, як вважається, включає опосередкований рецептором ендоцитоз з наступною клітинною токсифікацією, подібно до способу дії інших бінарних ("А/В") токсинів. А/В токсини, такі як VIP, C2, CDT, CST або токсин водянки і летальний токсин B. Anthracis, спочатку взаємодіють з клітинами-мішенями через специфічне, опосередковане рецептором зв'язування компонентів "В" як мономерів. Ці мономери потім утворюють гомогептамери. Після цього комплекс "В" гептаметр-рецептор діє як платформа причалювання, яка згодом зв'язує і дозволяє транслокацію ферментативного компоненту (компонентів) А в цитозолі через опосередкований рецептором ендоцитоз. Опинившись всередині цитозолю клітини, компоненти "А" пригнічують нормальну функцію клітини шляхом, наприклад, АДФ-рибозилювання G-актину або підвищення рівнів циклічного АМФ (цАМФ). Дивись Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402. 1 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інтенсивне використання інсектицидів на основі B. thuringiensis вже призвело до підвищення резистентності в польових популяціях попільниці Plutella xylostella (Ferré & Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Найпоширенішим механізмом резистентності є зменшення зв'язування цього токсину зі специфічним до нього рецептором (рецепторами) шлунку. Це може викликати також перехресну резистентність до інших токсинів, які поділяють той самий рецептор (Ferré & Van Rie (2002)). Сутність винаходу Пропонуються композиції і способи для надання стійкості до комах-шкідників бактеріям, рослинам, клітинам, тканинам і насінню рослин. Композиції включають молекули нуклеїнової кислоти, що кодують послідовності для поліпептидів дельта-ендотоксинів, вектори, що містять ці молекули нуклеїнової кислоти, і клітини-хазяї, що містять ці вектори. Композиції включають також поліпептидні послідовності ендотоксину і антитіла до цих поліпептидів. Такі нуклеотидні послідовності можуть використовуватись в конструкціях ДНК або касетах експресії для трансформації і експресії в організмах, включаючи мікроорганізми і рослини. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, які були створені для експресії в організмі, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроорганізм або рослину. Композиції включають також трансформовані бактерії, рослини, клітини, тканини і насіння рослин. Зокрема, пропонуються виділені молекули нуклеїнової кислоти, що відповідають послідовностям нуклеїнових кислот дельта-ендотоксинів. Додатково, охоплюються амінокислотні послідовності, які відповідають цим полінуклеотидам. Зокрема, даний винахід пропонує виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу амінокислотну послідовність, показану в будь-якій послідовності з SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14, або нуклеотидну послідовність, наведену в будь-якій послідовності з SEQ ID №№: 1, 2, 3, 11 або 12, а також їх варіанти і фрагменти. Охоплюються також нуклеотидні послідовності, що є комплементарними до нуклеотидної послідовності за цим винаходом або гібридизуються до нуклеотидної послідовності за цим винаходом. Композиції і способи за цим винаходом є призначеними для отримання організмів з інсектицидною резистентністю, конкретно бактерій і рослин. Ці організми і композиції, що походять від них, є бажаними для застосування у сільському господарстві. Композиції за цим винаходом можуть також бути використаними для створення змінених або поліпшених білків дельта-ендотоксинів, що мають інсектицидну активність, або для виявлення присутності білків або нуклеїнових кислот дельта-ендотоксинів в продуктах або організмах. Короткий опис малюнків Фіг. 1А і 1В показують зіставлення послідовностей AXMI-113 (SEQ ID №: 5), AXMI-005 (SEQ ID №: 4) і AXMI-115 (SEQ ID №: 6). Лівими і правими стрілками відмічені межі С-термінальної 1/3 ділянки цих білків. Фіг.2 зображає домени всередині AXMI-005 і AXMI-115, які переставляються з утворенням нових токсинів. Докладний опис винаходу Даний винахід стосується композицій і способів для регуляції стійкості до комах-шкідників в організмах, зокрема в рослинах або в клітинах рослин. Ці способи передбачають трансформування організмів нуклеотидною послідовністю, кодуючою білок дельта-ендотоксину за цим винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності за цим винаходом призначені для отримання рослин і мікроорганізмів, які володіють інсектицидною активністю. Отже, пропонуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, рослинні тканини і насіння. Композиції є нуклеїновими кислотами і білками дельта-ендотоксинів Bacillus thuringiensis. Такі послідовності знаходять застосування в конструюванні векторів експресії для наступної трансформації в організми, що становлять інтерес, як зонди для виділення інших генів дельтаендотоксинів, а також для створення змінених інсектицидних білків методами, відомими в цій галузі, такими як обмін доменами або перестановка в ДНК (перестановка послідовностей всередині гену з наступноюрекомбінацією цього сегменту в інтактну ДНК). Дивись, наприклад, Таблицю 2 і Фіг. 2. Такі білки знаходять застосування в контролюванні або знищенні популяцій лускокрилих, твердокрилих і інших комах-шкідників, а також для отримання композицій з інсектицидною активністю. "Дельта-ендотоксин" означає токсин від Bacillus thuringiensis, який має токсичну активність проти одного або більше шкідників, включаючи, але не обмежуючись ними, представників рядів Lepidoptera, Diptera і Coleoptera, або білок, який має гомологію з таким токсином. В певних випадках білки дельта-ендотоксинів виділялись з інших організмів, включаючи Clostridium bifermentans і Paenibacillus popilliae. Білки дельта-ендотоксинів включають амінокислотні 2 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, виведені від описаних тут нуклеотидних послідовностей повної довжини, і амінокислотні послідовності, що є коротшими, ніж послідовності повної довжини, через застосування іншого, розміщеного далі сайту ініціації транскрипції або через обробку, яка дає коротший білок, що має пестицидну активність. Обробка може здійснюватись в організмі, де цей білок експресується, або в шкідникові після поїдання ним цього білку. Дельта-ендотоксини включають білки, ідентифіковані як cry1–cry43, cyt1 і cyt2, а також Cytподібний токсин. Наразі відомо понад 250 видів дельта-ендотоксинів з широким спектром специфічності і токсичності. Для широкого переліку дивись Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, а для регулярних поновлень дивись Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature, ” на сайті www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index. Тут пропонуються нові виділені нуклеотидні послідовності, які забезпечують інсектицидну активність. Також пропонуються амінокислотні послідовності білків дельта-ендотоксинів. Білок, отриманий в результаті трансляції цього гену, дозволяє клітинам контролювати або вбивати шкідників, які поїдають його. Виділені молекули нуклеїнової кислоти та їх варіанти і фрагменти Один аспект даного винаходу стосується виділених або рекомбінантних молекул нуклеїнової кислоти, які містять нуклеотидні послідовності, кодуючі білки дельта-ендотоксинів, і поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекули нуклеїнової кислоти, що є достатніми в якості гібридизаційних зондів для ідентифікації кодуючих дельта-ендотоксини нуклеїнових кислот. Як він тут використовується, термін "молекула нуклеїнової кислоти" включає молекули ДНК (наприклад, рекомбінантної ДНК, кДНК або геномної ДНК) і молекули РНК (наприклад, мРНК), а також аналоги ДНК і РНК, генеровані з використанням нуклеотидних аналогів. Така молекула нуклеїнової кислоти може бути однонитчастою або двонитчастою, але переважно двонитчастою ДНК. "Виділена" або "очищена" молекула нуклеїнової кислоти або білку, або її біологічно активна частина є суттєво вільними від іншого клітинного матеріалу або культурального середовища, коли отримуються рекомбінантними методами, або суттєво вільними від хімічних попередників або інших хімічних сполук, коли синтезуються хімічним шляхом. Переважно, "виділена" нуклеїнова кислота є вільною від послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які природно фланкують цю нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розміщених на кінцях 5′ і 3′ нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, від якого походить ця нуклеїнова кислота. Для цілей даного винаходу термін "виділені", коли він відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, виключає виділені хромосоми. Наприклад, в різних варіантах здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча дельта-ендотоксин, може містити менше ніж приблизно 5 кб, 4 кб, 3 кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб або 0,1 кб нуклеотидних послідовностей, які природно фланкують цю нуклеїнову кислоту в геномній ДНК клітини, з якої походить ця нуклеїнова кислота. Білок дельта-ендотоксину, який є суттєво вільним від клітинного матеріалу, включає препарати білку, які мають менше ніж приблизно 30 %, 20 %, 10 % або 5 % (від сухої ваги) не дельта-ендотоксинового білку (який тут називають також "контамінуючим білком"). Нуклеотидні послідовності, кодуючі білки за цим винаходом, включають послідовності, наведені в послідовностях SEQ ID №№: 1, 2, 3, 11 або 12, а також їх варіанти, фрагменти і комплементи. Під "комплементом" розуміється нуклеотидна послідовність, що є достатньо комплементарною для даної нуклеотидної послідовності, так що вона може гібридизуватись до даної нуклеотидної послідовності, тим самим утворюючи стабільний дуплекс. Відповідні амінокислотні послідовності для білку дельта-ендотоксину, кодованого цією нуклеотидною послідовністю, наведені в послідовностях SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14. Молекули нуклеїнової кислоти, що є фрагментами тих нуклеотидних послідовностей, які кодують дельта-ендотоксин, також охоплюються даним винаходом. Під "фрагментом" розуміється частина нуклеотидної послідовності, кодуючої білок дельта-ендотоксину. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину білку дельта-ендотоксину або він може бути фрагментом, який може бути використаний як гібридизаційний зонд або праймер ПЛР при застосуванні методів, які будуть описані далі. Молекули нуклеїнової кислоти, що є фрагментами нуклеотидної послідовності дельта-ендотоксину, включають щонайменше приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350 стичних нуклеотидів або до тієї кількості нуклеотидів, яка присутня в описаній тут нуклеотидній послідовності повної довжини, кодуючій дельта-ендотоксин, залежно від задуманого застосування. Під "стичними" нуклеотидами розуміються нуклеотидні залишки, що є безпосередньо суміжними один до 3 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одного. Фрагменти нуклеотидних послідовностей за цим винаходом будуть кодувати білкові фрагменти, які зберігають біологічну активність білку дельта-ендотоксину і, відповідно, зберігають пестицидну активність. Під "зберігає активність" розуміється, що фрагмент буде мати щонайменше приблизно 30 %, щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більше пестицидної активності білку дельта-ендотоксину. Методи для визначення пестицидної активності є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Czapla & Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5,743,477, які всі включено в цей опис за посиланням у всій їх повноті. Фрагмент нуклеотидної послідовності, кодуючої дельта-ендотоксин, який кодує біологічно активну частину білку за цим винаходом, буде кодувати щонайменше приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100 стичних амінокислот або до загальної кількості амінокислот, присутньої в білку дельта-ендотоксину повної довжини за цим винаходом. Кращі білки дельта-ендотоксинів за цим винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, достатньо ідентичною нуклеотидній послідовності SEQ ID №№: 1, 2, 3, 11 або 12. Під "достатньо ідентичною" розуміється амінокислотна або нуклеотидна послідовність, яка має щонайменше приблизно 60 % або 65 % ідентичності послідовності, приблизно 70 % або 75 % ідентичності послідовності, приблизно 80 % або 85 % ідентичності послідовності, приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичності послідовності, порівняно з еталонною послідовністю, що визначається за допомогою однієї з програм зіставлення, описаних тут, з використанням стандартних параметрів. Спеціалісту в цій галузі має бути зрозумілим, що ці цифри можуть бути відповідно відрегульовані, щоб визначити відповідну ідентичність білків, кодованих двома нуклеотидними послідовностями, з урахуванням дегенерації кодонів, подібності амінокислот, положення рамки зчитування і т.п. Щоб визначити відсоток ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, ці послідовності зіставляються для цілей оптимального порівняння. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій, які поділяються цими послідовностями (тобто, ідентичність послідовності = кількість ідентичних позицій/загальна кількість позицій (наприклад, позицій, що накладаються) х 100). В одному варіанті здійснення ці дві послідовності мають однакову довжину. В іншому варіанті здійснення порівняння здійснюється по всій еталонній послідовності (наприклад, повністю по одній з послідовностей SEQ ID №№: 1, 2, 3, 11 або 12 або повністю по одній з послідовностей SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14). Відсоток ідентичності між двома послідовностями може бути визначений з використанням методик, подібних до тих, що будуть описані далі, з допущенням пропусків або без них. При обчисленні відсотку ідентичності типово підраховуються точні збіги. Визначення відсотку ідентичності між двома послідовностями може здійснюватись з використанням математичного алгоритму. Не обмежуючим прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння двох послідовностей, є алгоритм Karlin & Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифікований як в Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Цей алгоритм є включеним в програми BLASTN і BLASTX Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Пошуки нуклеотидів BLAST (основний інструмент пошуку локального зіставлення) можуть здійснюватись за допомогою програми BLASTN, бал = 100, довжина слова = 12, щоб отримати нуклеотидні послідовності, гомологічні подібним до дельтаендотоксину молекулам нуклеїнової кислоти за цим винаходом. Пошуки білків BLAST можуть здійснюватись за допомогою програми BLASTX, бал = 50, довжина слова = 3, щоб отримати амінокислотні послідовності, гомологічні молекулам білку дельта-ендотоксину за цим винаходом. Щоб отримати зіставлення з пропусками для цілей порівняння, може бути використаний інструмент BLAST з пропусками – Gapped BLAST (в BLAST 2.0), як описано у Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Як варіант, може бути використаний інструмент PSI-Blast для здійснення ітеративного пошуку, який виявляє віддалені спорідненості між молекулами. Дивись Altschul et al. (1997) supra. В разі застосування програм BLAST, Gapped BLAST і PSI-Blast можуть використовуватись параметри за умовчанням відповідних програм (наприклад, BLASTX і BLASTN). Зіставлення може здійснюватись також вручну методом підбору. Іншим не обмежуючим прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:46734680). ClustalW порівнює послідовності і зіставляє повністю амінокислотну або ДНК послідовність, а отже може забезпечити дані щодо збереження послідовності всієї амінокислотної послідовності. Алгоритм ClustalW використовується в кількох пакетах 4 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 програмного забезпечення для аналізу ДНК / амінокислот, що є у продажу, таких як модуль ALIGNX пакету програм Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Після зіставлення амінокислотних послідовностей за допомогою алгоритму ClustalW можна оцінити відсоток ідентичності амінокислот. Не обмежуючим прикладом програмного забезпечення, використовуваного для аналізу зіставлень ClustalW, є GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) дозволяє оцінювати подібність амінокислот (чи ДНК) і ідентичність між певною кількістю білків. Ще одним не обмежуючим прикладом математичного алгоритму, використовуваного для порівняння послідовностей, є алгоритм Myers & Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Цей алгоритм включено до програми ALIGN (версія 2.0), яка є частиною пакету програмного забезпечення GCG Wisconsin Genetics Software Package, Версія 10 (яку можна придбати у Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, США). В разі застосування програми ALIGN для порівняння амінокислотних послідовностей можна скористатись таблицею ваги залишків РАМ120, штрафом за довжину пропуску 12 і штрафом за пропуск 4. Коли інше не зазначається, програма GAP Версія 10, яка використовує алгоритм Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, буде застосовуватись для визначення ідентичності або подібності послідовностей з використанням наступних параметрів: % ідентичності і % подібності для нуклеотидної послідовності з вагою пропуску в послідовності 50, вагою довжини 3 і матрицею замін (при вирівнюванні біологічних послідовностей) nwsgapdna.cmp; % ідентичності або % подібності для амінокислотної послідовності з вагою пропуску в послідовності 8, вагою довжини 2 і програмою замін амінокислот BLOSUM62. Можуть використовуватись також еквівалентні програми. Під "еквівалентною програмою" розуміється будь-яка програма порівняння послідовностей, яка, для будь-яких двох даних послідовностей, генерує зіставлення, яке має ідентичні збіги нуклеотидних залишків і ідентичний відсоток тотожності послідовностей у порівнянні з відповідним зіставленням, генерованим програмою GAP Версія 10. Даний винахід охоплює також варіантні молекули нуклеїнової кислоти. "Варіанти" нуклеотидних послідовностей, кодуючих дельта-ендотоксин, включають ті послідовності, які кодують описані тут білки дельта-ендотоксину, але які відрізняються консервативно внаслідок дегенерації генетичного коду, а також ті, що є суттєво ідентичними, як зазначалось раніше. Алельні варіанти природного походження можна ідентифікувати за допомогою добре відомих методів молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і методи гібридизації, про які йтиметься далі. Варіантні нуклеотидні послідовності включають також нуклеотидні послідовності, отримані синтетичним шляхом, які були генеровані, наприклад, з використанням спрямованого на сайт мутагенезу, але які все ще кодують білки дельта-ендотоксинів, описані в даному винаході, про які йтиметься далі. Охоплювані даним винаходом варіантні білки є біологічно активними, тобто вони продовжують володіти бажаною біологічною активністю нативногобілку – зберігають пестицидну активність. Під "зберігають активність" розуміється, що такий варіант буде мати щонайменше приблизно 30 %, щонайменше приблизно 50 %, щонайменше приблизно 70 % або щонайменше приблизно 80 % пестицидної активності нативного білку. Методи визначення пестицидної активності є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Czapla & Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5,743,477, які всі включено в цей опис за посиланням у всій їх повноті. Спеціалісту в цій галузі має бути зрозумілим також, що зміни можуть вноситись мутаціями нуклеотидних послідовностей за цим винаходом, які приводять до змін в амінокислотній послідовності кодованих білків дельта-ендотоксинів без зміни біологічної активності цих білків. Відповідно, варіантні виділені молекули нуклеїнової кислоти можуть бути створені шляхом введення одного або більше нуклеотидних заміщень, добавок або делецій у відповідну нуклеотидну послідовність, описану тут, так що одне або більше амінокислотних заміщень, добавок або делецій вводяться в даний кодований білок. Мутації можуть вводитись стандартними методами, такими як спрямований на сайт мутагенез і мутагенез, опосередкований ПЛР. Такі варіантні нуклеотидні послідовності також охоплюються даним винаходом. Наприклад, консервативні амінокислотні заміщення можуть бути здійснені в одному або більше, наперед визначених, замінних амінокислотних залишків. "Замінний" амінокислотний залишок є залишком, який може бути змінений від послідовності дикого типу білку дельтаендотоксину без зміни біологічної активності, тоді як "незамінний" амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. "Консервативне амінокислотне заміщення" є таким, коли амінокислотний залишок заміщується амінокислотним залишком, який має подібний боковий ланцюг. Родини амінокислотних залишків, які мають подібні бокові ланцюги, були визначені в 5 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цій галузі. Ці родини включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глютамінова кислота), незміненими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глютамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бетарозгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Дельта-ендотоксини загалом мають п'ять доменів збережених послідовностей і три збережені структурні домени (дивись, наприклад, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193199). Перший збережений структурний домен складається з семи альфа спіралей і є задіяним в інсерції мембрани і утворенні пор. Домен ІІ складається з трьох бета-листків, розміщених в конфігурації грецького ключа, а домен ІІІ складається з двох антипаралельних бета-листків у вигляді рулету (de Maagd et al., 2001, supra). Домени ІІ і ІІІ є задіяними в розпізнаванні і зв'язуванні рецептору і тому вважаються детермінантами специфічності до токсину. Амінокислотні заміщення можуть здійснюватись на не збережених ділянках, які зберігають функцію. Загалом, такі заміщення не робились би ради збережених амінокислотних залишків або ради амінокислотних залишків, що знаходяться в межах збереженого мотиву, де такі залишки є суттєвими для активності білку. Приклади залишків, які є збереженими і які можуть бути суттєвими для активності білку, включають, наприклад, залишки, що є ідентичними для всіх білків, які містяться в зіставленні амінокислотних послідовностей за даним винаходом і відомих послідовностей дельта-ендотоксинів. Приклади залишків, які є збереженими, але можуть дозволяти консервативні амінокислотні заміщення і все ще зберігати активність, включають, наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміщення між всіма білками, які містяться в зіставленні амінокислотних послідовностей за даним винаходом і відомих послідовностей дельта-ендотоксинів. Однак спеціалісту в цій галузі має бути зрозумілим, що функціональні варіанти можуть мати незначні збережені або не збережені зміни в збережених залишках. Альтернативно, варіантні нуклеотидні послідовності можуть бути отримані шляхом введення мутацій випадково по всій кодуючій послідовності або по її частині, наприклад шляхом насичуючого мутагенезу, а отримані мутанти можуть бути піддані скринінгу на здатність забезпечувати активність дельта-ендотоксину, щоб ідентифікувати мутантів, які зберігають активність. Після мутагенезу такий кодований білок може бути експресованим рекомбінантно, а активність цього білка може визначатись за допомогою стандартних методик аналізу. За допомогою таких методів, як ПЛР, гібридизація і т.п., можна ідентифікувати послідовності відповідних дельта-ендотоксинів – такі послідовності мають суттєву ідентичність з послідовностями за цим винаходом. Дивись, наприклад, Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) та Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). При застосуванні методу гібридизації всі частини нуклеотидної послідовності дельтаендотоксину можуть бути використані для скринінгу кДНК або геномних бібліотек. Методи для конструювання таких кДНК і геномних бібліотек є загальновідомими в цій галузі і розглядаються в книзі Sambrook & Russell, 2001, supra. Так звані гібридизаційні зонди можуть бути фрагментами геномної ДНК, фрагментами кДНК, фрагментами РНК або іншими 32 олігонуклеотидами і можуть мітитись групою, що легко виявляється, такою як P, або будь-яким іншим маркером, таким як радіоізотопи, флуоресцентна сполука, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можна отримати шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів на основі відомої, кодуючої дельта-ендотоксин нуклеотидної послідовності, описаної тут. Додатково можуть бути використані вироджені праймери, розроблені на основі збережених нуклеотидів або амінокислотних залишків в цій нуклеотидній послідовності або кодованої амінокислотної послідовності. Зонд типово містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується у строгих умовах до щонайменше приблизно 12, щонайменше приблизно 25, щонайменше приблизно 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 послідовних нуклеотидів кодуючої дельта-ендотоксин нуклеотидної послідовності за цим винаходом або її фрагменту або варіанту. Методи для приготування зондів для гібридизації є загальновідомими в цій галузі і описуються в книзі Sambrook & Russell, 2001, supra, включеної в даний опис за посиланням. Наприклад, вся послідовність дельта-ендотоксину, описана тут, або одна або більше її частин можуть бути використані в якості зонду, здатного специфічно гібридизуватись до відповідних послідовностей, подібних до послідовності дельта-ендотоксину, та інформаційних РНК. Для забезпечення специфічної гібридизації в різноманітних умовах такі зонди включають 6 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, що є унікальними і переважно мають щонайменше приблизно 10 нуклеотидів у довжину або щонайменше приблизно 20 нуклеотидів у довжину. Такі зонди можуть використовуватись для ампліфікації відповідних послідовностей дельта-ендотоксину від обраного організму за допомогою ПЛР. Ця методика може використовуватись для виділення додаткових кодуючих послідовностей від бажаного організму або в якості діагностичного аналізу для визначення присутності кодуючих послідовностей в організмі. Методи гібридизації включають гібридизаційний скринінг висіяних ДНК бібліотек (бляшок або колоній; дивись, наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). Гібридизація таких послідовностей може здійснюватись в строгих умовах. Під "строгими умовами" або "строгими умовами гібридизації" розуміються такі умови, в яких зонд буде гібридизуватись до своєї мішені-послідовності помітно більшою мірою, ніж до інших послідовностей (наприклад, щонайменше 2-кратно порівняно з фоновим рівнем). Строгі умови залежать від послідовності і будуть різними за різних обставин. Шляхом контролювання строгості умов гібридизації та/або промивки можна ідентифікувати цільові послідовності, що є на 100 % комплементарними до даного зонду (гомологічне зондування). Як варіант, умови строгості можуть регулюватись так, щоб дозволити певну невідповідність в послідовностях, так що буде виявлятись нижча ступінь подібності (гетерологічне зондування). Загалом, зонд має менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів у довжину, переважно менше ніж 500 нуклеотидів у довжину. Типово, строгі умови будуть такими, за яких концентрація солі становить менше ніж приблизно 1,5 М іону Na, типово від приблизно 0,01 до 1,0 М іону Na (чи іншої солі) при рН від 0 7,0 до 8,3 і температурі щонайменше близько 30 С для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 0 нуклеотидів) і щонайменше близько 60 С для довгих зондів (наприклад, більше 50 нуклеотидів). Строгі умови можна забезпечити також шляхом додавання дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Показові умови низької строгості включають гібридизацію з використанням буферного розчину 30-35 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % SDS (натрію додецилсульфат) при 37 °C і промивки в 1X–2X SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрію цитрат) при температурі від 50 до 55 °C. Показові умови помірної строгості включають гібридизацію в 40–45 % формаміду, 1,0 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C і промивку в 0,5X–1X SSC при температурі від 55 до 60 °C. Показові умови високої строгості включають гібридизацію в 50 % формаміду, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37 °C, і промивку в 0,1X SSC при температурі від 60 до 65 °C. Факультативно, буфери для промивки можуть містити від приблизно 0,1 % до приблизно 1 % SDS. Тривалість гібридизації загалом становить менше ніж приблизно 24 години, звичайно від приблизно 4 до приблизно 12 годин. Специфічність типово є функцією промивок після гібридизації, при цьому критичними факторами є іонна сила і температура кінцевого промивного розчину. Для гібридів ДНК-ДНК Tm можна приблизно визначити з рівняння Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5 °C+16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% форм) - 500/L; де M є молярність одновалентних катіонів, %GC – це відсоток нуклеотидів гуанозину і цитокіну в ДНК, % форм – це відсоток формаміду в гібридизаційному розчині, а L – це довжина гібриду в парах основ. Tm є температурою (при визначених іонній силі і рН), при якій 50 % комплементарної цільової 0 послідовності гібридизуються з бездоганно підібраним зондом. Tm знижується приблизно на 1 С на кожний 1 % розходження; отже, Tm, умови гібридизації та/або промивки можна регулювати так, щоб гібридизувати послідовності бажаної ідентичності. Наприклад, коли потрібні 0 послідовності з ідентичністю 90 % і більше, Tm можна знизити на 10 С. Загалом, строгі умови 0 вибираються так, щоб температура була на 5 С нижча, ніж температура плавлення (Tm) для конкретної послідовності і її комплементу при даних іонній силі і рН. Однак дуже строгі умови можуть використовувати гібридизацію та/або промивку при температурі, на 1, 2, 3 або 4 °C нижчій, ніж термальна точка плавлення (Tm); помірно строгі умови можуть використовувати гібридизацію та/або промивку при температурі, на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижчій, ніж термальна точка плавлення (Tm); умови низької строгості можуть використовувати гібридизацію та/або промивку при температурі, на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижчій, ніж термальна точка плавлення (Tm). Маючи це рівняння, композиції для гібридизації та/або промивки і бажану Tm, як буде зрозумілим спеціалістам в цій галузі, можна вважати, що варіації в строгості розчинів для гібридизації та/або промивки є описаними в своїй суті. Коли бажаний ступінь розходження 0 0 приводить до Tm, нижчої ніж 45 С (водний розчин) або 32 С (розчин формаміду), краще підвищити концентрацію SSC так, щоб можна було використати більш високу температуру. Докладні рекомендації щодо гібридизації нуклеїнових кислот містяться в наступних джерелах: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with 7 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Дивись Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). Виділені білки та їх варіанти і фрагменти Білки дельта-ендотоксинів також охоплюються даним винаходом. Під "білком дельтаендотоксину" розуміється білок, який має амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14. Пропонуються також їх фрагменти, біологічно активні частини і варіанти, які можуть бути використані для здійснення способів за цим винаходом. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" включають поліпептидні фрагменти, що містять амінокислотні послідовності, достатньо ідентичні амінокислотній послідовності, наведеній в будь-якій з послідовностей SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14, і демонструють інсектицидну активність. Біологічно активною частиною білку дельта-ендотоксину може бути поліпептид, що має, наприклад, 10, 25, 50, 100 або більше амінокислот в довжину. Такі біологічно активні частини можуть бути отримані рекомбінантними методами і піддані тестуванню щодо інсектицидної активності. Методи визначення інсектицидної активності є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Czapla & Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5,743,477, які всі включені в цей опис за посиланням у всій їх повноті. Як він тут використовується, фрагмент містить щонайменше 8 стичних амінокислот послідовності SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14. Однак даний винахід охоплює і інші фрагменти, такі як будь-який фрагмент білку, більший ніж приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250 або 1300 амінокислот. Під "варіантами" розуміються білки або поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 60 %, 65 %, приблизно на 70 %, 75 %, приблизно на 80 %, 85 %, приблизно на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % є ідентичною амінокислотній послідовності, наведеній в будь-якій з послідовностей SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14. Варіанти включають також поліпептиди, кодовані молекулою нуклеїнової кислоти, яка гібридизується до молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю SEQ ID №№: 1, 2, 3, 11 або 12 або до її комплементу в строгих умовах. Варіанти включають поліпептиди, які відрізняються амінокислотною послідовністю внаслідок мутагенезу. Варіантні білки, охоплювані даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують володіти бажаною біологічною активністю нативного білку – зберігають інсектицидну активність. Методи визначення інсектицидної активності є добре відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Czapla & Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; і патент США № 5,743,477, які всі включені в цей опис за посиланням у всій їх повноті. Бактеріальні гени, такі як гени axmi за цим винаходом, доволі часто володіють певною кількістю кодонів ініціації метіоніну поблизу до початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції на одному або більше з цих стартових кодонів буде приводити до створення функціонального білку. Ці стартові кодони можуть включати кодони ATG. Однак такі бактерії, як Bacillus sp., розпізнають також кодон GTG як стартовий кодон, і білки, які ініціюють трансляцію в кодонах GTG, містять метіонін на місці першої амінокислоти. Більш того, не часто вдається визначити a priori, які з цих кодонів природно використовуються в цій бактерії. Отже, має бути зрозумілим, що використання одного з альтернативних метіонінових кодонів також може привести до генерації білків дельта-ендотоксинів, які кодують пестицидну активність. Ці білки дельта-ендотоксинів охоплюються даним винаходом і можуть бути використані в способах за цим винаходом. Антитіла до поліпептидів за цим винаходом або до їх варіантів або фрагментів також охоплюються даним винаходом. Методи отримання антитіл є добре відомими в цій галузі (дивись, наприклад, Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; патент США № 4,196,265). Змінені або поліпшені варіанти Відомо, що послідовності ДНК дельта-ендотоксину можуть бути зміненими різними методами і що ці зміни можуть дати послідовності ДНК, кодуючі білки з амінокислотними послідовностями, відмінними від тих, що кодовані дельта-ендотоксином за цим винаходом. Цей білок може бути змінений різними способами, включаючи амінокислотні заміщення, делеції, усічення і вставки однієї або більше амінокислот з послідовностями SEQ ID №№: 4, 5, 6, 13 або 14, включаючи приблизно до 2, приблизно до 3, приблизно до 4, приблизно до 5, приблизно до 8 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6, приблизно до 7,приблизно до 8, приблизно до 9, приблизно до 10, приблизно до 15, приблизно до 20, приблизно до 25, приблизно до 30, приблизно до 35, приблизно до 40, приблизно до 45, приблизно до 50, приблизно до 55, приблизно до 60, приблизно до 65, приблизно до 70, приблизно до 75, приблизно до 80, приблизно до 85, приблизно до 90, приблизно до 100, приблизно до 105, приблизно до 110, приблизно до 115, приблизно до 120, приблизно до 125, приблизно до 130 або більше амінокислотних заміщень, делецій або вставок. Методи для здійснення таких маніпуляцій є загальновідомими в цій галузі. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності білку дельта-ендотоксину можна отримати за допомогою мутацій в ДНК. Це можна здійснити також однією з кількох форм мутагенезу та/або спрямованого розвитку. В певних аспектах ці зміни, закодовані в амінокислотній послідовності, не будуть суттєво впливати на функцію білку. Такі варіанти будуть володіти бажаною пестицидною активністю. Однак має бути зрозумілим, що здатність дельта-ендотоксину забезпечувати пестицидну активність можна поліпшити шляхом застосування таких методик на композиціях за цим винаходом. Наприклад, можна скористатись експресією дельта-ендотоксину в клітинах-хазяях, які демонструють високу частоту помилкового включення основи під час реплікації ДНК, такої як XL-1 Red (Stratagene). Після розмноження в таких штамах можна виділити ДНК дельта-ендотоксину (наприклад, шляхом отримання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікації за допомогою ПЛР і клонування результуючого ПЛР фрагменту у вектор), культивувати мутації дельта-ендотоксину в немутагенному штамі та ідентифікувати мутовані гени дельта-ендотоксину з пестицидною активністю, наприклад за допомогою тестування на пестицидну активність. Загалом, такий білок змішується і використовується в фідинг-аналізах. Дивись, наприклад, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такі аналізи можуть передбачати контактування рослин з одним або більше шкідників і визначення здатності цієї рослини виживати та/або викликати загибель цих шкідників. Приклади мутацій, які мають своїм результатом посилену токсичність, можна знайти у Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806. Як варіант, зміни можуть вноситись в білкову послідовність багатьох білків на N-кінці або Скінці ланцюга без суттєвого впливу на активність. Це може включати вставки, делеції або зміни, які вносяться сучасними молекулярними методами, такими як ПЛР, включаючи ПЛР ампліфікації, які змінюють або подовжують кодуючу білок послідовність шляхом включення амінокислотних кодуючих послідовностей в олігонуклеотиди, використовувані в ПЛР ампліфікації. Альтернативно, такі додані білкові послідовності можуть включати повні послідовності, кодуючі білок, такі як широко використовувані в цій галузі для здійснення злиття білків. Такі злиті білки часто використовуються для того, щоб (1) збільшити експресію білку, що становить інтерес; (2) ввести домен зв'язування, ферментативну активність або епітоп для забезпечення очистки білку, виявлення білку або інших експериментальних застосувань, відомих в цій галузі; (3) реалізувати цільову секрецію або трансляцію білку в субклітинну органелу, таку як периплазматичний простір грамнегативних бактерій, або ендоплазматичний ретикулум евкаріотичних клітин, причому останнє часто приводить до глікозилювання білку. Варіантні нуклеотидні і амінокислотні послідовності за цим винаходом охоплюють також послідовності, отримані з використанням мутагенних і рекомбіногенних методик, таких як перестановка в ДНК (перестановка послідовностей в межах гену з наступною рекомбінацією цього сегменту в інтактну ДНК). Така методика дозволяє використовувати одну або більше різних кодуючих ділянок білку дельта-ендотоксину для створення нового білку дельтаендотоксину, що володіє бажаними властивостями. У такий спосіб генеруються бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів з популяції полінуклеотидів зі спорідненими послідовностями, які містять ділянки, що мають суттєву ідентичність послідовностей і можуть бути гомологічно рекомбінованими in vitro або in vivo. Наприклад, за допомогою такого підходу мотиви послідовностей, кодуючих домен, що становить інтерес, можуть бути переставлені між геном дельта-ендотоксину за цим винаходом і іншими відомими генами дельта-ендотоксину, щоб отримати новий ген, кодуючий білок з поліпшеною бажаною властивістю, такою як посилена інсектицидна активність. Стратегії щодо таких перестановок в ДНК є відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; і патенти США №№ 5,605,793 і 5,837,458. Обмін або перестановка доменів є іншим механізмом для створення змінених білків дельтаендотоксину. Домени ІІ і ІІІ можуть обмінюватись між білками дельта-ендотоксинів, приводячи до утворення гібридних або химерних токсинів з поліпшеною пестицидною активністю або розширеним спектром мішеней. Методи для створення рекомбінантних білків і їх тестування на 9 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пестицидну активність є добре відомими в цій галузі (дивись, наприклад, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:15371543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925). Вектори Послідовність дельта-ендотоксину за цим винаходом може пропонуватись у формі касети експресії для експресії в рослині, що становить інтерес. Під "рослинною касетою експресії" розуміється конструкція ДНК, яка здатна забезпечити експресію білку з відкритої рамки зчитування в рослинній клітині. Типово, він містить промотор і кодуючу послідовність. Часто такі конструкції будуть містити також не трансльовану ділянку 3′. Такі конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність", щоб забезпечити ко-трансляційний або пост-трансляційний транспорт потрібного пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласт (чи інша пластида), ендоплазматична сітка або апарат Гольджі. Під "сигнальною послідовністю" розуміється послідовність, щодо якої відомо або яка підозрюється в тому, що вона забезпечує ко-трансляційний або пост-трансляційний транспорт пептиду через клітинну мембрану. В евкаріотах це типово передбачає секрецію в апарат Гольджі, з певним результуючим глікозилюванням. Під "лідерною послідовністю" розуміється будь-яка послідовність, яка після трансляції дає амінокислотну послідовність, достатню для запуску ко-трансляційного транспорту пептидного ланцюга в субклітинну органелу. Отже, це передбачає націленість лідерних послідовностей на транспорт та/або глікозилювання шляхом проходження в ендоплазматичний ретикулум, проходження у вакуолі, пластиди, включаючи хлоропласти, мітохондрії і т.п. Під "вектором трансформації рослини" розуміється молекула ДНК, яка є необхідною для ефективної трансформації рослинної клітини. Така молекула може складатись з однієї або більше рослинних касет експресії і може бути організованою в більше ніж одну "векторну" молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори є векторами трансформації рослини, які використовують два нестичні вектори ДНК для кодування всіх необхідних діючих в cis- і transположеннях функцій для трансформації рослинних клітин (Hellens & Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Вектор" стосується конструкції нуклеїнової кислоти, призначеної для перенесення між різними клітинами-хазяями. "Вектор експресії" стосується вектору, який має здатність включати, інтегрувати і експресувати гетерологічні послідовності або фрагменти ДНК в чужорідну клітину. Така касета буде включати регуляторні послідовності 5′ і 3′, функціонально зв'язані з послідовністю за цим винаходом. "Функціонально зв'язаний" означає наявність функціонального зв'язку між промотором і другою послідовністю, в якій послідовність промотору ініціює і опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, що відповідає цій другій послідовності. Загалом, функціональний зв'язок означає, що послідовності зв'язаних нуклеїнових кислот є стичними і, коли необхідно з'єднати кодуючі ділянки двох білків, стичними і в тій самій рамці зчитування. Такі касети можуть додатково містити щонайменше один додатковий ген, який має бути ко-трансформованим в організм. Як варіант, такий додатковий ген (гени) може передбачатись на певній кількості касет експресії. "Промотор" стосується послідовності нуклеїнових кислот, яка функціонує, щоб спрямовувати транскрипцію розміщеної далі кодуючої послідовності. Промотор, разом з іншими транскрипційними і трансляційними регуляторними послідовностями нуклеїнових кислот (які називають також "контрольними послідовностями"), є необхідним для експресії послідовності ДНК, що становить інтерес. Така касета експресії забезпечується великою кількістю рестрикційних сайтів для вставляння послідовності дельта-ендотоксину, яка має знаходитись під транскрипційною регуляцією регуляторних ділянок. Касета експресії буде включати в напрямку транскрипції 5′-3′ ділянку ініціації транскрипції і трансляції (тобто, промотор), послідовність ДНК за цим винаходом і ділянку закінчення транскрипції і трансляції (тобто, ділянку термінації), функціональну в рослинах. Промотор може бути нативним або аналогічним, або чужорідним, або гетерологічним для рослини-хазяїна та/або для послідовності ДНК за цим винаходом. До того ж, промотор може бути природною послідовністю чи, альтернативно, синтетичною послідовністю. Коли промотор є "нативним" або "гомологічним" для рослини-хазяїна, має розумітись, що цей промотор знайдений в нативній рослині, в яку він вводиться. Коли промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" для послідовності ДНК за цим винаходом, має розумітись, що цей промотор не є нативним або таким, що трапляється у природі, промотором для функціонально зв'язаної послідовності ДНК за цим винаходом. 10 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ділянка термінації може бути нативною з ділянкою ініціації транскрипції, може бути нативною з функціонально зв'язаною послідовністю ДНК, що становить інтерес, може бути нативною з рослиною-хазяїном або може бути отриманою з іншого джерела (наприклад, чужорідного або гетерологічного для промотору, послідовності ДНК, що становить інтерес, рослини-хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації можуть бути отримані з Ті-плазміди A. tumefaciens, такі як ділянки термінації октопін синтази і нопалін синтази. Дивись також Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; та Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Коли це доречно, такий ген (гени) можна оптимізувати для підвищеної експресії в трансформованій клітині-хазяїні. Тобто, гени можуть синтезуватись з використанням кращих кодонів клітини-хазяїна для поліпшеної експресії або вони можуть синтезуватись з використанням кодонів з частотою, якій віддає перевагу хазяїн. Загалом, вміст GC гену буде збільшуватись. Дивись, наприклад, Campbell & Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 щодо обговорення використання кодонів, якому віддає перевагу хазяїн. В цій галузі є відомими методи для синтезування генів, яким віддає перевагу рослина. Дивись, наприклад, патенти США №№ 5,380,831 і 5,436,391, а також Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, які включені в цей опис за посиланням. В одному варіанті здійснення дельта-ендотоксин є націленим на хлоропласт для експресії. У такий спосіб, коли дельта-ендотоксин вводиться в хлоропласт непрямо, касета експресії буде додатково містити нуклеїнову кислоту, кодуючу транзитний пептид, щоб спрямовувати дельтаендотоксин до хлоропластів. Такі транзитні пептиди є відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:1754417550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Ген дельта-ендотоксину, щоб бути націленим на хлоропласт, може бути оптимізованим для експресії в хлоропласті, щоб врахувати відмінності у використанні кодонів між рослинним ядром і цією органелою. У такий спосіб нуклеїнові кислоти, що становлять інтерес, можуть бути синтезовані з використанням кодонів, які віддають перевагу хлоропласту. Дивись, наприклад, патент США № 5,380,831, який включено в даний опис за посиланням. Трансформація рослин Способи за цим винаходом передбачають введення нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" розуміється доставка нуклеотидної конструкції до рослини у такий спосіб, щоб ця конструкція отримала доступ до внутрішнього простору клітини даної рослини. Способи за цим винаходом не вимагають використання якогось конкретного методу для введення нуклеотидної конструкції в рослину, а вимагають тільки того, щоб нуклеотидна конструкція отримала доступ до внутрішнього простору щонайменше однієї клітини даної рослини. Методи для введення нуклеотидних конструкцій в рослини є відомими в цій галузі, включаючи, але не обмежуючись ними, методи стабільної трансформації, методи тимчасової трансформації і методи, опосередковані вірусом. Під "рослиною" розуміються цілі рослини, органи рослини (наприклад, листя, стовбури, корінці і т.п.), насіння, рослинні клітини, пагони, зародки і потомство рослин. Рослинні клітини можуть бути диференційованими або недиференційованими (наприклад, калюс, клітини в суспензійній культурі, протопласти, клітини листка, клітини корінця, клітини флоеми, пилок). "Трансгенні рослини", або "трансформовані рослини", або "стабільно трансформовані" рослини, або клітини, або тканини – ці терміни стосуються рослин, в яких є екзогенні послідовності нуклеїнових кислот або фрагменти ДНК, включені або інтегровані в рослинну клітину. Ці послідовності нуклеїнових кислот включають ті, що є екзогенними або не присутніми в нетрансформованій рослинній клітині, а також ті, що можуть бути ендогенними або присутніми в нетрансформованій рослинній клітині. "Гетерологічні" загалом стосується послідовностей нуклеїнових кислот, які не є ендогенними для даної клітини або частини нативного геному, в яких вони є присутніми, а були додані до цієї клітини шляхом інфекції, трансфекції, мікроін'єкції, електропорації, мікропроекції і т.п. Трансформація рослинних клітин може здійснюватись одним з кількох методів, відомих в цій галузі. Ген дельта-ендотоксину за цим винаходом можна модифікувати для досягнення або посилення експресії в рослинних клітинах. Типово, конструкція, яка експресує такий білок, мала б містити промотор, щоб запустити транскрипцію гену, а також не трансльовану ділянку 3′, щоб забезпечити термінацію транскрипції і поліаденілювання. Організація такої конструкції є добре відомою в цій галузі. В певних випадках може бути корисним конструювати цей ген таким, щоб 11 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результуючий пептид секретувався або якось по-іншому проявлявся в рослинній клітині. Наприклад, цей ген можна сконструювати так, щоб він містив сигнальний пептид для перенесення цього пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Можна також сконструювати рослинну касету експресії так, щоб вона містила інтрон і щоб для експресії була необхідною обробка цього інтрону мРНК. Типово, ця "рослинна касета експресії" буде вводитись у "вектор трансформації рослини". Цей вектор трансформації рослини може складатись з одного або більше ДНК векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, загальною практикою в цій галузі є використання векторів трансформації рослини, які складаються з більше ніж одного стичних сегментів ДНК. Такі вектори часто називають в цій галузі "бінарними векторами". Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найчастіше використовуються для опосередкованої Agrobacterium трансформації, коли розмір і складність сегментів ДНК, необхідних для досягнення ефективної трансформації, є достатньо значними, і перевагу дає поділ функцій між окремими молекулами ДНК. Бінарні вектори типово містять плазмідний вектор, який, в свою чергу, містить діючі в cis-положенні послідовності, необхідні для переносу Т-ДНК (такого як лівий край і правий край), селективний маркер, який створюють так, щоб він був здатним до експресії в рослинній клітині, і "ген, що становить інтерес" (ген, який створюють так, щоб він був здатним до експресії в рослинній клітині, з якої бажано створити трансгенні рослини). Присутніми на цьому плазмідному векторі є також послідовності, необхідні для бактеріальної реплікації. Послідовності, діючі в cis-положенні, розміщуються у такий спосіб, щоб забезпечити ефективне перенесення в рослинні клітини і експресію в них. Наприклад, ген селективного маркеру і дельта-ендотоксин розміщуються між лівим і правим краями. Часто другий плазмідний вектор містить фактори, діючі в trans-положенні, які опосередковують перенесення Т-ДНК від Agrobacterium до рослинних клітин. Ця плазміда часто містить функції вірулентності (гени Vir), що робить можливим інфікування рослинних клітин бактерією Agrobacterium і перенесення ДНК шляхом відщеплення по крайових послідовностях і опосередковане vir перенесення ДНК, як має бути зрозумілим спеціалістам в цій галузі (Hellens & Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Для трансформації рослин можуть використовуватись кілька типів штамів Agrobacterium (наприклад, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 і т.д.). Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослин іншими методами, такими як мікропроекція, мікроін'єкція, електропорація, метод з використанням поліетилен гліколю і т.п. Загалом, методи трансформації рослин передбачають перенесення гетерологічної ДНК в намічені рослинні клітини (наприклад, недозрілі або дозрілі зародки, суспензійні культури, недиференційований калюс, протопласти і т.п.) з наступним застосуванням максимального граничного рівня відповідної селекції (залежно від гену селективного маркеру) для виділення трансформованих рослинних клітин з маси нетрансформованих клітин. Експлантати типово переносяться у свіжу порцію того самого середовища і культивуються рутинним способом. Згодом трансформовані клітини диференціюються у ростки після перенесення на середовище для регенерації, доповнене максимальним граничним рівнем селективного агенту. Ростки потім переносять в селективне середовище для укорінення, щоб отримати укорінені ростки або саджанці. Ці трансгенні саджанці потім виростають у зрілу рослину і дають фертильне насіння (дивись, наприклад, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Експлантати типово переносять у свіжу порцію того самого середовища і культивують рутинним способом. Загальний опис методик і методів отримання трансгенних рослин можна знайти у Ayres & Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219239 та Bommineni & Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, в будь-якій порції підданого обробці цільового калюсу, або тканини, або групи клітин присутні як трансформовані, так і нетрансформовані клітини. Здатність вбивати нетрансформовані клітини і забезпечувати трансформованим клітинам можливість проліферації дозволяє отримувати культуру трансформованих клітин. Часто здатність видаляти нетрансформовані клітини є обмеженням для швидкого виділення трансформованих рослинних клітин і успішної генерації трансгенних рослин. Протоколи трансформації, як і протоколи для введення нуклеотидних послідовностей в рослини, можуть змінюватись в залежності від типу рослини або рослинної клітини, тобто однодольні вони або дводольні, наміченої для трансформації. Отримання трансгенних рослин може здійснюватись одним з кількох методів, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроін'єкцію, електропорацію, пряме перенесення гену, введення гетерологічної ДНК бактерією Agrobacterium в рослинні клітини (Agrobacterium-опосередкована трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, нанесеною на частки, 12 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 балістичне прискорення часток, трансформацію під дією струменя аерозолю (опублікована патентна заявка США № 20010026941; патент США № 4,945,050; міжнародна публікація № WO 91/00915; опублікована патентна заявка США № 2002015066), трансформація Lec1 та різні інші методи – прямі і опосередковані, без застосування часток – перенесення ДНК. Методи для трансформації хлоропластів є відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab & Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab & Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Ці методи базуються на використанні генної пушки для доставки ДНК, що містить селективний маркер, і націлюванні цієї ДНК на пластидний геном через гомологічну рекомбінацію. Додатково, трансформація пластиди може здійснюватись шляхом трансактивації мовчазного трансгену, що походить від пластиди, переважною тканинною експресією полімерази ядерної кодованої і пластид-спрямованої РНК. Таку систему було описано в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Після інтеграції гетерологічної чужорідної ДНК в рослинні клітини застосовують максимальний граничний рівень відповідної селекції в середовищі, щоб вбити нетрансформовані клітини та виділити і забезпечити проліферацію припустимо трансформованих клітин, які виживають після такої селекційної обробки, шляхом їх періодичного перенесення у свіже середовище. Такий безперервний пасаж і зараження з відповідною селекцією забезпечують ідентифікацію і проліферацію клітин, які трансформовані плазмідним вектором. Потім можна скористатись молекулярними і біохімічними методами, щоб підтвердити присутність інтегрованого гетерологічного гену, що становить інтерес, в геномі даної трансгенної рослини. Клітини, які було трансформовано, можуть вирощуватись в рослини у відповідності до звичайних методів. Дивись, наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини можуть потім вирощуватись і запилятись тим самим трансформованим штамом або іншими штамами, і отриманий гібрид буде мати конститутивну експресію бажаної фенотипової характеристики, яку було ідентифіковано. Можуть бути вирощені два або більше поколінь, щоб гарантувати, що експресія бажаної фенотипової характеристики стабільно підтримується і унаслідується, після чого збирають насіння, щоб підтвердити, що експресії бажаної фенотипової характеристики досягнуто. У такий спосіб даний винахід забезпечує трансформоване насіння (яке називають також "трансгенним насінням"), що має нуклеотидну конструкцію за цим винаходом, наприклад касету експресії за цим винаходом, стабільно включену в його геном. Оцінка трансформації рослин Після введення гетерологічної чужорідної ДНК в рослинні клітини трансформацію або інтеграцію гетерологічного гену в геном рослини підтверджують різними методами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків і метаболітів, асоційованих з таким інтегрованим геном. Аналіз з використанням ПЛР є швидким методом для скринінгу трансформованих клітин, тканини або ростків на присутність інкорпорованого гену на ранній стадії до пересадки у ґрунт (Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЛР здійснюється із застосуванням олігонуклеотидних праймерів, специфічних для гену, що становить інтерес, або векторного фону Agrobacterium і т.п. Трансформацію рослин можна підтвердити за допомогою саузерн-блотингу геномної ДНК (Sambrook & Russell, 2001, supra). Загалом, молекули ДНК видаляють з трансформанту, обробляють відповідними рестрикційними ферментами, розділяють на невеликі фрагменти в агарозному гелі і переносять на мембрану з нітроцелюлози або нейлону. Цю мембрану або 32 "блот" потім зондують, наприклад міченим радіоактивним P фрагментом цільової ДНК, щоб підтвердити інтеграцію введеного гену в геном рослини у відповідності до стандартних методів (Sambrook & Russell, 2001, supra). У випадку нозерн-блотингу РНК виділяють зі специфічних тканин трансформанту, фракціонують у формальдегідному агарозному гелі і переносять на нейлоновий фільтр у відповідності до стандартних методик, які звичайно використовуються в цій галузі (Sambrook & Russell, 2001, supra). Потім експресію РНК, кодованої дельта-ендотоксином, тестують шляхом гібридизації фільтру до радіоактивного зонду, отриманого з дельта-ендотоксину, методами, відомими в цій галузі (Sambrook & Russell, 2001, supra). Вестерн блотинг, біохімічні аналізи і т.п. можуть здійснюватись на трансгенних рослинах, щоб підтвердити присутність білку, кодованого геном дельта-ендотоксину, стандартними методами (Sambrook & Russell, 2001, supra) з використанням антитіл, які зв'язуються з одним або більше епітопів, наявних на білку дельта-ендотоксину. Інсектицидна активність в рослинах 13 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У відповідності до іншого аспекту цього винаходу, можна створювати трансгенні рослини, що експресують дельта-ендотоксин, який володіє інсектицидною активністю. Описані вище для прикладу методи можуть бути використані для створення трансгенних рослин, але спосіб, у який генеруються клітини трансгенних рослин, не є вирішальним для даного винаходу. На розсуд експериментатора можуть використовуватись методи, відомі або описані в спеціальній літературі, такі як трансформація, опосередкована Agrobacterium, біолістична (біологічна і балістична) трансформація і методи без застосування часточок. Рослини, що експресують дельта-ендотоксин, можуть бути виділені методами, описаними в літературі, наприклад шляхом трансформації калюсу і регенерації фертильних рослин з такого трансгенного калюсу. В такому процесі будь-який ген може використовуватись в якості селективного маркеру, якщо його експресія в рослинних клітинах забезпечує здатність ідентифікувати або відбирати трансформовані клітини. Було розроблено низку маркерів для використання з рослинними клітинами, таких як резистентність до хлорамфеніколу, аміноглікозиду G418, гідроміцину і т.п. Інші гени, які кодують продукт, задіяний в метаболізмі хлоропласту, також можуть бути використані в якості селективних маркерів. Наприклад, гени, які забезпечують резистентність до рослинних гербіцидів, таких як гліфозат, бромоксиніл або імідазолінон, можуть знайти конкретне застосування. Про такі гени вже повідомлялось (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (ген нітрілази, який визначає резистентність до бромоксинілу); та Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (ген резистентності до імідазолінону AHAS). До того ж, гени, про які тут йдеться, використовуються як маркери для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. Методи для визначення присутності трансгену в рослині, органі рослини (наприклад, листі, стовбурах, корінцях і т.п.), насінні, рослинній клітині, паростку, зародку або її потомстві є добре відомими в цій галузі. В одному варіанті здійснення присутність трансгену виявляється шляхом тестування на інсектицидну активність. Фертильні рослини, що експресують дельта-ендотоксин, можуть тестуватись на інсектицидну активність, і рослини, які демонструють оптимальну активність, відбираються для подальшої селекції. В цій галузі існують методи для оцінки інсектицидної активності. Загалом, цей білок змішується і використовується у фідинг-аналізах (тобто таких, які передбачають годівлю). Дивись, наприклад, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Цей винахід може бути використаний для трансформації будь-якого виду рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, однодольні і дводольні рослини. Приклади рослин, що становлять інтерес, включають, не обмежуючись ними, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, соєві боби, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь, олійний рапс, Brassica sp., люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, батат, маніок, каву, кокосовий горіх, ананас, цитрусові, какао, чай, банани, авокадо, фіги, гуаву, манго, оливи, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини і хвойні. Овочі включають, не обмежуючись ними, томати, салат-латук, зелену квасолю, лімську квасолю, горох і представників роду Curcumis, таких як огірок, канталупа і мускусна диня. Декоративні рослини включають, не обмежуючись ними, азалію, гортензію, гібіскус, рози, тюльпани, нарциси, петунії, гвоздику, пуансетію (молочай найкрасивіший) і хризантему. Переважно, рослини за цим винаходом є сільськогосподарськими культурами (наприклад, маїс, сорго, пшениця, соняшник, томат, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, соєві боби, цукровий буряк, цукрова тростина, тютюн, ячмінь, олійний рапс і т.п.). Застосування для контролю комах-шкідників Загальні методи для використання штамів, що містять нуклеотидну послідовність за цим винаходом або її варіант, в контролі комах-шкідників або в створенні інших організмів як інсектицидних агентів є відомими в цій галузі. Дивись, наприклад, патент США № 5,039,523 і EP 0480762A2. Штами Bacillus, що містять нуклеотидну послідовність за цим винаходом або її варіант, або мікроорганізми, які були генетично змінені, щоб містити інсектицидний ген і білок, можуть бути використані для захисту сільськогосподарських культур і продуктів від комах-шкідників. У відповідності до одного аспекту цього винаходу, цільні, тобто не піддані лізису, клітини токсин (інсектицид)-продукуючого організму обробляються реактивами, які пролонгують активність токсину, продукованого в клітині, коли ця клітина опиняється в оточенні шкідника-мішені. Як варіант, інсектицид продукується шляхом введення гену дельта-ендотоксину в клітинухазяїна. Експресія гену дельта-ендотоксину приводить, прямо або непрямо, до внутрішньоклітинної продукції і підтримання інсектициду. У відповідності до одного аспекту цього винаходу, ці клітини потім піддають обробці в умовах, які пролонгують активність токсину, 14 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукованого в клітині, коли ця клітина опиняється в оточенні шкідника-мішені. Результуючий продукт зберігає токсичність цього токсину. Такі природно інкапсульовані інсектициди можуть потім вводитись в різні рецептури у відповідності до звичайних методик застосування в середовищі існування шкідника-мішені, тобто в ґрунті, воді і листі рослин. Дивись, наприклад, публікацію EPA 0192319 і посилання, наведені в ній. Як варіант, клітини, що експресують ген за цим винаходом, можуть вводитись в різні рецептури так, щоб забезпечувалось застосування результуючого матеріалу як інсектициду. Інсектицидні композиції Активні інгредієнти за цим винаходом звичайно застосовуються у формі композицій і можуть вноситись на сільськогосподарські угіддя або наноситись на рослини, які обробляються, одночасно або послідовно з іншими сполуками. Цими сполуками можуть бути добрива, гербіциди, кріопротектори, сурфактанти, детергенти, пестицидні мила, неактивні олії, полімери та/або препарати-носії з уповільненим вивільненням або такі, що піддаються біологічному розкладанню, щоб забезпечити довгострокову дію на оброблену ділянку після єдиного внесення такого препарату. Вони можуть бути також селективними гербіцидами, хімічними інсектицидами, віруцидними засобами, мікробіцидами, амебіцидами, пестицидами, фунгіцидами, бактеріоцидами, нематоцидами, молюскіцидами або сумішами з кількох таких препаратів, якщо це бажано, разом з додатковими, прийнятними з сільськогосподарської точки зору носіями, сурфактантами або ад'ювантами, що полегшують внесення і звичайно використовуються в приготуванні препаратів. Придатні носії і ад'юванти можуть бути твердими або рідкими, і вони відповідають тим речовинам, які звичайно використовуються в технології приготування препаратів, наприклад природним або регенерованим мінеральним речовинам, розчинникам, диспергаторам, агентам для зволоження, агентам для підвищення липкості, зв'язувальним речовинам або добривам. Подібно до цього, препарати можуть готуватись як їстівні "принади" або їм може надаватись форма "пастки" для шкідників, щоб інсектицидний препарат поїдався або попадав всередину шкідника-мішені. Методи нанесення активного інгредієнту за цим винаходом або агрохімічної композиції за цим винаходом, яка містить щонайменше один з інсектицидних білків, продукованих бактеріальними штамами за цим винаходом, включають нанесення на листя, покриття насіння і внесення у ґрунт. Кількість нанесень і частота нанесення залежать від інтенсивності зараження відповідною комахою-шкідником. Композиція може бути приготовлена як порошок, пилоподібний препарат, таблетки, гранули, аерозоль, емульсія, колоїдні частки, розчин і т.п., для чого використовуються такі звичайні методи, як десикація, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрація, центрифугування, седиментація або концентрування культури клітин, що містять потрібний поліпептид. У всіх таких композиціях, що містять щонайменше один такий інсектицидний поліпептид, цей поліпептид може бути присутнім в концентрації від приблизно 1 % до приблизно 99 % за вагою. Знищувати або зменшувати чисельність лускокрилих, твердокрилих та інших шкідників на даній ділянці можна способами за цим винаходом, або композиції за цим винаходом можна профілактично вносити на ділянці, щоб попередити зараження уразливим шкідником. Переважно, така комаха-шкідник поїдає інсектицидно ефективну кількість або контактує з інсектицидно ефективною кількістю поліпептиду. Під "інсектицидно ефективною кількістю" розуміється кількість інсектициду, здатна викликати загибель щонайменше однієї комахишкідника або відчутно зменшити ріст, харчування або нормальний фізіологічний розвиток шкідника. Ця кількість може коливатись в залежності від таких чинників, як, наприклад, конкретні шкідники-мішені, які мають контролюватись, конкретна територія, місцезнаходження, рослина, сільськогосподарська культура або земельна ділянка, яка має оброблятись, умови оточуючого середовища, а також спосіб, частота, концентрація, стабільність і кількість інсектицидно ефективної поліпептидної композиції, що вноситься. Препарати також можуть бути різними в залежності від кліматичних умов, міркувань щодо захисту оточуючого середовища та/або частоти внесення та/або тяжкості зараження комахами-шкідниками. Описані інсектицидні композиції можуть готуватись шляхом сполучення суспензії бактеріальних клітин, кристалів та/або спор або виділеного білкового компоненту з бажаним носієм, прийнятним для застосування у сільському господарстві. Такі композиції можуть готуватись перед введенням у відповідний засіб, такий як ліофілізований, висушений виморожуванням, дегідратований, або у водний носій, середовище або придатний розріджувач, такий як сольовий розчин або інший буфер. Готові композиції можуть мати вигляд пилоподібного або гранульованого матеріалу або суспензії в олії (рослинній або мінеральній) або воді, або емульсії олія / вода, або як порошок, що змочується, або в комбінації з будь-яким іншим матеріалом-носієм, придатним для застосування у сільському господарстві. Придатні для 15 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування у сільському господарстві носії можуть бути твердими або рідкими і є добре відомими в цій галузі. Термін "носій, придатний для застосування у сільському господарстві" охоплює всі ад'юванти, інертні компоненти, диспергатори, підсилювачі липучості, зв'язувальні речовини і т.п., які звичайно використовуються у виробництві інсектицидів; вони є добре відомими спеціалістам в галузі приготування інсектицидних препаратів. Такі препарати можуть змішуватись з одним або більше твердих або рідких ад'ювантів і готуватись різними методами, наприклад змішуванням, гомогенізацією та/або розмелюванням інсектицидної композиції з відповідними ад'ювантами із застосуванням звичайних методик приготування. Придатні препарати і способи внесення описані в патенті США № 6,468,523, який включено в даний опис за посиланням. "Шкідник" включає, не обмежуючись ними, комах, грибів, бактерій, нематод, кліщів, іксодових кліщів і т.п. Шкідливі комахи включають комах, вибраних з рядів Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera etc., особливо Coleoptera, Lepidoptera і Diptera. Ряд Coleoptera включає підряди Adephaga і Polyphaga. Підряд Adephaga включає надродини Caraboidea і Gyrinoidea, тоді як підряд Polyphaga включає надродини Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea і Curculionoidea. Надродина Caraboidea включає родини Cicindelidae, Carabidae і Dytiscidae. Надродина Gyrinoidea включає родину Gyrinidae. Надродина Hydrophiloidea включає родину Hydrophilidae. Надродина Staphylinoidea включає родини Silphidae і Staphylinidae. Надродина Cantharoidea включає родини Cantharidae і Lampyridae. Надродина Cleroidea включає родини Cleridae і Dermestidae. Надродина Elateroidea включає родини Elateridae і Buprestidae. Надродина Cucujoidea включає родину Coccinellidae. Надродина Meloidea включає родину Meloidae. Надродина Tenebrionoidea включає родину Tenebrionidae. Надродина Scarabaeoidea включає родини Passalidae і Scarabaeidae. Надродина Cerambycoidea включає родину Cerambycidae. Надродина Chrysomeloidea включає родину Chrysomelidae. Надродина Curculionoidea включає родини Curculionidae і Scolytidae. Ряд Diptera включає підряди Nematocera, Brachycera і Cyclorrhapha. Підряд Nematocera включає родини Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae і Cecidomyiidae. Підряд Brachycera включає родини Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae і Dolichopodidae. Підряд Cyclorrhapha включає розділи Aschiza і Aschiza. Розділ Aschiza включає родини Phoridae, Syrphidae і Conopidae. Розділ Aschiza включає підрозділи Acalyptratae і Calyptratae. Підрозділ Acalyptratae включає родини Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae і Drosophilidae. Підрозділ Calyptratae включає родини Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae і Sarcophagidae. Ряд Lepidoptera включає родини Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae і Tineidae. Нематоди включають паразитичних нематод, таких як бульбові нематоди, гетеродериди і нематоди, що викликають ураження, включаючи Heterodera spp., Meloidogyne spp. і Globodera spp.; зокрема представників гетеродерид, включаючи, але не обмежуючись ними, Heterodera glycines (нематода соєвих бобів); Heterodera schachtii (бурякова нематода); Heterodera avenae (злакова нематода); а також Globodera rostochiensis і Globodera pailida (картопляні нематоди). Нематоди, що викликають ураження, включають Pratylenchus spp. Комахи-шкідники за цим винаходом для основних сільськогосподарських культур включають: Маїс: Ostrinia nubilalis, метелик кукурудзяний; Agrotis ipsilon, совка іпсилон; Helicoverpa zea, совка бавовникова; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Diatraea grandiosella, вогнівка кукурудзяна південно-західна; Elasmopalpus lignosellus, малий точильник стебел кукурудзи; Diatraea saccharalis, точильник цукрової тростини; Diabrotica virgifera, західний кукурудзяний жук; Diabrotica longicornis barberi, північний кукурудзяний жук; Diabrotica undecimpunctata howardi, південний кукурудзяний жук; Melanotus spp., дротяники; Cyclocephala borealis, північний ряжений хрущ (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, південний ряжений хрущ (личинка хруща); Popillia japonica, хрущик японський; Chaetocnema pulicaria, блішка кукурудзяна; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis, тля кукурудзяна листяна; Anuraphis maidiradicis, тля кукурудзяна корінцева; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Melanoplus femurrubrum, червононогий коник; Melanoplus sanguinipes, кобилка мексиканська; Hylemya platura, личинка мухи росткової; Agromyza parvicornis, кукурудзяна міль пістрява; Anaphothrips obscrurus, трипс 16 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 злаковий; Solenopsis milesta, мураха-злодій; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Сорго: Chilo partellus, сорговий точильник; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Helicoverpa zea, черв'як коробочний; Elasmopalpus lignosellus, малий точильник стебел; Feltia subterranea, зернова совка; Phyllophaga crinita, личинка хруща; Eleodes, Conoderus і Aeolus spp., дротяники; Oulema melanopus, п'явиця червоногруда; Chaetocnema pulicaria, жук-блошка; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis; тля соргова листова; Sipha flava, жовта тля цукрової тростини; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Contarinia sorghicola, галиця соргова; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Пшениця: Pseudaletia unipunctata, черв'як-легіонер; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Elasmopalpus lignosellus, малий точильник стебел; Agrotis orthogonia, совка прямокутна; Elasmopalpus lignosellus, малий точильник стебел; Oulema melanopus, п'явиця червоногруда; Hypera punctata, слоник листяний бобовий; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точкова Говарда; російська пшенична тля; Schizaphis graminum, тля злакова звичайна; Macrosiphum avenae, тля злакова; Melanoplus femurrubrum, червононогий коник; Melanoplus differentialis, кобилка відмінна; Melanoplus sanguinipes, кобилка мексиканська; Mayetiola destructor, гессенська мушка; Sitodiplosis mosellana, галиця злакова; Meromyza americana, личинка американської меромізи; Hylemya coarctata, муха озима; Frankliniella fusca, тютюновий трипс; Cephus cinctus, стебловий пиляльщик хлібний; Aceria tulipae, цибулинний кліщ тюльпанів; Соняшник: Suleima helianthana, листоверка брунькова соняшникова; Homoeosoma electellum, вогнівка соняшникова; zygogramma exclamationis, совка соняшникова оклична; Bothyrus gibbosus, жук морквяний; Neolasioptera murtfeldtiana, галиця соняшникова; Бавовник: Heliothis virescens, бавовникова совка; Helicoverpa zea, черв'як коробочний; Spodoptera exigua, совка мала; Pectinophora gossypiella, черв'як коробочний рожевий; Anthonomus grandis, довгоносик бавовниковий; Aphis gossypii, тля бавовникова; Pseudatomoscelis seriatus, блошка бавовникова; Trialeurodes abutilonea, смугаста білокрилка; Lygus lineolaris, клоп трав'яний; Melanoplus femurrubrum, червононогий коник; Melanoplus differentialis, кобилка відмінна; Thrips tabaci, трипс тютюновий; Franklinkiella fusca, трипс тютюновий; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Рис: Diatraea saccharalis, точильник цукрової тростини; Spodoptera frugiperda, совка трав'яна; Helicoverpa zea, черв'як коробочний; Colaspis brunnea, листоверка виноградна; Lissorhoptrus oryzophilus, довгоносик рисовий водний; Sitophilus oryzae, довгоносик рисовий; Nephotettix nigropictus, рисова цикадка; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Acrosternum hilare, зелений щитник; Соєві боби: Pseudoplusia includens, п'ядениця соєвих бобів; Anticarsia gemmatalis, гусениця оксамитових бобів; Plathypena scabra, зелена гусениця вогнівки; Ostrinia nubilalis, метелик кукурудзяний; Agrotis ipsilon, совка іпсилон; Spodoptera exigua, мала совка; Heliothis virescens, бавовникова совка; Helicoverpa zea, коробочний черв'як; Epilachna varivestis, зернівка бобова мексиканська; Myzus persicae, тля персикова зелена; Empoasca fabae, цикадка картопляна; Acrosternum hilare, тля злакова звичайна; Melanoplus femurrubrum, червононогий коник; Melanoplus differentialis, кобилка відмінна; Hylemya platura, личинка мухи росткової; Sericothrips variabilis, трипси соєвих бобів; Thrips tabaci, трипс тютюновий; Tetranychus turkestani, кліщик павутинний атлантичний; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Ячмінь: Ostrinia nubilalis, метелик кукурудзяний; Agrotis ipsilon, совка-іпсилон; Schizaphis graminum, тля злакова звичайна; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничний північноамериканський; Acrosternum hilare, зелений щитник; Euschistus servus, бурий щитник; Delia platura, личинка мухи росткової; Mayetiola destructor, мушка гессенська; Petrobia latens, кліщик пшеничний; Олійний рапс: Brevicoryne brassicae, тля капустяна; Phyllotreta cruciferae, земляні блошки; Mamestra configurata, черв'як-легіонер Берта; Plutella xylostella, міль капустяна; Delia ssp., безногі личинки корінцеві. Методи підвищення виходу рослинної біомаси Пропонуються методи для підвищення виходу рослин. Ці методи передбачають введення в рослину або рослинну клітину полінуклеотиду, який місить описану тут інсектицидну послідовність. Як визначено тут, "вихід" рослини стосується якості та/або кількості біомаси, продукованої рослиною. Під "біомасою" розуміється будь-який рослинний продукт, що піддається вимірюванню. Зростання виходу біомаси означає зростання виробництва будь-якого рослинного продукту. Збільшення виходу рослинної біомаси має кілька практичних застосувань. Наприклад, збільшення біомаси листя рослини може збільшити врожайність листяних овочів для споживання людиною або тваринами, До того ж, збільшення біомаси листя може використовуватись для збільшення виробництва фармацевтичних і промислових продуктів рослинного походження. Збільшення виходу може означати будь-яке статистично достовірне 17 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зростання, включаючи, але без обмеження, щонайменше 1 % зростання, щонайменше 3 % зростання, щонайменше 5 % зростання, щонайменше 10 % зростання, щонайменше 20 % зростання, щонайменше 30 % зростання, щонайменше 50 % зростання, щонайменше 70 % зростання, щонайменше 100 % або більше зростання виходу у порівнянні з рослиною, яка не експресує інсектицидної послідовності. В конкретних методах вихід рослинної біомаси збільшується як результат поліпшеної стійкості до комах-шкідників рослини, яка експресує описаний тут пестицидний білок. Експресія інсектицидного білку має своїм результатом знижену здатність комахи-шкідника заражати або поїдати рослину, чим поліпшує вихід рослинної біомаси. Наступні приклади пропонуються тільки для ілюстрації і жодним чином для обмеження. Експериментальна частина Приклад 1. Відкриття нового токсигену Axmi115 у Bacillus thuringiensis, штам ATX12983 Повну послідовність цього гену було ідентифіковано з відібраного штаму з використанням підходу MiDAS геноміки наступним чином: - Отримання екстрахромосомної ДНК з цього штаму. Екстрахромосомна ДНК містить суміш певної частини або всього наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; фрагменти геномної ДНК, не відділені за протоколом очистки; інші не охарактеризовані екстрахромосомні молекули. - Механічна або ферментативна фрагментація екстрахромосомної ДНК для отримання невеликих фрагментів з певним розподілом розмірів. - Секвенування фрагментованої ДНК. - Ідентифікація припустимих токсигенів через гомологію та/або інші обчислювальні аналізи. - При необхідності, надання кінцевого вигляду послідовності (прогулянка вздовж послідовності) гену, що становить інтерес, з використанням однієї з кількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, TAIL-PCR). Новий ген тут буде називатись axmi-115 (SEQ ID №: 3), а кодована амінокислота – AXMI-115 (SEQ ID №: 6). Синтетичні нуклеотидні послідовності, кодуючі AXMI-115, наведені в SEQ ID №№: 15 і 16. Характеристики гену і білку Довжина гену, пар основ ДНК: 2409 Довжина білку, амінокислотних залишків: 803 Оцінна молекулярна вага білку, Да: 90877 Відомі гомологи і відповідний відсоток ідентичності: Vip3Af1 – 70,7 % Axmi005 – 70,4 % Axmi026 – 70,4 % Vip3Aa7 – 70,1 % Приклад 2. Новий інсектицидний білок АХМІ-005 від Bacillus thuringiensis, штам ATX13002 Інсектицидний ген АХМІ-005 було ідентифіковано зі штаму АТХ13002 з використанням підходу MiDAS, як описано в патентній публікації США № 20040014091, яку включено в цей опис за посиланням у всій її повноті, із застосуванням наступних етапів: Етапи, здійснені у відповідності до сучасної стратегії, для відкриття гену: Етап 1: Культуру з цього штаму було вирощено у великій кількості. Потім плазмідну ДНК було відділено від хромосомної ДНК з використанням відцентрового градієнту цезію хлориду в ультрацентрифузі. Очищену плазмідну ДНК розпилили до розміру в діапазоні 5-10 кб, потрібного для покриття кодуючої ділянки середнього розміру. Кінці цього фрагменту обтесали, потім впродовж ночі зв'язали лігандами у розрив вектору рестрикційним ферментом, який забезпечив тупі кінці. Етап 3: Після перевірки і підтвердження якості "шотган»-бібліотеки (метод дробовика – отримання випадкової масованої вибірки клонованих фрагментів ДНК даного організму, на основі яких може бути складена його геномна бібліотека), були вирощені, підготовлені і піддані секвенуванню колонії у 96-лунковому форматі. Планшети цієї бібліотеки були піддані операції позбавлення кінців послідовностей від векторного каркасу для цілей початкового скринінгу. Етап 5: Всі зчитування були об'єднані в один збірний проект і зіставлені разом, щоб утворити контиги (безперервні набори клонів, охоплюючих дану ділянку хромосоми або всю хромосому). Ці контиги, разом з будь-яким індивідуальним зчитуванням, яке могло не бути включеним до контигу, аналізувались за допомогою BLAST, з використанням формату "окремими партіями", проти внутрішньої бази даних, складеної зі всіх класів відомих генів дельта-ендотоксинів. Будь-які контиги або індивідуальні зчитування, які підтягували якусь 18 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомологію до відомого гену, аналізувались далі шляхом відбору єдиного клону з бібліотеки, яка охоплювала всю гіпотетичну кодуючу ділянку. Етап 6: Індивідуальний клон, який охоплював ділянку, що становила інтерес, піддавали так званій прогулянці вздовж послідовності, зчитування за зчитуванням, шляхом розробки праймерів для розширення послідовності. Це продовжувалось доти, доки обидва кінцеві зчитування даного клону не з'єднувались і покриття не було щонайменше 2Х. Потім завершений контиг цього єдиного клону аналізувався за допомогою BLAST (як blastn, так і blastx) проти загальнодоступної бази даних щодо всіх відомих інсектицидних генів. Збіги з обох пошуків потім відбирались з внутрішньої бази даних з усіх генів (прищепленими тільки до кодуючої послідовності) і зіставлялись з повною послідовністю клону з бібліотеки для визначення відсотку розходження з відомим геном. З використанням цього підходу були ідентифіковані новий ген, названий тут axmi-005 (SEQ ID №: 1), і закодована амінокислотна послідовність, названа АХМІ-005 (SEQ ID №: 4). Пошук в загальнодоступних базах даних щодо послідовностей, включаючи бази даних GENBANK®, показав, що АХМІ-005 є унікальним білком, що має найвищу гомологію (94,9 %) з інсектицидним білком vip3Aa (GenePept ID L48841). Було створено синтетичну послідовність, кодуючу білок АХМІ-005, і названо optaxmi-005. Відповідну нуклеотидну послідовність наведено в SEQ ID №: 7; вона кодує амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID №: 9 (з додаванням С-термінального гістидинового маркеру). Ген optaxmi-005, описаний тут, може використовуватись як з С-термінальним гістидиновим маркером, так і без нього. Приклад 3. Відкриття нового токсигену Axmi-113 у Bacillus thuringiensis, штам ATX12987 Повну послідовність цього гену було ідентифіковано з вибраного штаму з використанням підходу MiDAS геноміки наступним чином: - Отримання екстрахромосомної ДНК з цього штаму. Екстрахромосомна ДНК містить суміш певної частини або всього з наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; фрагменти геномної ДНК, не відділені за протоколом очистки; інші не охарактеризовані екстрахромосомні молекули. - Механічна або ферментативна фрагментація екстрахромосомної ДНК для отримання невеликих фрагментів з певним розподілом розмірів. - Секвенування фрагментованої ДНК. - Ідентифікація припустимих токсигенів через гомологію та/або інші обчислювальні аналізи. - При необхідності, надання кінцевого вигляду послідовності (прогулянка вздовж послідовності) гену, що становить інтерес, з використанням однієї з кількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, TAIL-PCR). Новий ген тут буде називатись axmi-113 (SEQ ID №: 2), а кодована амінокислота – AXMI-113 (SEQ ID №: 5). Характеристики гену і білку Довжина гену, пар основ ДНК: 2385 Довжина білку, амінокислотних залишків: 795 Оцінна молекулярна вага білку, Да: 89475 Відомі гомологи і відповідний відсоток ідентичності: Vip3Ah-99 % Vip3Aa18 – 79,8 % Axmi005-79 % Було створено синтетичну послідовність, кодуючу білок АХМІ-113, і названо optaxmi-113. Відповідну нуклеотидну послідовність наведено в SEQ ID №: 8; вона кодує амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID №: 5 або 10 (з додаванням С-термінального гістидинового маркеру). Ген optaxmi-113, описаний тут, може використовуватись як з С-термінальним гістидиновим маркером, так і без нього. Приклад 4. Відкриття нових токсигенів Axmi-163 і Axmi-184 у Bacillus thuringiensis, штам ATX14775 Повну послідовність кожного з цих генів було ідентифіковано з вибраного штаму з використанням підходу MiDAS геноміки наступним чином: - Отримання екстрахромосомної ДНК з цього штаму. Екстрахромосомна ДНК містить суміш певної частини або всього з наступного: плазміди різного розміру; фагові хромосоми; фрагменти геномної ДНК, не відділені за протоколом очистки; інші не охарактеризовані екстрахромосомні молекули. - Механічна або ферментативна фрагментація екстрахромосомної ДНК для отримання невеликих фрагментів з певним розподілом розмірів. 19 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - Секвенування фрагментованої ДНК. - Ідентифікація припустимих токсигенів через гомологію та/або інші обчислювальні аналізи. - При необхідності, надання кінцевого вигляду послідовності (прогулянка вздовж послідовності) гену, що становить інтерес, з використанням однієї з кількох стратегій ПЛР або клонування (наприклад, TAIL-PCR). Новий ген був названий тут axmi-163 (SEQ ID №: 11), а кодована амінокислотна послідовність – AXMI-163 (SEQ ID №: 13). Характеристики гену і білку Довжина гену, пар основ ДНК: 2370 Довжина білку, амінокислотних залишків: 790 Оцінна молекулярна вага білку, Да: 88700 Відомі гомологи і приблизний відсоток ідентичності: SEQ ID №: 17 з патенту США № 7,129,212 – 98 % Axmi005-78 % Новий ген, названий тут axmi-184, наведено в SEQ ID №: 12, а кодовану ним амінокислотну послідовність, названу AXMI-184, наведено в SEQ ID №: 14. Синтетичну нуклеотидну послідовність, кодуючу AXMI-184, наведено в SEQ ID №№: 17 і 18. Характеристики гену і білку Довжина гену, пар основ ДНК: 2370 Довжина білку, амінокислотних залишків: 790 Оцінна молекулярна вага білку, Да: 88300 Відомі гомологи і приблизний відсоток ідентичності: Vip3Af1-93 % Axmi005-86 % Приклад 5. Конструювання синтетичних послідовностей У відповідності до одного аспекту даного винаходу, генеруються синтетичні послідовності axmi. Ці синтетичні послідовності мають змінену послідовність ДНК по відношенню до материнської послідовності і кодують білок, що є колінеарним з материнським білком АХМІ, якому він відповідає, але не містить С-термінального "кристалічного домену", наявного в багатьох білках дельта-ендотоксинів. У відповідності до іншого аспекту даного винаходу, створюються модифіковані версії синтетичних генів, з тим щоб результуючий пептид був націленим на рослинну органелу, таку як ендоплазматична сітка або апопласт. Пептидні послідовності, які забезпечують націлювання злитих білків на рослинні органели, є відомими в цій галузі. Наприклад, відомо, що Nтермінальна ділянка гену кислої фосфатази від білого люпину Lupinus albus (Genebank ID GI:14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) забезпечує націлювання ендоплазматичної сітки на гетерологічні білки. Коли результуючий злитий білок також містить ендоплазматичну ретенційну послідовність, що включає пептид N-кінець-лізин-аспарагінова кислота-глютамінова кислота-лейцин (тобто, мотив "KDEL" (SEQ ID №: 19)) на С-кінці, то такий злитий білок буде націленим на ендоплазматичну сітку. Коли злитий білок не містить на С-кінці послідовності, націлюючої на ендоплазматичну сітку, такий білок буде націлюватись на ендоплазматичну сітку, але в кінці кінців буде секвестрований в апопласт. Приклад 6. Експресія в Bacillus В якості прикладу експресії генів і білків за цим винаходом у виду Bacillus, описаний тут інсектицидний ген було піддано ампліфікації з використанням ПЛР, а ПЛР продукт клоновано у вектор експресії Bacillus pAX916 або інший придатний вектор методами, відомими в цій галузі. Результуючий штам Bacillus, який містить цей вектор з геном axmi, культивувався на звичайному живильному середовищі, такому як середовище CYS (10 г/л Бакто-казитону; 3 г/л дріжджового екстракту; 6 г/л KH2PO4; 14 г/л K2HPO4; 0,5 мМ MgSO4; 0,05 мМ MnCl2; 0,05 мМ FeSO4), доки мікроскопічне дослідження не засвідчило утворення спор. Зразки готувались і тестувались на активність в біопробах. Приклад 7. Експресія в E. coli В якості прикладу способу забезпечення експресії генів і білків за цим винаходом в системах на основі E. coli, повну ORF (відкрита рамка зчитування) кожного гену axmi було клоновано у вектор експресії E. coli на основі pRSF1b. Результуючі клони були підтверджені рестрикційним аналізом і, насамкінець, повним секвенуванням клонованого гену. Для експресії в E. coli, BL21*DE3 було трансформовано вектором, що експресує ген axmi. Окремі колонії було перенесено в середовище Лурія-Бертані, доповнене канаміцином, де їх 0 вирощували впродовж ночі при 37 С. Наступного дня свіже середовище засіяли в дублікаті 1 % 0 культурою, що росла впродовж ночі, і дали рости впродовж ночі при 37 С до логарифмічної 20 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 фази. Потім культури індукували 1 мМ ізопропил β-D-1-тіогалактопиранозиду (IPTG) впродовж 3 0 0 годин при 37 С або впродовж ночі при 20 С. Кожний конгломерат клітин суспендували в 50 мМ натрій-карбонатного буферу з рН 10,5, доповненого 1 мМ DTT (дитіотреїтол) і обробили ультразвуком. Зразки готувались і тестувались на активність в біопробах. Приклад 8. Експресія AXMI-115, AXMI-113 і AXMI-005 в E. coli Були створені клони E. coli, що містять сегменти ДНК, які включають повну відкриту рамку зчитування, а також частину ділянки ДНК, що природно знаходиться вище кожного гену і суміжно з ним. Такий сегмент ДНК для кожного з axmi-113 (SEQ ID №: 2), axmi-115 (SEQ ID №: 3) або axmi-005 (SEQ ID №: 1) було піддано ампліфікації і клоновано у вектор pAX916, щоб отримати клони pAX5463, pAX5464 і pAX5465, відповідно. Результуючі клони були підтверджені за допомогою рестрикційного аналізу і повного секвенування клонованих фрагментів. Клітини E. coli були трансформовані з використанням кожного з клонів pAX5463, pAX5464 і pAX5465. Гени axmi005, axmi113 і axmi115, кодони яких були оптимізовані для експресії в кукурудзі і які мали додану на С-кінці мітку his6-tag, також експресувались з вектору експресії E. coli з використанням промотору Т7. До того ж, були створені також конструкції, які експресували Nтермінальні мічені his6-tag або не мічені версії optaxmi005 (pAX5475, pAX5478) і optaxmi115 (pAX5476, pAX5477). Окремі колонії E. coli axmi-115, axmi-113 і axmi-005, що експресують клони, було перенесено 0 в середовище Лурія-Бертані, де їх вирощували впродовж ночі при 37 С. Наступного дня свіже середовище засіяли в дублікаті 1 % культурою, що росла впродовж ночі, і дали рости впродовж 0 ночі при 37 С до логарифмічної фази. Потім культури індукували 1 мМ IPTG впродовж ночі при 0 20 С. Результуючі клітини зібрали центрифугуванням і суспендували в 50 мМ натрійкарбонатного буферу з рН 10,5, доповненого 1 мМ DTT, або в 50 мМ Tris Cl буферу з рН 8, доповненого 1 мМ DTT, перед обробкою ультразвуком. Аналіз за допомогою SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) виявив експресію білку ~90 кД у всіх зразках. Приклад 9. Біопроби експресованих E. coli білків на комахах шкідниках Розчинні екстракти, які містять AXMI-005, AXMI-113 або AXMI-115, було тестовано в пробах на комахах-шкідниках із застосуванням відповідного контролю. В 24-лункові планшети для тканинної культури (Corning) влили по 1 мл багатовидового живильного середовища (Bio-Serv) і дали йому стверднути. Після отвердіння на поверхню середовища в кожній лунці помістили 40 мкл білкового зразка і дали просочитись / висохнути при кімнатній температурі. В залежності від експерименту в кожну лунку додавали яєчну масу або новонароджених личинок. Планшети 0 закрили газопроникними мембранами (Research Products International) та інкубували при 25 С і 90 % відносній вологості. Через п'ять або сім днів (в залежності від експерименту) результат оцінювали візуально, порівнюючи тільки з буфером або з контрольним нетрансформованим екстрактом. Сильна активність екстрактів АХМІ-005 спостерігалась щодо Helicoverpa zea (HZ), Heliothis virescens (HV), совки трав'яної (FAW), совки-іпсилон (BCW), точильника цукрової тростини (SCB) і гусені оксамитових бобів (VBC). AXMI-005 демонстрував активність також щодо вогнівки кукурудзяної південно-західної (SWCB). Сильна активність екстрактів АХМІ-115 спостерігалась щодо Heliothis virescens, совки трав'яної (FAW), совки-іпсилон (BCW) і гусені оксамитових бобів (VBC). AXMI-115 демонстрував активність також щодо метелика кукурудзяного (ЕСВ), SCB, SWCB і молі капустяної (DBM). Активність АХМІ-115 щодо Helicoverpa zea (HZ) була менш вираженою, ніж у відношенні інших тестованих комах-шкідників, але все ще була достовірною. Активність кожного з екстрактів AXMI-005 і AXMI-115 оцінювали в біопробах з присвоєнням балів відносної активності від 1 до 5. Підсумки цих тестів наведені в Таблиці 1. АХМІ-005 демонстрував певну активність щодо SWCB (2 бали) і високу активність щодо Hz, Hv, FAW, BCW і VBC (4-5 балів). АХМІ-115 демонстрував високі рівні активності щодо SWCB (смертність 80 %), ECB, FAW і VBC (4-5 балів) і меншу активність щодо Hz і Hv. AXMI-113 також демонстрував високу активність щодо SWCB (4 бали при 20 % смертності) і SCB. У відношенні інших тестованих комах-шкідників ніякої активності не спостерігалось. 55 21 UA 106968 C2 Таблиця 1 Інсектицидна активність AXMI-115, AXMI-113 і AXMI-005* Hz ECB наживо Axmi115 (pH 10,5) 0 Axmi115 (pH 8) 0 Axmi005 (pH10,5) 4 Axmi005 (pH 8) 4 Axmi113 pH 10,5) 0 2 4 0 0 0 0 0 4 4 /5 0 4 0 4 4; 80 % смертність 2 0 3 3; 50 % смертність 3; 25 % смертність 2/3 4/5 3/4 4 4/5 4 4/5 0 0 0 4; 20 % смертність 3; 50 % смертність 0 Hv FAW BCW VBC SWCB SCB ND DBM ND 2 ND 0 ND 4; 100 % смертність 0 * = представлені як відсоток затримки в рості і смертності при оцінці затримки в рості за наступною шкалою: 5 Бал 0 1 2 3 4 5 10 15 20 25 30 Визначення Відсутність активності Незначна, нерівномірна затримка в рості Нерівномірна затримка в рості Рівномірна затримка в рості Рівномірна затримка в рості зі смертністю (вираженою як відсоток) Рівномірна затримка в рості зі 100 % смертністю Приклад 10. Біопроба Axmi184 Експресія і очистка гену - Ділянку ДНК, кодуючу домен токсину Axmi184, було клоновано у вектор експресії E. coli pMAL-C4x після гену malE, кодуючого білок зв'язування мальтози (МВР). Ці злиття в межах рамки забезпечили експресію злитого білку MBP-Axmi184 у E. coli. - Для експресії у E. coli BL21*DE3 було трансформовано індивідуальними плазмідами. Єдину колонію було перенесено в живильне середовище Лурія-Бертані, доповнене карбеніциліном і глюкозою, де її вирощували впродовж ночі при 370С. Наступного дня свіже середовище засіяли 1 % культурою, що росла впродовж ночі, і дали рости впродовж ночі при 370С до логарифмічної фази. Потім культури індукували 0,3 мМ IPTG впродовж ночі при 200С. Кожний конгломерат клітин суспендували в 20 мМ буферу Tris-Cl, рН 7,4+200 мМ NaCl+1 мМ DTT + інгібітори протеази і обробили ультразвуком. Аналіз за допомогою SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) виявив експресію злитих білків. - Вільні від клітин екстракти проганяли через амілазну колонку, приєднану до FPLC (установка для рідинної експрес-хроматографії білків), для афінної очистки злитих білків MBPАХМІ184. Зв'язаний злитий білок вимили з полімерного носія 10-мМ розчином мальтози. Потім очищені злиті білки розщепляли фактором Ха або трипсином для видалення N-термінального маркеру МВР з білку АХМІ184. Розщеплення і розчинність цих білків визначались за допомогою SDS-PAGE. - Розщеплені білки тестували в пробах на комахах-шкідниках із застосуванням відповідного контролю. 5-денне зчитування показало наступну активність АХМІ-184 проти молі капустяної. Приклад 11. Обмін доменами В цьому прикладі були використані гени axmi005, axmi113 і axmi115 та їх кодони, оптимізовані для експресії в кукурудзі. Плазміди, експресуючі немічені версії optaxmi005 22 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 (pAX5478), optaxmi113 (pAX5493) і optaxmi115 (pAX5477), були використані для створення замісних конструкцій ДНК, як тут описано. AXMI-005, AXMI-113 і AXMI-115 мають значну ідентичність/подібність послідовностей в своїй тій тя N-термінальній 2/3 ділянці. 1/3 ділянка, що залишається, на своїх С-кінцях (СТ) демонструє суттєве розходження послідовностей, як видно з зіставлення послідовностей білків на Фіг. 1А і 1В. Ділянку білку АХМІ-113 між стрілками, спрямованими вперед і назад, на Фіг. 1 було замінено відповідним фрагментом AXMI-005 (щоб отримати pAX5492) або AXMI-115 (pAX5494). Для експресії у E. coli BL21*DE3 було трансформовано індивідуальними конструкціями. Єдину колонію було перенесено в живильне середовище Лурія-Бертані, доповнене 0 канаміцином, де її вирощували впродовж ночі при 37 С. Наступного дня свіже середовище засіяли в дублікаті 1 % культурою, що росла впродовж ночі, і дали рости впродовж ночі при 0 0 37 С до логарифмічної фази. Потім культури індукували 1 мМ IPTG впродовж ночі при 20 С. Конгломерат клітин суспендували в 50 мМ натрій-карбонатного буферу, рН 10,5+1 мМ DTT і обробили ультразвуком. Аналіз за допомогою SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) виявив дуже гарну розчинну експресію всіх білків. Після стерилізації фільтрацією розчинні екстракти, експресуючі OptAxmi005, 113, 115, Optaxmi113+CT Optaxmi005 і Optaxmi113+CT Optaxmi115, були тестовані в біопробах на комахах-шкідниках із застосуванням відповідного контролю. Як показано у Прикладі 9, АХМІ-113 демонстрував високу активність проти SWCB, Hz, Hv, FAW, BCW і VBC. Він демонстрував додаткову активність проти SCB (смертність 25 %). АХМІ-115 також виявив певну активність проти SCB. Злиття AXMI-113+CT AXMI-005 забезпечувало весь спектр активності проти комахшкідників, який спостерігався для АХМІ-005. Іншими словами, заміна С-термінального фрагменту АХМІ-113 таким фрагментом АХМІ-005 надала йому активності, якої до цього бракувало його природній формі. Додаткові білкові послідовності токсинів можна отримувати, переставляючи домени з одного білку в інший. Наприклад, один або більше доменів АХМІ-005, показаних на Фіг. 2, вводяться в АХМІ-115. Ці домени вводяться з використанням смислових ("s") і антисмислових ("a") олігонуклеотидів, наведених в Таблиці 2. Частину послідовності axmi-005, яка вводиться в послідовність axmi-115, виділено жирним шрифтом. Фланкуючими послідовностями в кожному олігонуклеотиді є послідовності axmi-115, які використовувались для відпалу цих олігонуклеотидів до матриці axmi-115. Цифра після "sub" в назві кожного праймеру відповідає пронумерованим боксам на Фіг. 2. Подібні олігонуклеотиди можна створити для обміну доменами між певною кількістю послідовностей, наприклад між описаними тут послідовностями AXMI-005, AXMI-113, AXMI-115, AXMI-163 і AXMI-184. Таблиця 2 Олігонуклеотидний праймер axmi115sub1 s axmi115sub1 a axmi115sub10 s axmi115sub10 a axmi115sub11 s axmi115sub11 a axmi115sub12 s axmi115sub12 a axmi115sub14 s Послідовність AAC ACC GGC GGC GTC AAT GGA ACA AGG GCG CTC TTC ACC CA TGG GTG AAG AGC GCC CTT GTT CCA TTG ACG CCG CCG GTG TT GCC CGG AGC TCA TCA ATG TCA ACA ACT GGA TCA GAA CTG GCA CCA CCT ACA TCA C GTG ATG TAG GTG GTG CCA GTT CTG ATC CAG TTG TTG ACA TTG ATG AGC TCC GGG C ATG ATT GGG AGA GGT TCG GAA GCA CCC ACA TCA GCG GCA ATG AGC TGA GG CCT CAG CTC ATT GCC GCT GAT GTG GGT GCT TCC GAA CCT CTC CCA ATC AT CTA CAT CAC CGG CAA TAC CTT GAC GCT CTA CCA AGG AGG AGG AGG CTA CTT CCG C GCG GAA GTA GCC TCC TCC TCC TTG GTA GAG CGT CAA GGT ATT GCC GGT GAT GTA G CGA CAG CTA CAG CAC CTA CAG GGT GAA CTT CTC CGT CAC CGG CTG GGC CAA GGT GAT 23 SEQ ID №: 20 21 22 23 24 25 26 27 28 UA 106968 C2 Продовження таблиці 2 Олігонуклеотидний праймер axmi115sub14 a axmi115sub15 s axmi115sub15 a axmi115sub16 s axmi115sub16 a axmi115sub17 s axmi115sub17 a axmi115sub19 s axmi115sub19 a axmi115sub2 s axmi115sub2 a axmi115sub20 s axmi115sub20 a axmi115sub21 s axmi115sub21 a axmi115sub3 s axmi115sub3 a axmi115sub5 s axmi115sub5 a axmi115sub6 s axmi115sub6 a axmi115sub7 s axmi115sub7 a axmi115sub9 s axmi115sub9 a axmi115sub13 s Послідовність ATC ACC TTG GCC CAG CCG GTG ACG GAG AAG TTC ACC CTG TAG GTG CTG TAG CTG TCG GCT TCA GCG GCC TCG ACG CCA ATG TGA GGA TCA GAA ACA GCC GCG GC GCC GCG GCT GTT TCT GAT CCT CAC ATT GGC GTC GAG GCC GCT GAA GC GTG AAG AAC AGC CGC GAG GTG CTC TTC GAG AAG AGA TAC ATG AAT GGA AGC AGC TAT GA TCA TAG CTG CTT CCA TTC ATG TAT CTC TTC TCG AAG AGC ACC TCG CGG CTG TTC TTC AC TTC GAG AAG GTG AAG AAC AGC GGC GCC AAG GAT GTT TCA GAG AGC TTC ACC ACC GGT GGT GAA GCT CTC TGA AAC ATC CTT GGC GCC GCT GTT CTT CAC CTT CTC GAA GCT TCT TCA TCG AGC TCA GCC AAG GCA ACA ACC TCT ATA GCA GCA CCT TCC AC GTG GAA GGT GCT GCT ATA GAG GTT GTT GCC TTG GCT GAG CTC GAT GAA GAA GC GAA GCA AGG CGC TCT ATG TTC ACA AGG ATG GAG GCT TCA GCC AGT TCA TCG CGA TGA ACT GGC TGA AGC CTC CAT CCT TGT GAA CAT AGA GCG CCT TGC TTC CCG CCG AGA GGA CAG GAG GGC CGC TGG TGA AGT TCA GAG ACA TCA GCA TC GAT GCT GAT GTC TCT GAA CTT CAC CAG CGG CCC TCC TGT CCT CTC GGC GG AGC ACC TTC CAC AGC TTC AAT GAT GTG AGC ATC AAG TAA GGC GCG CCG CGG CGC GCC TTA CTT GAT GCT CAC ATC ATT GAA GCT GTG GAA GGT GCT CGA CAA GCT AAA GCC CAA GAC AGA ATA TGT CAT CCA GTA CAC CGT CAA G CTT GAC GGT GTA CTG GAT GAC ATA TTC TGT CTT GGG CTT TAG CTT GTC G CCT ACG AGG ACA CCA ATA ACA ACA ACC TGG AGG ACT ACC AAA CAA TTG CTG TGA AG CTT CAC AGC AAT TGT TTG GTA GTC CTC CAG GTT GTT GTT ATT GGT GTC CTC GTA GG GAG GAG TTC CAA ACA ATT ACC AAG AGG TTC ACC ACC GGC ACA GAT TTG AGC CAG ACC GGT CTG GCT CAA ATC TGT GCC GGT GGT GAA CCT CTT GGT AAT TGT TTG GAA CTC CTC CAC CTC AGA AAC AGA TTT GAA GGG CGT CTA CCT CAT CTT GAA GAG CCA AAA TGG ATA T ATA TCC ATT TTG GCT CTT CAA GAT GAG GTA GAC GCC CTT CAA ATC TGT TTC TGA GGT G TCC TGG AGG CCA AGC CAT CAG AGA AGC TGC TCA GCC CGG AGC TCA TGA GCT CCG GGC TGA GCA GCT TCT CTG ATG GCT TGG CCT CCA GGA ATC ATT CAA GAG GAG GCA ACC TCA AGC AGA ACC TCC AGC TTG ACA GCT TCA GCA CCT ACG ACC TCA G 24 SEQ ID №: 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 UA 106968 C2 Продовження таблиці 2 Олігонуклеотидний праймер axmi115sub13 a axmi115sub18 s axmi115sub18 a axmi115sub4 s axmi115sub4 a axmi115sub8 s axmi115sub8 a 5 10 15 20 25 30 35 Послідовність CTG AGG TCG TAG GTG CTG AAG CTG TCA AGC TGG AGG TTC TGC TTG AGG TTG CCT CCT CTT GAA TGA T GCT ATG AGG ACA TCT CAG AGA TCT TCA CCA CCA AGC TGG GCA AGG ACA ACT TC TAC A TCG AGC TCA CCG C GCG GTG AGC TCG AT GTA G AAG TTG TCC TTG CCC AGC TTG GTG GTG AAG ATC TCT GAG ATG TCC TCA TAG C CAA GGG CAA GCC GTC AAT CCA CCT CAA GAA TGA GAA CAC CGG CTA CAT CCA CTAC GA GGA CAC CAA TGG CCA TTG GTG TCC TCG TAG TGG ATG TAG CCG GTG TTC TCA TTC TTG AGG TGG ATT GAC GGC TTG CCC TTG CAA GAG CCA AAA TGG AGA TGA AGC ATG GGG AGA CAA CTT CAC CAT CCT GGA GAT CTC GCT CTT CGA GAC ACC AGA A TTC TGG TGT CTC GAA GAG CGA GAT CTC CAG GAT GGT GAA GTT GTC TCC CCA TGC TTC ATC TCC ATT TTG GCT CTT G SEQ ID №: 55 56 57 58 59 60 61 Приклад 12. Додаткові проби на пестицидну активність Здатність інсектицидного білку діяти як пестицид на шкідника часто оцінюється низкою способів. Один з них, добре відомий в цій галузі, полягає у виконанні фідинг-аналізу (аналізу з годівлею). В такому фідинг-аналізі шкідника піддають дії зразка, що містить тестові сполуки, або дії контрольного зразка. Часто це здійснюється шляхом нанесення матеріалу, що тестується, або відповідного розведення такого матеріалу на матеріал, який шкідник буде поїдати, такий як штучний корм. Матеріал, що тестується, може бути рідким, твердим або суспензією. Матеріал, що тестується, може наноситись на поверхню, після чого йому дають висохнути, або його вводять в корм. Як варіант, матеріал, що тестується, може змішуватись з розплавленим штучним кормом, а потім поміщатись в камеру, в якій проводиться проба. Такою камерою може бути склянка, чашка або лунка титраційного мікропланшету. Проби для сисних шкідників (наприклад, тлі) можуть передбачати виділення тестового матеріалу з комахи шляхом дифузійного розділення. Ідеально, щоб матеріал могли проколоти призначені для ссання елементи рота сисної комахи, щоб дозволити поїдання тестового матеріалу. Часто тестовий матеріал змішується з таким харчовим стимулятором, як сахароза, щоб забезпечити поїдання тестової сполуки. Інші типи аналізу можуть включати мікроін'єкцію тестового матеріалу в рот або шлунок шкідника, а також створення трансгенних рослин з наступним тестуванням на здатність шкідника кормитись на трансгенній рослині. Тестування рослини може передбачати виділення тих частин рослини, які звичайно поїдаються, наприклад невеличкі кліточки можуть прикріплятись до листка або вся рослина (рослини) може поміщатись в клітку з комахами. Інші методи і підходи до аналізу пестицидної активності є відомими в цій галузі, і їх можна знайти в книзі Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Raton, FL. Як варіант, такі аналізи звичайно описуються в журналах "Arthropod Management Tests" і "Journal of Economic Entomology" або обговорюються з членами Ентомологічного товариства Америки (ESA). Приклад 13. Спрямування інсектицидних генів за цим винаходом для експресії в рослинах Кожна з кодуючих ділянок генів за цим винаходом незалежно з'єднується з відповідними промоторною і термінаторною послідовностями для експресії в рослинах. Такі послідовності є добре відомими в цій галузі і можуть включати рисовий актиновий промотор або маїсовий убіквітиновий промотор для експресії в однодольних рослинах, промотор Arabidopsis UBQ3 або промотор CaMV 35S для експресії в дводольних рослинах і термінатори nos або PinII. Методи для отримання і підтвердження конструкцій промотор-ген-термінатор також є добре відомими в цій галузі. Приклад 14. Трансформація генів за цим винаходом в рослинних клітинах, опосередкована Agrobacterium 25 UA 106968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Суцвіття збирають через 8-12 днів після запилення. Від них відділяють зародки і ті з них, які мають розмір 0,8-1,5 мм, використовуються для трансформації. Зародки поміщають щитком догори на відповідне інкубаційне середовище і інкубують впродовж ночі при 25°С у темноті. Однак немає необхідності per se інкубувати зародки впродовж ночі. Зародки контактують зі штамом Agrobacterium, що містить відповідні вектори для опосередкованого Ті плазмідою перенесення, впродовж 5-10 хвилин, після чого їх переносять на середовище для ко-культивації на 3 дні (25°С у темноті). Після ко-культивації експлантати переносять в середовище для періоду відновлення на п'ять днів (25°С у темноті). Експлантати інкубують в селективному середовищі до восьми тижнів – в залежності від природи і параметрів того конкретного відбору, який використовується. Після періоду відбору результуючий калюс переносять в середовище для дозрівання зародку, доки буде спостерігатись формування зрілих соматичних зародків. Після цього зрілі соматичні зародки встановлюють під слабке освітлення, і процес регенерації починається, як відомо в цій галузі. Результуючим росткам дають укорінитись на середовищі для укорінення і переносять отримані рослини в тепличні горщечки, де вони розводяться як трансгенні рослини. Приклад 15. Трансформація клітин маїсу під дією інсектицидних генів за цим винаходом Суцвіття маїсу збирають через 8-12 днів після запилення. Від них відділяють зародки і ті з них, які мають розмір 0,8-1,5 мм, використовуються для трансформації. Ембріони поміщають щитком догори на відповідне інкубаційне середовище, таке як середовище DN62A5S (3,98 г/л N6 солей; 1 мл/л (1000x вихідний матеріал) N6 вітамінів; 800 мг/л L-аспарагіну; 100 мг/л міоінозитолу; 1,4 г/л L-проліну; 100 мг/л казамінових кислот; 50 г/л сахарози; 1 мл/л (1 мг/мл вихідний матеріал) 2,4-D), і інкубують впродовж ночі при 25°С у темноті. Результуючі експлантати переносять в коміркові квадрати (30-40 на планшет), пересаджують на осмотичне середовище на 30-45 хвилин, а потім переносять на снувальний планшет (дивись, наприклад, публікацію РСТ № WO/0138514 і патент США № 5,240,842). Конструкції ДНК, призначені для того, щоб експресувати гени за цим винаходом в рослинних клітинах, активували в рослинній тканині з використанням прискорювача струменю аерозолю і умов, суттєво таких, як описані в публікації РСТ № WO/0138514. Після активування зародки інкубують впродовж 30 хвилин на осмотичному середовищі, потім переносять на інкубаційне середовище і інкубують впродовж ночі при 25°С в темноті. Щоб уникнути невиправданого ушкодження активованих експлантатів, їх інкубують щонайменше 24 години перед перенесенням в відновлювальне середовище. Потім зародки розміщують на середовищі для відновного періоду на 5 днів при 25°С в темноті, після чого переносять в селекційне середовище. Експлантати інкубують в селективному середовищі до восьми тижнів – в залежності від природи і параметрів того конкретного відбору, який використовується. Після періоду відбору результуючий калюс переносять в середовище для дозрівання зародків, доки буде спостерігатись формування зрілих соматичних зародків. Після цього зрілі соматичні зародки встановлюють під слабке освітленням, і процес регенерації починається, як відомо в цій галузі. Результуючим росткам дають укорінитись на середовищі для укорінення і переносять отримані рослини в тепличні горщечки, де вони розводяться як трансгенні рослини. Матеріали Середовище DN62A5S Компоненти На один літр Chu'S N6 Базальна суміш 3,98 г/л солей (Прод. № C 416) Chu's N6 Розчин вітамінів 1 мл/л (1000x вихідний матеріал) (Прод. № C 149) L-аспарагін 800 мг/л Міо-ізітол 100 мг/л L-пролін 1.4 г/л Касамінокислоти 100 мг/л Сахароза 50 г/л 2,4-D (Прод. № D-7299) 1 мл/л (1 мг/мл вихідний матеріал) 45 Джерело Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Phytotechnology Labs Sigma Phytotechnology Labs Fisher Scientific Phytotechnology Labs Sigma Далі, рН розчину регулюють до 5,8 з використанням 1N KOH/1N KCl, додають Gelrite (Sigma) 0 до 3 г/л і піддають обробці в автоклаві. Після охолодження до 50 С додають 2 мл/л основного розчину нітрату срібла з концентрацією 5 мг/мл (Phytotechnology Labs). Описана рецептура розрахована приблизно на 20 планшетів. 26 UA 106968 C2 5 Всі публікації і патентні заявки, згадані в цьому описі, визначають рівень знань спеціалістів у галузі, якої стосується даний винахід. Всі ці публікації і патентні заявки є включеними в цей опис за посиланням в тій самій мірі, в якій кожна окрема публікація або патентна заявка були специфічно і індивідуально зазначені як включені за посиланням. Хоча викладений тут винахід було певною мірою докладно описано шляхом ілюстрації і прикладів для цілей кращого розуміння, має бути зрозумілим, що він допускає певні зміни і модифікації при реалізації в межах об'єму формули винаходу, що додається. 27 UA 106968 C2 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюAxmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 and axmi-184: insecticidal proteins and methods for their use
Автори англійськоюSampson, Kimberly, S., Agarwal, Shruti, Campbell, Chris, Mcnulty, Brian, Tomso, Daniel, J., Carozzi, Nadine, Hargiss, Tracy, Koziel, Michael, G., Duck, Nicholas, B., Heinrichs, Volker
Автори російськоюДак Николас Б.
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82, C07K 14/325
Мітки: axmi-115, застосування, інсектицидний, білок, спосіб
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/63-106968-insekticidnijj-bilok-axmi-115-ta-sposib-jjogo-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Інсектицидний білок axmi-115 та спосіб його застосування</a>
Фрагмент днк, який має нуклеотидну послідовність, що кодує вегетативний інсектицидний білок, експресійна касета, векторна молекула, штам agrobacterium (варіанти), штам bacillus, вегетативний інсектицидний білок
Номер патенту: 52579
Опубліковано: 15.01.2003
Автори: Костічка Н. Крісті, Маллінз Марта А., Уоррен Грегорі У., Карр Брайєн, Ньє Гордон Дж., Дасай Наліні, Козіел Майкл Г.
МПК: C12N 1/21, C07K 14/415, A01H 5/00, C12N 15/82, C12P 21/08, C12N 5/10, C07K 14/32, C12N 15/09, A01N 63/00, C07K 14/325, C12P 21/02, C12N 15/31
Мітки: векторна, касета, agrobacterium, експресійна, днк, вегетативний, варіанти, молекула, білок, штам, нуклеотидну, має, інсектицидний, фрагмент, кодує, bacillus, послідовність
Формула / Реферат:
1. Фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую вегетативный инсектицидный белок или аналог, или активный фрагмент такого белка, характеризующийся тем, что он гомологичный молекуле ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1или SEQ ID NO:9GAAATTGATC AAGATACNGA Т,или SEQ ID NO: 17,или SEQ ID NO:18.2. Фрагмент ДНК по п. 1,...
Спосіб модифікації фрагмента днк, що кодує інсектицидний білок bacillus thuringiensis, фрагмент днк, що кодує інсектицидний білок bacillus thuringiensis (варіанти), фрагмент днк, що кодує повнорозмірний інсекти
Номер патенту: 27289
Опубліковано: 15.09.2000
Автори: Фішофф Девід Еллен, Перлак Фредерік Джозеф
МПК: C12N 15/82, C12N 15/09, A01H 5/10, C12N 5/10, C12N 15/40, C07K 14/415, A01H 5/00, C07K 14/325, C12N 15/32, C12N 15/67, C07K 14/08
Мітки: варіанти, фрагмента, білок, модифікації, bacillus, кодує, фрагмент, thuringiensis, інсекти, днк, повнорозмірний, інсектицидний, спосіб
Текст:
...от аналогичного сегмента дикого типа и гена HD–73. Делению одной пары нуклеотидов обнаружили в синтетическом HD–73 гене в процессе секвенирования 3' конца в нуклеотидной паре 1890. Это приводит к мутации сдвига рамки начиная с аминокислоты 625 с преждевременным стоп кодоном в аминокислоте 640 (pMON5379). Таблица 7 внизу сравнивает встречаемость кодонов гена B.t.k. HD–73 дикого типа против синтетического гена этого примера по аминокислотам...
Нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок
Номер патенту: 96421
Опубліковано: 10.11.2011
Автори: Богданова Наталья Н., Робертс Джеймс К., Романо Чарльз П., Корбін Девід Р., Перлак Фредерік Дж., Малвар Томас Р.
МПК: A01H 5/00, B01F 3/18, C12N 15/82, B01F 3/08
Мітки: кодує, послідовність, інсектицидний, нуклеотидна, білок
Формула / Реферат:
1. Синтезований полінуклеотид, що кодує інсектицидний білок, який включає амінокислоти 10-600 послідовності SEQ ID NO: 2.2. Синтезований полінуклеотид за п. 1, вибраний з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 3.3. Синтезований полінуклеотид за п. 2 для експресії відповідного інсектицидного білка в сільськогосподарських культурах.4. Синтезований полінуклеотид за п. 3, де...
Ген, що кодує інсектицидний білок cry1c
Номер патенту: 98108
Опубліковано: 25.04.2012
Автори: Ван Рі Ерун, ван Елдік Гербен, Мелеватер Франк
МПК: C07K 14/325, C12N 15/82
Мітки: cry1c, кодує, інсектицидний, білок, ген
Формула / Реферат:
1. ДНК, яка містить химерний ген, що містить наступні функціонально-зв'язані послідовності:a) кодуючу ділянку, що кодує Сrу1С білок, яка містить ДНК будь-якої з послідовностей SEQ ID NО: 1, 3, 4 або 6, іb) ділянку промотору, здатного спрямовувати експресію у рослинних клітинах.2. ДНК за п. 1, яка відрізняється тим, що промотор містить послідовність SEQ ID NО: 18 або 19.3. ДНК за п. 1 або 2, яка відрізняється тим,...
Cd154-зв’язувальний білок та його застосування
Номер патенту: 100513
Опубліковано: 10.01.2013
Автори: Адамс Ральф, Берклі Лінда К., Браун Дерек Томас, Тайсон Керрі Луіза, Хсу Єн-мін, Шок Ентоні, Гарбер Еллєн А., Попплвелл Ендрю Джордж, Су Ліхе, Тейлор Фредерік Р., Ферран-Оржетта Жанін Л., Робінсон Мартін Кім
МПК: C12P 21/08, C07K 16/28, A61P 37/00, C12N 15/13, A61K 39/395
Мітки: білок, застосування, cd154-зв'язувальний
Формула / Реферат:
1. CD154-зв’язувальний білок, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга, згідно зSEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5, відповідно;і, що містить послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга, згідно зSEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 і SEQ ID NO:8, відповідно.2. CD154-зв’язувальний білок за п. 1, де зв’язувальний білок являє собою анти-CD154-антитіло або його антигензв’язувальний фрагмент.3....
Попередній патент: Протипухлинні аналоги пептидів, фармацевтична композиція, спосіб одержання сполук та проміжні сполуки
Наступний патент: Спосіб сухого гасіння коксу (варіанти)
Випадковий патент: Заміщені сполуки піразолу